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Medicine

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come CD133

Abstract

Nonostante il miglioramento delle opzioni di trattamento per il melanoma oggi disponibili, pazienti con melanoma maligno ancora hanno una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza libera da progressione e globale. Pertanto, la ricerca traslazionale ha bisogno di fornire altre prove per migliorare le terapie molecolari mirate per i melanomi maligni. In passato, i meccanismi oncogenici correlate a melanoma sono stati ampiamente studiati in linee cellulari stabilizzate. Sulla strada per regimi di trattamento più personalizzati basati su profili genetici individuali, si propone di utilizzare paziente linee cellulari derivate invece di linee cellulari generici. Insieme con i dati clinici di elevata qualità, in particolare sul follow-up, queste cellule sarà determinante per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della progressione del melanoma.

Qui, si segnala l'istituzione di colture primarie di melanoma sezionato tessuto tumorale fresco. Questa procedura include macinazione e la dissociazione del tessuto in cellule singole, rerimozione di contaminazioni con eritrociti e fibroblasti così come la cultura primaria e affidabile verifica di origine melanoma delle cellule.

Recenti studi hanno rivelato che i melanomi, come la maggior parte dei tumori, porto una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che sembrano alimentare esclusivamente l'iniziazione del tumore e la progressione verso lo stato metastatico. Uno degli indicatori chiave per l'identificazione e l'isolamento CSC nel melanoma è CD133. Per isolare CD133 + CSC da colture primarie di melanoma, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) procedura dal Miltenyi con conseguente elevata purezza smistamento e la vitalità delle CD133 + e CD133 CSC - massa, che può essere coltivato e funzionalmente analizzati successivamente.

Introduction

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Cutanee melanomi maligni sono il tipo meno comune, ma più mortale di cancro della pelle. A causa di un aumento dei casi, un alto grado di malignità e di una rapida diffusione, melanomi ora rappresentano il 75% dei tumori maligni della pelle correlate 1,2 morti. Oltre l'asportazione chirurgica del tumore primitivo, chemioterapia, radioterapia, immunoterapia e combinati chemio-immunoterapia del melanoma e metastasi sono state-of-the-art di strategie per il trattamento del melanoma 3,4. Tuttavia, il melanoma maligno è caratterizzato da una scarsa risposta a chemioterapici (5-12%), 5,6, e solo quelli il 50-70% dei pazienti affetti da melanoma che trasportano il gene BRAF V600E beneficio mutazione da promettenti nuove terapie mirate, come il trattamento con vemurafenib 7 Per migliorare la sopravvivenza complessiva, una migliore comprensione dei meccanismi di tumorigenesi melanoma è necessario.

Per studiare questi meccanismi in passato, consolidata commerlinee cellulari cialmente disponibili sono stati utilizzati. Approcci più recenti per studiare gli eventi molecolari di iniziazione e la progressione del cancro utilizzare colture primarie derivate direttamente dal tessuto tumorale - un cuscinetto molteplici vantaggi strategici: Il ricercatore ha il pieno controllo del paziente e selezione dei tessuti. Le cellule campionate acquisita sapientemente selezionato tessuto tumorale, assomigliano il tumore con tutta la sua eterogeneità e follow-up dei dati del paziente e un dettagliato patologia è disponibile per consentire le caratteristiche della cultura per essere confrontati con quelli del tumore originale 8.

Al contrario, l'utilizzo di linee cellulari stabilizzate come sistemi modello nella ricerca sul cancro è discusso polemicamente. Già nel 1987 Osborne e colleghi hanno descritto significative differenze biologiche tra MCF-7 linee di cellule di cancro al seno umano da diversi laboratori 9. Questa instabilità genomica ampia variazione e l'espressione di RNA durante sottocultura era confirmed da Hiorns et al. e ha fornito i dati di supporto per le prove del fatto che le linee di cellule si evolvono nella cultura, indebolendo in tal modo la rilevanza diretta delle culture così stabiliti come modelli di cancro umano 10.

Un'altra considerazione importante, che è stata largamente ignorata nel corso degli anni, è il rischio di contaminazione o di crescita eccessiva di culture con estranei "falsi" delle cellule, che è stato evidenziato più di venti anni fa, dimostrando che un gran numero di linee cellulari sono stati contaminati da HeLa cellule 8,11. L'errata interpretazione dei dati di "falsi" linee cellulari è recentemente venuto alla luce nella letteratura di nuovo. Utilizzando una combinazione di DNA profiling e citogenetica molecolare, MacLeod et al. Rivelato che su 252 nuovi tumori derivati ​​da linee cellulari umane depositato presso la Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ), circa il 18% sono risultati intraspecie o interspecie croce -contaminanti 12,13.

Per evitare questi problemi e di sfruttare i vantaggi di cui sopra, abbiamo deciso di stabilire basso passaggio da linee cellulari di melanoma metastasi asportati recentemente.

Robuste cellule tecnologie di separazione e di analisi richiedono monocellulari preparati da generare contemporaneamente limitando la morte cellulare e la distruzione delle proteine ​​di superficie caratteristici. Uno strumento da banco per la dissociazione automatico di tessuti in sospensioni monocellulari è il dissociatore gentleMACS prodotto da Miltenyi. Quando usato in combinazione con gentleMACS C Tubi e ottimizzato soluzioni dissociazione, una dissociazione efficace e delicata del tessuto tumorale in un sistema chiuso viene raggiunto mantenendo epitopi antigenici e riducendo la perdita delle cellule. Lo strumento dispone ottimizzati, programmi preimpostati per una varietà di applicazioni specifiche e garanzie preparazione standardizzata di sospensioni monocellulari di melanoma tessuto 14.

<p class = "jove_content"> Studi recenti hanno rivelato che la maggior parte dei tumori porto una piccola sottopopolazione di cellule tumorali cosiddette staminali (CSC), che presentano esclusivamente tumore inizia e si auto-rinnovano capacità. L'identificazione di melanociti che producono cellule staminali nel derma della pelle ha portato a formulare l'ipotesi che queste cellule potrebbero essere l'origine delle cellule staminali tumorali (CSC) nel melanoma, perché l'esposizione alle radiazioni UVA possono innescare queste cellule per la trasformazione maligna 15. Il risultato di tale lesione genetica sarebbe cellule che ospitano una combinazione di tumore e le caratteristiche delle cellule staminali.

Uno degli indicatori chiave proposti per rappresentare la sottopopolazione di CSC nel melanoma è CD133 16-20. CD133 (noto anche come Prominin 1), un membro di glicoproteine ​​transmembrana pentaspan, viene espressa in cellule staminali ematopoietiche, cellule progenitrici endoteliali, cellule staminali neuronali e gliali 21-23. Espressione di CD133 è correlata condivisione cellulare asimmetrica 24, e l'epitopo glicosilata del CD133 è dimostrato downregulated sulla differenziazione cellulare 25. Recentemente, CD133 + cellule di melanoma hanno mostrato di avere auto-rinnovamento e tumore iniziazione capacità di 19,20.

Per studiare la funzione di CD133 + putativo melanoma CSC, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) sistema da Miltenyi Biotech per ottenere popolazioni altamente arricchito e vitale di CD133 + e CD133 - cellule.

Magnetica tallone basata separazione cellulare permette a ciascuna selezione negativa, come mostrato da Matheu et al. 26 o selezione positiva, come indicato,. Durante la selezione positiva il particolare tipo di cellula bersaglio, ad esempio, le cellule che esprimono CD133, è magneticamente etichettato con microsfere, 50-nm particelle superparamagnetiche che sono coniugati ad anticorpi altamente specifici nei confronti di unparticolare cellula antigene di superficie. Durante la separazione, le cellule marcate magneticamente sono trattenute all'interno della colonna nel campo magnetico del separatore, mentre le cellule non marcate fluire attraverso. Seguendo fasi di lavaggio, la colonna viene rimosso dal campo magnetico del separatore, e le cellule bersaglio vengono eluite dalla colonna. Il LS o colonne MS utilizzata durante la selezione risultato positivo in frazioni di cellule marcate e non marcato con elevata purezza. D'altra parte, colonne LD, utilizzati per la selezione negativa, risultato in una purezza leggermente inferiore della frazione etichettato. A causa della densa confezionamento di loro matrice portata in queste colonne è inferiore a un rischio più elevato di celle non etichettati da intrappolati nella colonna. Colonne LD deve pertanto essere utilizzato solo per l'esaurimento rigorosa di una sottopopolazione cellulare indesiderata. Selezione positiva può essere eseguita direttamente (anticorpo accoppiato a microsfere) o indiretto marcatura magnetica (incubazione con microsfere seguito incubation con l'anticorpo primario). MACS specifici microperline sono disponibili per la selezione positiva di numerosi tipi di cellule primarie di cellule tumorali come prostatico o melanoma 27.

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Protocol

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La struttura generale della dell'esperimento compresa la preparazione di singole cellule primarie da tessuto tumorale, la caratterizzazione della coltura di cellule primarie, deplezione fibroblasti e cell sorting magnetico di CD133 + e CD133 - cellule di melanoma è mostrato in Figura 1.

1. Esempio di acquisizione

  1. Verificare la presenza di approvazione etica prima di considerare i passi successivi.
  2. Preparare un tubo da 50 ml con PBS sterile supplementato con 1% di penicillina-streptomicina concentrazione finale e la consegna di un intervento chirurgico o di squadra.
  3. Organizza il trasporto veloce di tessuto tumorale da un intervento chirurgico al laboratorio di coltura cellulare a 4 ° C.

2. Preparazione primarie Melanoma singole cellule da tessuto tumorale

  1. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili.
  2. Prima resezione del tumore, si ha la necessità di preparare l'impasto dissociazione. 10 ml mix dissociazione a 2-4 g di tessuto è richiesto. La miscela può essere utilizzata immediapletamente o conservati in aliquote da 10 ml a -20 ° C per un uso successivo.
    1. Preparare una soluzione contenente cloruro di sodio 150 mM. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Se necessario, filtrato sterile di cloruro di sodio usando un filtro di 0,22 micron.
    2. Pesare DNasi I e preparare una soluzione contenente 10 mg / ml DNasi I in cloruro di sodio 150 mM. Mescolare capovolgendo finché la soluzione è limpida.
    3. Preparare una soluzione contenente 100mg/ml Collagenase IV in PBS. Mescolare capovolgendo finché la soluzione è limpida. Aliquote di soluzione di collagenasi può essere conservato a -20 ° C per diversi mesi.
    4. Preparare l'impasto dissociazione con una concentrazione finale di 1% Penicillina-Streptomicina, 1 mg / ml di collagenasi IV e 0,1 mg / ml in terreno di DNasi I Quantum 263. Mescolare con un vortice. Opzionale: quando si usa il tessuto derivato dalla soluzione di melanoma cutaneo aggiuntivo Amfotericina B al mix dissociazione ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml di amfotericina B.
  3. Preriscaldare il reqquantità uired di dissociazione mix, PBS e Quantum medie 263-37 ° C.
  4. Luogo tessuto tumorale su una piastra di Petri sterile. Aspirare la soluzione in eccesso dal tessuto e aggiungere 500 microlitri mix dissociazione. Tritare tumore in piccoli pezzi di 2-4 mm con l'utilizzo freschi, bisturi sterili.
  5. Trasferimento 2-4 g macinata tessuto tumorale in un tubo gentleMACS C contenente 5 ml mix dissociazione. Sciacquare piastra Petri con l'aggiunta di 4,5 ml di dissociazione mescolare e aggiungere frammenti di tessuto rimasti alla metropolitana gentleMACS C.
  6. Chiudi gentleMACS tubo C e collegarlo a testa in giù sulla bussola del dissociatore gentleMACS. Eseguire il programma gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Staccare il tubo gentleMACS C dal dissociatore e incubare il campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua utilizzando il rotatore tubo MACSmix sulla velocità massima corsa (12 rpm) o ruotando il tubo manualmente ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto regolate .
  8. Fissare gentleMACS tubo C a testa in giù sulla manica della tegli gentleMACS dissociatore ed eseguire il programma gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Staccare il tubo gentleMACS C dal dissociatore e incubare il campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua utilizzando il rotatore tubo MACSmix sulla velocità massima corsa (12 rpm) o ruotando il tubo manualmente ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto regolate .
  10. Fissare gentleMACS tubo C a testa in giù sulla bussola del dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Staccare il tubo gentleMACS C dal campione dissociatore, risospendere e applicare la sospensione cellulare ad un filtro 70 micron cella posta su un tubo da 50 ml. Se intasamento del filtro avviene, mescolare sospensione cellulare con una punta sterile filtro fino alla completa sospensione attraversava.
  12. Sciacquare filtro cella con 5 ml di mezzo Quantum 263.
  13. Opzionale: se avete ancora frammenti di tessuto rimasti nel filtro, frammenti risospendere in mezzo Quantum 263 e semi in una cultura display appropriato cellulareh. Frammenti incubare a 37 ° C e 5% di CO 2.
  14. Eliminare filtro cella e chiudere il tubo da 50 ml con la sospensione cellulare digerito. Centrifugare sospensione di cellule per 5 minuti a 300 xg ed eliminare il surnatante.
  15. Opzionale: se la cella pellet viene visualizzato in rosso a causa di una elevata quantità di eritrociti preparare 1x Red Cell Lysis Solution sangue diluendo 1:10 soluzione 10x in acqua bidistillata, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS e si aggiungono 5 ml di 1x Red Lysis Globulo Soluzione. 5 sec vortice e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare per 5 minuti a 300 xg ed eliminare il surnatante.
  16. Risospendere le cellule tumorali con Quantum 263 e semi le cellule in coltura cellulare pallone adeguato. Cellule tumorali Cultura a 37 ° C e 5% di CO 2 e di routine delle cellule di passaggio quando raggiungono l'80% confluenza.

3. Caratterizzazione di coltura cellulare primaria e deplezione dei fibroblasti

  1. Analizzare coltura primaria cellule fenotipicamente utilizzando un microscope.
  2. Raccogliere una piccola quantità (0.5x 10 6 celle) della coltura cellulare primaria ed eseguire RT-PCR con primer per-neoplastiche, melanoma, cellule staminali-e geni marcatori delle cellule dello stroma. I geni più importanti da analizzare sono CD90 (marcatore dei fibroblasti), TYR (melanoma / marcatore melanociti), CD133 (marcatore delle cellule staminali del cancro), CD83 (marcatore di cellule dendritiche mature) e un gene housekeeping (ad esempio HPRT o GAPDH).
  3. Se l'analisi microscopica e alta espressione di CD90 Durante la RT-PCR ha rivelato una elevata contaminazione della cultura melanoma primitivo con fibroblasti, è necessario esaurire fibroblasti con gli Anti-Fibroblasti microsfere e colonne D da Miltenyi.

4. Di separazione delle cellule CD133 + magnetica e CD133 - cellule di melanoma utilizzando colonne LS

  1. Preparare MACS tampone contenente 2 mM EDTA e il 5% FCS in PBS. Miscelare invertendo e tampone sterile, filtrato con un micron 0,22 Steritop-GP Unità di filtro. Freddo del tampone a 4-8 ° Ce Degas prima dell'uso.
  2. Preriscaldare Accutase, PBS e Quantum medie 263-37 ° C.
  3. Lavare 80% cellule confluenti con PBS. Aggiungere la quantità appropriata di Accutase e incubare cellule fino staccarsi dalla superficie cultura. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml usando Quantum media 263.
  4. Determinare il numero di cellule e centrifugare il numero di cellule (secondo il protocollo Miltenyi di un numero massimo di 2x 10 9 cellule possono essere caricati per colonna LS. Linea cellulare numeri specifici ottimale dovrebbe essere determinata e può essere notevolmente inferiore.) Per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  5. Risospendere un massimo di 1x 10 8 cellule con 350 microlitri di buffer MACS (per il numero di cellule superiore scalare tutti i buffer successivo MACS, reagente FcR blocco, CD133/1-Biotin e anti-biotina microsfere volumi di conseguenza).
  6. Aggiungere 100 Reagente FcR blocco.
  7. Aggiungere 50 microlitri CD133/1-Biotin. Mescolare bene con un vortice e incubare a 4-8 ° C fo 10 min.
  8. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  9. Ripetere il passaggio di lavaggio (4.8)
  10. Risospendere il pellet di cellule con 400 microlitri di buffer MACS.
  11. Aggiungere 100 ml anti-biotina microsfere. Mescolare accuratamente con un vortex e incubare a 4-8 ° C per 15 min.
  12. Nel frattempo, preparare il separatore MACS per la separazione magnetica. Fissare QuadroMACS a Separator MACS supporto Multi. Inserire il numero di colonne LS con le ali colonna al fronte nel campo magnetico del QuadroMACS. Inserire un pre-filtro di separazione (30 mesh con um nylon) in ciascuna colonna LS ed un tubo di raccolta appropriato (15 ml o 50 ml) sotto ciascuna colonna. Preparare filtro e colonna risciacquo con 3 ml di tampone MACS. Scartare a flusso continuo.
  13. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  14. Risospendere le cellule con 500 microlitriMACS tamponare e applicare sospensione cellulare nella colonna LS con il Pre-filtro di separazione.
  15. Lavare tre volte con 3 ml di tampone per colonna MACS. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio colonna è vuota.
  16. La residua raccolta contiene il totale senza etichetta CD133 - frazione di cellule.
  17. Gettare il pre-filtro di separazione, rimuovere colonna dal separatore e posizionarlo su un tubo di raccolta adeguato.
  18. Applicare 5 ml di tampone MACS. Sciacquare immediatamente le cellule CD133 + marcati con fermezza spingendo lo stantuffo nella colonna.
  19. Per aumentare la purezza della frazione negativa, applicare sospensione cellulare in una nuova colonna LS equilibrata inserito nel QuadroMACS. L'effluente contiene il CD133 - frazione.
  20. Elimina colonne.

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Representative Results

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Preparazione di singole cellule di tessuto tumorale

La figura 2 esemplifica una metastasi linfa resecata nodo di un paziente prima fase tardiva melanoma (A) e dopo (B) meccanica dissociazione in 2-4 pezzi millimetri. Seguendo dissociazione enzimatica del tessuto e filtrazione attraverso una maglia di nylon 70 pm, cellule sono state pellettizzate e il supernatante scartato. In questa fase abbiamo osservato un'elevata contaminazione con eritrociti come indicato dal colore rossastro del pellet cellulare in Figura 2C. Successivamente, abbiamo esaurito i globuli rossi, che portano a una cella pellet di colore marrone chiaro (Figura 2D). Queste cellule sono state risospese e coltivati ​​con Quantum 263 media a 37 ° C e 5% di CO 2.

Caratterizzazione di colture primarie

Per convalidare se le cellule provengono da tumore e non da stroma circostante, abbiamo eseguito RT-PCRdi melanocyte/melanoma-, fibroblasti, cellule dendritiche e delle cellule staminali geni marcatori. Melanociti adulti servito da cellule di controllo normali per TYR e sulle cellule di carcinoma NCCIT linea come controllo positivo per il marcatore delle cellule staminali CD133. PCR, mostrati in figura 3, ha rivelato che alcune cellule primarie sono infatti di origine melanocitici (positivo per TYR) e sono negative per il marcatore di cellule dendritiche mature (CD83). Inoltre, linee cellulari di melanoma sono stati trovati esprimono CD133, un gene cruciale per la divisione cellulare asimmetrica e un noto marker del cancro delle cellule staminali. HPRT è stato usato come controllo di caricamento.

Inizialmente, la coltura di cellule primarie conteneva anche un'elevata contaminazione con fibroblasti come indicato dalla elevata espressione di CD90 (Figura 3 a sinistra, pannello superiore).

Seguendo deplezione fibroblasti, questa coltura cellulare conteneva solo TYR + cellulare di melanomas e non più fibroblasti (CD90 -) (Figura 3 a sinistra, in basso). L'assenza di fibroblasti potrebbe essere confermata da microscopia brightfield, come mostrato in Figura 4.

Cellula magnetica cernita di CD133 + e CD133 - cellule di melanoma

Cellule di melanoma primarie, che mostrano l'espressione CD133 come indicato dalla RT-PCR possono essere ordinate in CD133 + e CD133 - cellule. Con il protocollo modificato dal indiretto CD133 microsfere Kit, una elevata purezza (> 99,75%) e la resa del CD133 + e CD133-frazioni, nonché una alta vitalità di entrambe le frazioni dopo la cernita, si ottiene. Efficacia smistamento e purezza deve sempre essere verificata mediante colorazione immunofluorescenza o western blot, come mostrato in Figura 5A e B.

Figura 1 Figura 1. Schema generale della sperimentazione. Primario coltura cellulare di melanoma e l'isolamento di cellule CD133 + putativi staminali del cancro include la resezione del tumore seguita da dissociazione meccanica ed enzimatica delle cellule tumorali utilizzando un mix dissociazione con DNasi I e collagenasi IV e il dissociatore gentleMACS. Se le cellule tumorali sono altamente contaminati con globuli rossi, una fase di esaurimento eritrociti è raccomandato. Colture di cellule primarie deve quindi essere caratterizzato da microscopico e RT-PCR per verificare se sono cellule di melanoma. Una contaminazione elevata con fibroblasti indicate mediante espressione di CD90 può essere rimosso mediante deplezione fibroblasti Miltenyi di microperle anti-fibroblasti. Infine, CD133 + e CD133-melanoma cellule può essere frazionato con il CD133 indiretto Micro-Bead umano Kit da Miltenyi. Dopo la cernita, la purezza è confermata ed il CD133 + und CD133-melanoma frazioni possono essere analizzati affiancati.

Figura 2
Figura 2. Preparazione di singole cellule di tessuto tumorale. A:. Esempio di una metastasi melanoma asportato prima della dissociazione in singole cellule B: metastasi melanoma dopo dissociazione meccanica del tessuto tumorale in 2-4 pezzi mm utilizzando due bisturi sterili C:. Pellet di singole cellule altamente contaminati con globuli rossi D. : Pellet di singole cellule dopo l'esaurimento degli eritrociti.

Figura 3
Figura 3. Analisi di espressione di colture cellulari primarie. Analisi RT-PCR dei geni legati alla produzione di melanina (TYR), marcatore dei fibroblasti (CD90), marcatore delle cellule dendritiche ( CD83) e geni cruciali per la divisione cellulare asimmetrica (CD133) ha mostrato che, inizialmente, la coltura cellulare primaria contenuta CD133 + cellule di melanoma (TYR +) e non le cellule dendritiche (CD83-), ma è stato altamente contaminato da fibroblasti (CD90 +) (a sinistra, pannello superiore) . Esaurimento dei fibroblasti Dopo questa coltura cellulare conteneva solo + TYR e CD90-cellule di melanoma (a sinistra, pannello inferiore). HPRT è stato usato come controllo di caricamento. NCCIT e melanociti adulti servito come controllo positivo per CD133 e Tyr, rispettivamente.

Figura 4
Figura 4. Micrografie di colture cellulari primarie prima e dopo l'esaurimento dei fibroblasti. A: microscopio campo chiaro di una coltura cellulare primaria altamente contaminato da fibroblasti B:. Brightfield Micrografia della stessa cultura cellulare di melanoma primario dopo l'esaurimento dei fibroblasti.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 5
Figura 5. Verifica della MACS tramite colorazione di immunofluorescenza e western blotting. A: micrografie immunofluorescenza di cellule di melanoma 24 ore dopo la cernita con la indiretto CD133 Kit microsfere da Miltenyi. Le cellule sono state seminate su vetrini e colorate con CD133 / 1 (W6B3C1) anticorpo seguita da incubazione con Alexa Fluor 488 di capra anti-coniglio anticorpo secondario. Solo nella frazione CD133 + un segnale specifico sulla membrana cellulare è stata osservata come indicato dalle frecce bianche (pannello di sinistra). CD133-cellule non macchia per la presenza della proteina (pannello destro) B:. Conferma di purezza ordinamento per quantitativa occidentale fluorescente blotting. Un forte CD133 segnale è stato rilevato nella frazione CD133 +, mentre una molto debole CD133 espressione è stata osservata in the CD133-popolazione.

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Discussion

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Al fine di rimuovere contaminazioni eritrocitari dal pellet cellulare tumorale si consiglia di utilizzare la soluzione di globuli rossi del sangue lisi da Miltenyi. I vantaggi di lisare gli eritrociti rispetto alla tradizionale centrifugazione in gradiente di densità Ficoll sono che è più veloce e più semplice. Inoltre, contaminazioni con Ficoll o globuli rossi e la perdita di cellule tumorali sono evitati. Quando si osserva la crescita dei fibroblasti in coltura cellulare primaria devono essere rimossi immediatamente, visto che normalmente invadere le cellule tumorali quando attendere troppo a lungo.

Quando si ordinano le cellule con la tecnica MACS Miltenyi, vi consigliamo di raccogliere le cellule enzimaticamente. Utilizzando un raschietto cellulare potrebbe essere più delicato per le cellule e le loro epitopi di superficie, ma anche produrre frammenti di cellule, che si legano non specifico alle colonne MACS e intasare le colonne. I vantaggi di Accutase rispetto al tradizionale Tripsina / EDTA trattamento includono stress cellulare ridotta, leading della redditività migliorata e ridotto al minimo il rischio di introduzione di agenti avventizi nelle colture cellulari. La preparazione Accutase non contiene proteine ​​di mammifero o batteriche ricombinanti 28.

Per evitare tappatura di anticorpi sulla superficie cellulare e non specifico marcatura delle cellule deve lavorare velocemente, mantenere le cellule freddo e utilizzare pre-raffreddati soluzioni. Tutte le fasi di incubazione devono essere eseguiti a 2-8 ° C, ma non sul ghiaccio in quanto temperature più basse può aumentare i tempi di incubazione. Il numero di cellulare ideale per ogni colonna deve essere determinata per ogni coltura cellulare nuovo. Nel nostro laboratorio abbiamo lavorato con linee cellulari di melanoma in cui un numero di cellule massimo di 4x 10 7 cellule potrebbero essere applicate per colonna LS. Colonne di MS non ha funzionato affatto per questo tipo di cellule. Per le cellule molto grandi Miltenyi fornisce anche le colonne a grandi cellule, che dovrebbero essere utilizzati al posto.

Il buffer MACS raccomandato da Miltenyi contenente 2 mM EDTA e 0,5% di BSA in PBS. Se una diminuita tramitebilità delle cellule dopo cernita magnetico si osserva, questo potrebbe essere dovuto alla BSA e / o EDTA nel buffer. Per migliorare la redditività BSA cella può essere sostituita da 5% FCS, che di solito è meglio tollerata BSA. EDTA nel buffer MACS può essere omesso per aumentare la vitalità della cellula, ma diminuisce la purezza smistamento del 2-3%.

MACS tampone utilizzato per equilibrare le colonne deve essere eliminata. Si raccomanda di non raccogliere le cellule ordinati in questa soluzione di equilibrio in quanto può danneggiare le cellule. Invece, le cellule filtrate deve essere raccolto in un tubo dotato di mezzo di coltura per stabilizzare le cellule direttamente dopo l'ordinamento.

Per evitare l'intasamento delle colonne è importante ottenere una cella singola sospensione prima smistamento magnetico passando le cellule attraverso una maglia di nylon 30 micron (= pre-separazione filtri). Per aumentare la purezza della frazione negativa, un secondo funzionamento attraverso un fresco, LS colonna equilibrata o colonna LD(= Per la deplezione delle cellule) è suggerito.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Prof. M. Dietel e Dirk Schumacher per sostenere questo lavoro e criticamente la lettura del manoscritto.

La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno del innovativi in ​​materia di medicinali impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 115234, le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) e le imprese 'in dell'EFPIA contributo di natura. Questo lavoro è stato supportato anche dal Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

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Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma
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Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

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