Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif CD133

Abstract

Mevcut melanom bugün için daha iyi tedaviler seçenekleri rağmen, ileri malign melanom hastalarında hala progresyonsuz ve genel sağkalım için kötü bir prognoza sahiptir. Bu nedenle, translasyonel araştırma malign melanom için hedefli tedaviler geliştirmek için ileri moleküler kanıtlar sağlaması gerekir. Melanom ile ilgili geçmişte, onkojenik mekanizmalar yoğun yerleşik hücre hatları çalışıldı. Bireysel genetik profillerine dayalı daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimleri için yolda, biz hasta türevi hücre hatları yerine jenerik hücre hatları kullanmayı öneriyoruz. Birlikte özellikle hasta takibi üzerine yüksek kalitede klinik verilerle birlikte, bu hücreler daha melanoma ilerleme arkasında moleküler mekanizmaları anlamak için vesile olacaktır.

Burada disseke taze tümör dokusu primer melanom kültürlere kurulması rapor. Bu işlem, tek bir hücre içine kıyma ve doku ayrışma, yeniden içerireritrositler ve fibroblastlar gibi primer kültür ve hücrelerin melanom kökenli güvenilir doğrulama ile kontaminasyonların moval.

Son raporlar ortaya koydu melanomlar, tümörlerin çoğunluğu gibi, limana sadece metastatik devlete karşı tümör gelişimini ve ilerlemesini yakıt gibi kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu. Melanom CSC kimlik ve izolasyon için önemli belirteçler biri CD133 olduğunu. Primer melanom kültürlere ait CD133 + rulmanları yalıtmak için, değiştirilmiş ve Manyetik-Aktif Hücre yüksek sıralama saflıkta sonuçlanan Miltenyi gelen Sıralama (MACS) prosedürü ve CD133 + rulmanları ve CD133 canlılığı optimize - dökme, ekili ve fonksiyonel analiz edilebilir bundan sonra.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kutanöz malign melanom cilt kanseri en sık görülen, ama en ölümcül türüdür. Artan bir insidans, ölümleri 1,2 ilişkili malign deri tümörlerinin% 75 malignite ve hızlı yayılması bir yüksek dereceli, şimdi melanomlar hesabı nedeniyle. Primer tümör, kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve metastas melanom kombine kemoterapi ve immünoterapi cerrahi eksizyon yanında melanom tedavisinde 3,4 için state-of-the-art stratejilerdir. Ancak, malign melanom kemoterapötiklerin zayıf yanıt (% 5-12) 5,6 ve Hazır vemurafenib 7 ile tedavi gibi yeni hedefli tedaviler vadeden BRAF V600E gen mutasyonunun yararı taşıyan melanom hastalarının yalnızca% 50-70 ile karakterizedir sağkalımı, melanom Tümörgenez mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir.

Geçmişte, köklü ticari bu mekanizmaların incelenmesilikle mevcut hücre çizgileri kullanıldı. Kanser başlangıcı ve ilerlemesindeki moleküler olayları incelemek için daha yeni yaklaşımlar tümör dokusunun doğrudan elde primer kültürlerinde kullanmak - bir strateji rulman manifoldu faydaları: araştırmacı hasta ve doku seçimi üzerinde tam denetime sahiptir. Örneklenen hücreler ustaca seçilen tümör dokusu elde, tüm heterojenite ile tümörü andıran ve takip hastanın verileri ve ayrıntılı patoloji kültürünün özelliklerini orijinal tümör 8 ile karşılaştırıldı izin vermek için kullanılabilir.

Buna karşılık, kanser araştırma ilgili model sistem olarak oluşturulmuş hücre hattını kullanmak tartışılmaktadır. Zaten 1987 yılında Osborne ve arkadaşları farklı laboratuvarlarda 9 MCF-7 insan meme kanseri hücre hatları arasında önemli biyolojik farklılıklar açıklanmıştır. Altkültür sırasında RNA ekspresyonunda Bu geniş genomik kararsızlık ve değişkenlik işbirliği olduHiorns ark nfirmed. ve hücre hatları böylece insan kanser 10 modelleri gibi kurulan kültürlerin doğrudan alaka zayıflaması, kültür gelişmeye emin delil destekleyici veriler sağladı.

Büyük ölçüde yıllar boyunca ihmal edilen bir diğer önemli göz, hücre hatları çok sayıda HeLa ile kirlenmiş olduğunu ilk göstererek yirmi yıl önce çizildi ilgisiz 'false' hücreleri ile kültürlerin kontaminasyon veya büyümesi riski olduğunu hücreleri 8,11. 'Yanlış' hücre hatları verilerin yanlış yorumlanmasına son zamanlarda tekrar literatürde açık olarak ortaya çıkmıştır. DNA profili ve moleküler sitogenetik bir arada kullanarak, McLeod ve ark. 252 yeni tümör türevli insan hücre hatları, Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri (DSMZ), Alman Collection tevdi yaklaşık% 18 oranında intraspecies olduğu bulunmuştur ya da çapraz türler arası olduğunu göstermiştir -kirletici 12,13.

Bu sorunları önlemek için ve yukarıda belirtilen avantajlardan yararlanmak için, biz yeni eksize metastaz düşük-geçiş melanom hücre hatları kurmaya karar verdi.

Sağlam hücre ayırma ve analiz teknolojileri eşzamanlı karakteristik yüzey proteinleri hücre ölüm ve yıkım sınırlayan ise tek hücreli preparatlar elde edilecek gerektirir. Tek hücre süspansiyonları içine dokuların otomatik ayrışma için benchtop enstrüman Miltenyi tarafından imal GentleMACS Dissociator olduğunu. Antijen epitoplarının korunması ve hücre kaybını azaltma süre GentleMACS C tüp ve optimize edilmiş ayrışma çözeltiler, kapalı bir sistem içerisinde tümör dokusunda etkili ve yumuşak bir ayrılma ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman elde edilir. Enstrüman özel uygulamalar ve teminatlar melanom dokusunun 14 tek hücre süspansiyonları standardize hazırlık çeşitli için optimize edilmiş, önceden ayarlanmış programları sunmaktadır.

<p class = "jove_content"> tümörlerin çoğunluğu sadece tümör başlatılması ve kapasite kendini yenileyen sergilerler denilen kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu liman ortaya çıkanlar raporlar. Derinin dermis melanosit üreten kök hücrelerinin tanımlanması UVA ışınlarına maruz malign transformasyon 15 için bu hücreleri hazırlamak çünkü bu hücrelerin melanom kanser kök hücreleri (rulmanları) kökeni olabileceği hipotezini doğurmuştur. Bu tür bir genetik lezyon sonucu, tümör ve kök hücre özelliklerinin bir kombinasyonu liman hücreler olacaktır.

Melanom rulmanları ve alt sınıfı için önerilen anahtar belirteçlerin biri CD133 16-20 olduğunu. CD133 (ayrıca Prominin 1 olarak da bilinir), pentaspan transmembran glikoproteinler üyesi, hematopoetik kök hücreler, endotelyal progenitör hücreleri, nöronal ve glial kök hücreleri 21-23 olarak ifade edilir. CD133 ekspresyonu ile korelasyonasimetrik hücre bölünmesi 24, ve CD133 ve glikosilatlı epitop 25 hücre farklılaşması üzerine aşağı regüle olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda, CD133 + melanom hücrelerinin kendini yenileme ve tümör-inisiyasyon kapasitesi 19,20 olduğu gösterilmiştir.

CD133 + olası melanom rulmanları fonksiyonunu incelemek için, değiştirilmiş ve CD133 yüksek derecede zenginleştirilmiş ve canlı popülasyonları + ve CD133 elde Miltenyi Biotech gelen Manyetik-Aktif Hücre Ayırma (MACS) sistemi optimize - hücreleri.

Matheu ark gösterildiği gibi Manyetik boncuk tabanlı hücre ayırma ya negatif seçim için izin verir. 26 veya pozitif seleksiyon Burada göstereceğimiz gibi. Pozitif seçimi sırasında özellikle hedef hücre tipi, örneğin CD133 eksprese eden hücrelerin, manyetik bir karşı yüksek düzeyde özgül antikorlarla konjuge olan microbeads, 50-nm Süperparamanyetik parçacıkları ile etiketlenmiştirözel hücre yüzeyi antijenine. Etiketsiz hücreleri akmasına ise ayrılık sırasında, manyetik etiketli hücreleri, ayırıcı manyetik alanında sütun içinde korunur. Yıkama adımları takiben, sütun ayırıcı manyetik alan kaldırılır ve hedef hücrelerin sütundan elüt edilmiştir. LS veya MS sütunları yüksek saflıkta etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonları pozitif seleksiyon sonucu sırasında kullanılır. Diğer taraftan, negatif seleksiyon için kullanılan LD kolonlar, etiketli fraksiyonunun biraz daha düşük bir saflık ile sonuçlanır. Bunların matris ambalaj yoğun olması nedeniyle bu sütunlarda debi sütununda tuzağa, etiketsiz hücrelerin daha yüksek bir risk düşük sonuç olduğunu. LD sütunları nedenle istenmeyen bir hücrenin alt populasyonun sıkı tükenmesi için kullanılmalıdır. Pozitif seçim incubatio aşağıdaki mikro-küreler ile doğrudan (mikro-küreler bağlanmış antikor) veya dolaylı manyetik etiketleme (kuluçka ile gerçekleştirilebilirN birincil antikor ile birlikte). Spesifik MACS mikro-küreler ya da prostat melanom 27 gibi primer tümör hücrelerinin çok sayıda hücre tiplerinin pozitif seçim için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Birincil hücre kültürü, fibroblast tükenmesi ve CD133 manyetik hücre sıralama tümör dokusu, karakterizasyonu ikinci birincil tek hücrelerin hazırlanmasını da içeren deney genel düzeni + ve CD133 - melanom hücrelerinin Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Örnek Toplama

  1. Sonraki adımlar dikkate alınarak önce etik kurul onayı için kontrol edin.
  2. Steril PBS cerrahi OR ekibine% 1 Penisilin-Streptomisin final konsantrasyon ve el ile desteklenmiş bir 50 ml tüp hazırlayın.
  3. 4 ° C'de cerrahi hücre kültürü laboratuarına tümör dokusunun hızlı ulaşım Organize

2. Tümör Dokusu Primer Melanom Tek hücre hazırlanması

  1. Steril koşullar altında tüm adımları uygulayın.
  2. Tümör rezeksiyonu önce, bir ayrışma karışımı hazırlamak gerekmektedir. 2-4 g doku başına 10 ml ayrışma karışımı gereklidir. Karışım immedia kullanılabilirlarına ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de 10 ml alikots içinde saklanmıştır.
    1. 150 mM sodyum klorid içeren bir çözelti hazırlayın. Çözümü netleşene kadar bir girdap kullanarak karıştırın. Eğer bir 0.22 um filtre kullanılarak steril gerekli-Süzülen madde sodyum klorür çözeltisi.
    2. DNaz I tartılır ve 10 mg / 150mm sodyum klorür ml DNaz I içeren bir solüsyon hazırlanır. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır.
    3. PBS içinde 100mg/ml Kollajenaz IV içeren bir solüsyon hazırlayın. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır. Kolajenaz çözeltisi alikotlar birkaç ay boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
    4. % 1 Penisilin-Streptomisin, 1 mg / ml kollajenaz IV, ve 0.1 mg / Quantum 263 orta ml DNase I, bir son konsantrasyon ile ayrışma karışım hazırlayın. Bir girdap kullanarak karıştırın. İsteğe: 1.5 ug / ml amfoterisin B'nin bir nihai konsantrasyon için ayrışma karışımına ekleyin cilt amfoterisin B çözeltisi elde edilen melanom doku kullanıldığında
  3. Pre-sıcak req37 disosiyasyon karışımı, PBS ve Kuantum 263 orta uired miktarda ° C.
  4. Steril bir Petri kabı yerleştirin tümör dokusu. Doku aşırı çözüm aspire ve 500 ul dissosiyasyon karışımı ekleyin. Taze, steril neşter kullanılarak 2-4 mm küçük parçalar halinde doğrayın tümörü.
  5. Transferi 2-4 gr 5 ml dissosiasyon karışımını içeren GentleMACS C Tüp içine tümör dokusu kıyılmış. Ek 4.5 ml disosiyasyon karışımı ile Petri durulayın ve GentleMACS C Tüp kalan doku parçaları ekleyin.
  6. GentleMACS C tüpü kapatın ve GentleMACS Dissociator bir kol üzerine ters takın. GentleMACS programı "h_tumor_01" çalıştırın.
  7. Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında .
  8. T kol üzerine baş aşağı GentleMACS C boru takınO GentleMACS Dissociator ve GentleMACS programı "h_tumor_02" çalıştırın.
  9. Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında .
  10. GentleMACS Dissociator bir kol üzerine baş aşağı GentleMACS C tüpü takın ve GentleMACS programı "h_tumor_03" çalıştırın.
  11. Dissociator, tekrar süspansiyon örnek GentleMACS C tüp ayırın ve bir 50 ml tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgeci için hücre süspansiyonu uygulanır. Filtrenin tıkanma oluşursa komple süspansiyon koştu kadar steril bir filtre ucu ile hücre süspansiyonu karıştırın.
  12. 5 ml Kuantum 263 orta hücre süzgecinden durulayın.
  13. İsteğe bağlı: Eğer hala Kuantum 263 orta ve uygun bir hücre kültürü dis tohum onları filtre, tekrar süspansiyon parçaları kalan doku parçaları varsah. 37 parça inkübe ° C ve% 5 CO2.
  14. Hücre süzgecinden atın ve sindirilmiş hücre süspansiyonu ile 50 ml tüp kapatın. 300 x g'de 5 dakika süreyle hücre süspansiyonu santrifüjleyin ve supernatant atın.
  15. İsteğe bağlı: hücre pelletini nedeniyle eritrositler 500 ul PBS çift damıtık su, tekrar süspansiyon hücre pelletini 10x çözümü 01:10 sulandırarak 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis Çözüm hazırlamak yüksek miktarda ve 5 ml 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis ekleyebilir, kırmızı görünüyorsa Çözüm. 10 dk için oda sıcaklığında Vortex 5 saniye ile inkübe edin. 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve supernatant atın.
  16. Quantum 263 ve tohum uygun hücre kültürü şişesi içinde hücreleri ile tümör hücrelerinin yeniden süspanse edin. 37 Kültür tümör hücrelerinin ° C ve% 5 CO2 ve% 80 izdiham ulaşmak rutin olarak geçit hücreleri.

3. Primer Hücre Kültürü ve Fibroblast tükenmesi Karakterizasyonu

  1. Fenotipik bir microsco kullanılarak primer hücre kültürü analizpe.
  2. Primer hücre kültürü küçük bir miktar (0.5x 10 6 hücre) Hasat ve neoplastik-, melanom-, kök hücre ve stroma hücre işaretleyici genler için primerler ile RT-PCR işlemi gerçekleştirmek. Analiz etmek için en önemli genler CD90 (fibroblast işaretleyici), TYR (melanom / melanosit işaretleyici), CD133 (kanser kök hücre belirteci), CD83 (olgun dendritik hücreler için marker) ve bir temizlik gen (örn. HPRT ya GAPDH) vardır.
  3. RT-PCR sırasında mikroskopik analizi ve CD90 yüksek ifade fibroblast ile primer melanom kültürünün yüksek kontaminasyon saptandı varsa, Miltenyi gelen Anti-Fibroblastlar microbeads ve D sütunları kullanarak fibroblastlar tüketmek gerekir.

4. Manyetik Hücre CD133 arasında Ayırma + ve CD133 - LS sütunlar kullanma Melanom Hücreleri

  1. PBS içinde 2 mM EDTA,% 5 FCS ihtiva eden tampon MACS hazırlayın. 0.22 mikron Steritop-GP Filtre Ünitesi kullanarak eviren ve steril-süzüntü tampon ile karıştırın. 4-8 ° C Hissedilen tamponKullanmadan önce ve degas.
  2. 37 Pre-sıcak Accutase, PBS ve Kuantum 263 orta ° C.
  3. PBS ile 80% konfluent hücreleri yıkayın. Accutase uygun miktarda ekleyin ve hücrelerin kültür yüzeyden koparak kadar inkübe edin. Quantum 263 ortamı kullanılarak bir 50 ml tüp içinde hücreler toplayın.
  4. Hücre sayısı belirleyin ve az 5 dakika boyunca hücrelerinin gerekli sayıda (2x 10 9 hücrelerin azami sayıda LS Sütun başına yüklenmiş olabilir. Hücre hattı belirli optimum numaralarını tespit edilmeli ve oldukça düşük olabilir Miltenyi protokolüne göre.) Santrifüj 300 xg ve 4-8 ° C'de Tamamen süpernatant aspire.
  5. 350 ul MACS tamponu ile 1x 10 8 hücre azami (yüksek hücre numaraları buna göre aşağıdaki tüm MACS tamponu büyütmek, FCR Engelleme Reaktif, CD133/1-Biotin ve anti-Biotin microbeads birimler için) tekrar.
  6. 100 ul FCR Engelleme Reaktif ekleyin.
  7. 50 ul CD133/1-Biotin ekleyin. 4-8 bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın ° C fya da 10 dk.
  8. 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire.
  9. Yıkama adımı (4.8) tekrarlayın
  10. 400 ul MACS tamponu ile tekrar süspansiyon hücre pelletini.
  11. 100 ul anti-biotin mikro-küreler ekleyin. 15 dakika boyunca 4-8 ° C'de bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın.
  12. Bu arada, manyetik ayırma için MACS ayırıcı hazırlamak. MACS Ayırıcı Çoklu Stand QuadroMACS takın. QuadroMACS bir manyetik alanda ön sütun kanatlarıyla LS sütun gerekli sayıda yerleştirin. Her sütun altında her bir LS kolon ve uygun bir toplama tüpü (15 ml, 50 ml) içine bir ön ayırma filtresi (30 um Naylon filtre) yerleştirin. 3 ml MACS tamponu ile durulama filtre ve sütun hazırlayın. Flow-through atın.
  13. 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire.
  14. 500 ul hücreler süspanseMACS Pre-Ayırma Filtre ile LS kolona hücre süspansiyonu tampon ve uygulamak.
  15. Sütun başına 3 ml MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Sütun haznesi boşaldığında Sadece yeni bir tampon ekleyin.
  16. Hücre fraksiyonu - toplanan toplam atık etiketsiz CD133 içerir.
  17. Pre-Ayırma Filtre atın, ayırıcı gelen sütunu kaldırmak ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin.
  18. 5 ml MACS tamponu uygulayın. Hemen sıkıca sütuna pistonu iterek etiketli CD133 + hücreler dışarı floş.
  19. Negatif fraksiyonunun saflığı arttırmak için, QuadroMACS yerleştirilen yeni bir LS dengelenmiş sütun üzerine hücre süspansiyonu uygulanır. Fraksiyon - atık CD133 içerir.
  20. Sütunlar atın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tümör dokusu tek-hücrelerinin hazırlanması

Şekil 2 (A) ve (B) mekanik ayrışma sonra 2-4 mm parçalar halinde önce bir geç evre melanom hastasının rezeke lenf nodu metastazı örneğidir. Bir 70 mikron naylon ağ gözünden doku ve süzme enzimatik ayrılma sonrasında, hücreler peletlenmiş ve süpernatan atılır. Bu aşamada biz Şekil 2C hücre pelet kırmızımsı bir renk ile belirtilen eritrositler ile yüksek kirlilik gözlenmiştir. Daha sonra, biz açık kahverengi renk (Şekil 2B) bir hücre pelet sonuçlandı kırmızı kan hücreleri, tükenmiş. Bu hücreler, 37 yeniden asıldı ve Quantum 263 orta ile kültüre edildi ° C ve% 5 CO2.

Birincil hücre kültürleri ve Karakterizasyonu

Hücreler tümör kaynaklı olmadığını doğrulamak için değil, stroma çevredeki, RT-PCR uygulandımelanocyte/melanoma- arasında fibroblast, dendritik ve kök hücre işaretleyici gen. Yetişkin melanosit TYR ve kök hücre belirteci CD133 için pozitif kontrol olarak embriyonik karsinoma hücre hattı NCCIT için normal kontrol hücreleri olarak görev yaptı. Şekil 3'te gösterildiği PCR sonuçları, bazı primer hücrelerin melanositik kökenli gerçekten vardır (TYR için pozitif) ve olgun dendritik hücrelerin (CD83) ve işaretleyici için negatif olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, melanom hücre çizgileri ekspres CD133, asimetrik hücre bölünmesi ve bilinen bir kanser kök hücre işaretleyici için çok önemli bir gen tespit edilmiştir. HPRT yükleme kontrol olarak kullanılmıştır.

CD90 ve yüksek ifadeyi (sol Şekil 3, üst panel) ile gösterildiği gibi Başlangıçta, birincil hücre kültürü de fibroblastlar ile yüksek kirlenme içeriyordu.

Fibroblast tükenmesi takiben, bu hücre kültürü sadece TYR bulunan + melanom hücres ve daha fazla fibroblast (CD90 -) (Şekil 3, sol, alt panel). Şekil 4'te gösterildiği gibi fibroblastların yokluğu, aydınlık alan mikroskopi ile teyit edilebilir.

Manyetik CD133 tasnif hücreli + ve CD133 - melanom hücrelerinin

Hücreler - RT-PCR ile belirtildiği gibi CD133 ekspresyonu gösteren İlköğretim melanom hücrelerinin, CD133 + ve CD133 ayrılabildiği. Değiştirilmiş dolaylı CD133 mikroboncuk Kit, bir yüksek saflık (>% 99.75) için protokol ve CD133 verim ile + ve CD133-fraksiyonları, hem de sıralama sonra, elde edilir ve her iki fraksiyonu ve bir yüksek canlılığı. Şekil 5A ve B 'de gösterildiği gibi sıralama etkinliği ve saflığı her zaman immunofluoresence boyama veya western blot analizi ile doğrulanması gerekir.

Şekil 1 Şekil 1. Deneme Genel düzeni. Primer melanom hücre kültürü ve CD133 + olası kanser kök hücrelerinin izolasyonu DNaz I ve kollajenaz IV ve GentleMACS Dissociator bir ayrışma karışımı kullanarak tümör hücrelerinin mekanik ve enzimatik ayrışma tarafından izlenen bir tümörün rezeksiyonu içerir. Tümör hücrelerinin yüksek kırmızı kan hücreleri ile kirlenmiş olan, bir eritrosit tükenmesi adım tavsiye edilir. Kültürlü hücreler, daha sonra da birinci melanom hücreleri olup olmadığını teyit etmek için mikroskobik ve RT-PCR analizi ile karakterize edilmelidir. CD90 ekspresyonu ile gösterilir fibroblast ile yüksek kontaminasyon Miltenyi anti-fibroblast mikroboncukları kullanılarak fibroblast tükenmesi kaldırılabilir. Nihayet, CD133 + ve CD133-melanom hücrelerinin Miltenyi gelen Dolaylı CD133 Mikro-Boncuk Kiti insan kullanarak fraksiyonlara olabilir. Sıralama sonra, saflık onaylanır ve CD133 + bird CD133-melanom fraksiyonlar yan yana analiz edilebilir.

Şekil 2,
Şekil 2. Tümör dokusu tek-hücreli hazırlanması. A:. Tekli hücrelere kesilmeden önce bir rezeke melanom metastazı Örnek B: İki steril neşter kullanılarak 2-4 mm parçalar halinde tümör dokusunun mekanik ayrışma sonrasında Melanom metastazı C:.. Yüksek kırmızı kan hücrelerinin D ile kontamine tek hücre Pelet : Eritrosit tüketimi sonrası tek hücre Pelet.

Şekil 3
Şekil 3,. Primer hücre kültürlerinin İfade analizi. Melanin üretimi (TYR), fibroblast işaretleyici (CD90), dendritik hücre işaretleyici (ilişkili genlerin RT-PCR analizi CD83) ve asimetrik hücre bölünmesi (CD133) için önemli genlerin başlangıçta, primer hücre kültürü CD133 içerdiğini + melanom hücrelerinin (TYR +) ve hiçbir dendritik hücrelerin (CD83-) gösterdi ama çok fibroblastlar (CD90 +) (sol, üst panel) ile kontamine olmuş . Aşağıda fibroblast tükenmesi bu hücre kültürü sadece TYR + ve CD90-melanom hücrelerinin (sol, alt panel) içeriyordu. HPRT yükleme kontrol olarak kullanılmıştır. NCCIT ve yetişkin melanosit sırasıyla, CD133 ve TYR için pozitif kontrol olarak görev yaptı.

Şekil 4,
Şekil 4. Fibroblast tükenmesi öncesi ve sonrası primer hücre kültürleri Mikrografikleridir. A: Primer hücre kültürü aydınlık mikrografı derece fibroblast ile kontamine B:. Fibroblast tükenmesi sonrasında aynı primer melanom hücre kültürü aydınlık mikrografı.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 5,
Şekil 5,. Immünofloresan boyama ve kurutma batı yoluyla MACS doğrulanması. A: melanom hücrelerinin İmmünofloresan mikroskop Miltenyi dan aktarmalı CD133 microbead Kit ile sıralama sonra 24 saat. Hücreler kapak slipi üzerinde ekilmiş ve Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile inkübasyonu takiben CD133 / 1 (W6B3C1) adı geçen antikor ile boyandı. Sadece CD133 + fraksiyonu içinde hücre membranında belirli bir sinyal beyaz oklar (sol panel) ile gösterildiği gibi tespit edilmiştir. CD133-hücrelerin protein (sağ panel) varlığı için leke yoktu B:. Blotting kantitatif floresan batı göre sıralama saflık Onay. Çok zayıf bir CD133 ifade inci gözlenmedi güçlü bir sinyal CD133, CD133 + fraksiyonunda saptanmıştırE CD133-nüfus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tümör hücre pelet eritrosit kontaminasyonu kaldırmak için biz son derece Miltenyi gelen kırmızı kan hücre lizis çözüm kullanmanızı öneririz. Geleneksel Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj üzerine eritrositlerin parçalayıcı avantajları, daha hızlı ve daha basit olmasıdır. Ayrıca, Ficoll ve kırmızı kan hücreleri ve tümör hücreleri kaybı ile kirlilikler önlenir. Çok uzun beklerken normalde tümör hücrelerinin Overgrow beri primer hücre kültürü fibroblastların büyümesini gözlemlemek zaman onlar derhal çıkarılmalıdır.

Miltenyi en MACS tekniği ile hücre sıralama yaparken biz enzimatik hücrelerinin toplanması önerilir. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ve bunların yüzey epitoplara nazik olabilir, ama MACS sütunlara nonspesifik bağlamak ve sütunları yapışmasına hücre parçaları da üretecektir. Geleneksel tripsin / EDTA ile muamele üzerine Accutase avantajları azaltılmış hücre stres, Lea içerirgeliştirilmiş canlılık ve hücre kültürleri içine adventif ajanlar tanıtan minimize riski ding. Accutase hazırlama herhangi memeli ya da rekombinant bakteriyel proteinler 28 içermez.

Hücre yüzeyi ve hücre spesifik olmayan bir etiketleme üzerine antikor kapaklama önlemek için, hızlı çalışma hücreler soğuk tutmak ve önceden soğutulmuş çözümler kullanmak gerekir. Daha düşük sıcaklıklarda inkübasyon süreleri arttırmak olabilir çünkü tüm inkübasyon aşaması ° C, ancak buz üzerinde 2-8 gerçekleştirilmelidir. Sütun başına ideal bir cep numarası her yeni hücre kültürü için tespit edilmelidir. Bizim laboratuvar biz 4x 10 7 hücre maksimum hücre sayısı LS sütun başına uygulanabilir melanom hücre hatları ile çalıştı. MS sütunları Bu hücre tipi için hiç işe yaramadı. Çok büyük hücreler için Miltenyi da yerine kullanılması gereken büyük hücreli sütunlar içerir.

Miltenyi tarafından tavsiye edilen MACS tamponu, 2 mM EDTA ve PBS içinde% 0.5 BSA içerir. Bir yoluyla azalma varsamanyetik ayırma görülmektedir sonra hücreler, mobilite, bu BSA ve / veya EDTA tampon içinde bağlı olabilir. Hücre canlılığı BSA artırmak için, genellikle daha iyi BSA, daha iyi tolere olan% 5 FCS ile değiştirilebilir. MACS tampon EDTA hücrenin canlılığı artırmak için ancak% 2-3 sıralama saflık azalacak atlanabilir.

Sütun dengelemek için kullanılan MACS tampon atılmalıdır. Onu hücrelere zarar verebilir çünkü bu alışım çözüm kriteri hücreleri toplamak için tavsiye edilmez. Bunun yerine, sıralanmış hücreleri doğrudan doğruya sıralama sonra hücreler stabilize etmek için kültür ortamı ile birlikte bir tüp içinde toplanmalıdır.

Sütun tıkanmasını önlemek için, bir 30 mikron naylon elekten (= Ön ayırma filtreleri) içinden geçen hücreler tarafından manyetik ayırma önce tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için önemlidir. Taze, dengelenmiş LS sütun hatta LD sütunu boyunca negatif fraksiyonu, ikinci bir çalışma saflığı arttırmak için(= Hücrelerinin tükenmesi) için önerilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar bu işi desteklemek ve eleştirel bir yazının okunması için M. Dietel ve Dirk Schumacher ederim.

Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt ° 115234, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve EFPIA şirketlerin 'in mali katkı oluşmaktadır hangi kaynaklardan destek aldı Ayni katkı. Bu çalışma aynı zamanda Berliner Krebsgesellschaft (BKG) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter