Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

संवर्धित कोशिकाओं से क्रोमोजोम तैयारी

Published: January 28, 2014 doi: 10.3791/50203
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics, Louisiana State University Health Science Center

Summary

गुणसूत्रों ऐसे लिम्फोसाइट या त्वचा fibroblasts के रूप में जीवित कोशिकाओं से अलग, और मनुष्य या चूहों सहित जीवों से किया जा सकता है. ये गुणसूत्र तैयारी आगे दिनचर्या जी बैंडिंग और ऐसे स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH), और वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) के रूप में आणविक cytogenetic प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Abstract

गुणसूत्र (cytogenetic) विश्लेषण व्यापक रूप से गुणसूत्र अस्थिरता का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. जी बैंडिंग और ऐसे स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति के रूप में आणविक तकनीक के द्वारा पीछा किया जाता है, इस परख के लिए एक या अधिक गुणसूत्रों को शामिल जीनोम और rearrangements के अंश का लाभ या हानि शामिल है aberrations के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली क्षमता है. मनुष्यों में गुणसूत्र असामान्यताओं लगभग 1 160 प्रति जीवित जन्मों 1,2, सभी गर्भपात की 60-80% में होते 3,4, मृत प्रसव का 10% 2,5, जन्मजात हृदय रोग 6, 3-6% के साथ व्यक्तियों के 13% बांझपन के मामलों की 2, और विकासात्मक देरी और जन्म दोष 7 के साथ कई रोगियों में. क्लोनल गुणसूत्र असामान्यताओं की टिप्पणियों दोनों नैदानिक ​​और शकुन महत्व 8,9 के लिए दिखाया गया है के रूप में दुष्टता की cytogenetic विश्लेषण नियमित तौर पर, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों द्वारा किया जाता है.60; क्रोमोजोम अलगाव जीन थेरेपी के लिए अमूल्य है और nonhuman primates और कृन्तकों 10-13 सहित जीवों की स्टेम सेल अनुसंधान.

गुणसूत्रों रक्त लिम्फोसाइटों, त्वचा fibroblasts, amniocytes, नाल, अस्थि मज्जा, और ट्यूमर नमूनों सहित रहते ऊतकों की कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है. वे सबसे अधिक सघन और इसलिए अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जब गुणसूत्रों, पिंजरे का बँटवारा की मेटाफ़ेज़ स्तर पर विश्लेषण कर रहे हैं. गुणसूत्र अलगाव तकनीक की दिशा में पहला कदम बाद पश्चावस्था चरण के लिए आगे बढ़ने से कोशिकाओं को रोकने के लिए Colcemid साथ ऊष्मायन द्वारा धुरी फाइबर के विघटन, शामिल है. कोशिकाओं तो एक hypotonic समाधान के साथ इलाज किया और Carnoy लगानेवाला साथ उनके सूजन राज्य में संरक्षित कर रहे हैं. कोशिकाओं तो स्लाइड पर गिरा रहे हैं और उसके बाद की प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए उपयोग किया जा सकता है. जी बैंडिंग विशेषता प्रकाश और अंधेरे बैंड बनाने के लिए Giemsa साथ धुंधला हो जाना द्वारा पीछा trypsin उपचार शामिल है. एक ही जनसंपर्कगुणसूत्रों को अलग करने ocedure ऐसे स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH), और वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) 14,15 के रूप में प्रक्रियाओं के लिए कक्षों की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

क्रोमोजोम विश्लेषण गुणसूत्र अस्थिरता और आनुवंशिक विकारों और दुष्टता 1,2,8,9 के लिए अग्रणी rearrangements निदान करने के लिए दुनिया भर में उपयोग किया एक पारंपरिक तकनीक है. इसके अलावा, संवैधानिक और कैंसर का अधिग्रहण आनुवंशिक असामान्यताएं के निदान और अनुसंधान के लिए एक उच्च संकल्प ऐसे स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति (मछली) के रूप में शास्त्रीय cytogenetic प्रक्रियाओं और आणविक cytogenetic के तरीके के संयोजन, तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) के साथ प्राप्त किया जा सकता है , और वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) 14,15. हाल ही में, इन तकनीकों स्टेम सेल अनुसंधान के साथ जुड़े गुणसूत्र अस्थिरता के मूल्यांकन के लिए उपयोग किया गया है. इस तरह लंबे समय तक संवर्धित भ्रूण कोशिकाओं (ते) और विभिन्न जीवों के वयस्क स्टेम कोशिकाओं की aneuploidy रूप Karyotypic असामान्यताएं कई प्रयोगशालाओं द्वारा सूचित किया गया है. हाल ही में सबूत कुछ सेल लाइनों स्वाभाविक गुणसूत्र instabi के लिए इच्छुक हैं कि समर्थन करता हैपरवाह किए बिना संस्कृति की स्थिति की lity. स्थापना और / या मानव, माउस, या रीसस स्टेम सेल लाइनों को बनाए रखने के लिए जब इस कारण से, गुणसूत्र विश्लेषण गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के हिस्से के रूप में सिफारिश की है. कई रिपोर्टों संस्कृति 10-13 में स्टेम कोशिकाओं और घातक कोशिकाओं या विभिन्न जीवों के गुणसूत्र स्थिरता पर नजर रखने के लिए नियमित और आणविक कोशिकाजननप्रकरण के उपयोग में बढ़ती रुचि का वर्णन. इन प्रोटोकॉल तेजी से अपने संवर्धित कोशिकाओं 13 की तेजी गुणसूत्र मूल्यांकन के लिए nongenetic प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा है. हम विभिन्न जीवों से निकाली नैदानिक ​​और अनुसंधान प्रयोजनों और कोशिकाओं दोनों के लिए लागू किया जा सकता है, जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से गुणसूत्र तैयार करने के लिए हमारी बुनियादी प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. पक्षपाती कोशिकाओं के गुणसूत्र कटाई

  1. मानक प्रोटोकॉल
    1. विशिष्ट कोशिका संवर्धन शर्तों के अनुसार कोशिकाओं को विकसित. कोशिकाओं लघुगणक चरण (80% confluency) तक पहुँच चुके हैं, सेल संस्कृति फ्लास्क Colcemid के 10 μl / मिलीलीटर जोड़ें. 2 x 10 6 कोशिकाओं की एक न्यूनतम सिफारिश की है.
    2. 45 मिनट के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं. एक बाँझ विंदुक का प्रयोग, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं से मीडिया को हस्तांतरण. अलग निर्धारित करें.
    3. धीरे कुप्पी में HBSS बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं धो लो. भंवर बफर और फिर एक पिपेट का उपयोग कर हटा दें. त्यागें.
    4. यह कुप्पी की पूरी सतह को शामिल किया गया है कि यह सुनिश्चित करने, trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें. के बारे में केवल 2 मिनट के लिए trypsin में कोशिकाओं को छोड़ दें. कोशिकाओं के बहुमत अलग कर लेने के बाद, पीठ कोशिकाओं पर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया विंदुक.
    5. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर aliquots में सेल निलंबन स्थानांतरण.10 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली resuspend.
    6. शंक्वाकार ट्यूब में शेष गोली के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed किया गया है जो 0.075 एम KCl की 10 मिलीलीटर जोड़ें. KCl और कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए मध्यम गति से भंवर ट्यूब.
    7. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं. 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और resuspend गोली (लगभग 0.5 मिलीलीटर रहता है जब तक) पर तैरनेवाला निकालें.
    8. Vortexing जबकि कोशिकाओं को: ध्यान से ताजा Carnoy लगानेवाला के 5 एमएल (हिमनदों एसिटिक एसिड मेथनॉल के 3:1 के अनुपात) जोड़ें. फिर 10 मिलीलीटर की कुल के लिए vortexing बिना लगानेवाला के अधिक 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    9. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. प्रत्येक ट्यूब लगानेवाला के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    10. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. प्रत्येक ट्यूब लगानेवाला के 5 मिलीलीटर जोड़ें. कोशिकाओं को अब एक वर्ष के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है.
  2. प्रोटोकॉल के लिए संशोधन: क्रोमोजोम harvestilymphoblastoid सेल लाइनों की एनजी
    1. विशिष्ट कोशिका संवर्धन शर्तों के अनुसार कोशिकाओं को विकसित. (प्रयोग कोशिकाओं सुसंस्कृत होने का राशि के लिए उपयुक्त फ्लास्क). कोशिकाओं लघुगणक चरण (कोशिकाओं विभाजित कर रहे लगभग 2 दिनों के बाद) तक पहुँच चुके हैं, सेल संस्कृति फ्लास्क Colcemid के 10 μl / मिलीलीटर जोड़ें.
  3. प्रोटोकॉल के लिए संशोधन: पूरे रक्त से क्रोमोजोम कटाई
    Phytohemagglutinin (पीएचए), लाल मूंग से व्युत्पन्न एक लेक्टिन, मानव टी कोशिकाओं 16 के लिए एक शक्तिशाली माइटोजन है. 72 घंटा संस्कृति को पीएचए के बाद इसके अलावा, कोशिकाओं के बारे में 45% एस चरण में हैं. इस शिखर mitotic गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है, और गुणसूत्र के अध्ययन के लिए फसल के लिए, जिस पर इष्टतम बिंदु है. बी कोशिकाओं 17,18 विश्लेषण करते समय ऐसे pokeweed (1-10 ग्राम / एमएल) के रूप में अन्य mitogens इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. एक हरे रंग की शीर्ष सोडियम हेपरिन ट्यूब में पूरे रक्त की कम से कम 1 मिलीलीटर लीजिए. संग्रह के बाद 3 दिन के भीतर प्रयोग करें. आरटी संयुक्त राष्ट्र में स्टोर खूनउपयोग करने के लिए तैयार टिल.
    2. विभाज्य एल glutamine (20% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% fungizone, और 1% पीएचए) युक्त पूरा RPMI मीडिया के 10 एमएल में पूरे रक्त का 0.25 मिलीलीटर. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति.
  4. प्रोटोकॉल के लिए संशोधन: अस्थि मज्जा से क्रोमोजोम कटाई
    एक chromosomally असामान्य क्लोन का अवलोकन ल्यूकेमिया की एक विशिष्ट प्रकार के लिए निदान हो सकता है के रूप में अस्थि मज्जा पर cytogenetic विश्लेषण कई घातक hematologic रोगों में उपयोगी है. क्रोमोजोम पढ़ाई भी इस तरह के विस्फोट संकट और उपचार के जवाब की शुरुआत के रूप में रोग प्रगति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को सक्रिय रूप से विभाजित कर रहे हैं, कोई माइटोजन उत्तेजना आवश्यक 9,19 है. तीव्र ल्यूकेमिया के लिए 24 और 48 घंटा संस्कृतियों भी स्थापित कर रहे हैं.
    1. एक हरे रंग की शीर्ष सोडियम हेपरिन ट्यूब में अस्थि मज्जा की कम से कम 1 मिलीलीटर लीजिए. एल glutamine (2 युक्त पूरा RPMI मीडिया के 10 एमएल में अस्थि मज्जा की अशेष 0.25 मिलीलीटर0% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% fungizone). 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति.

2. स्लाइड तैयार और ठोस धुंधला

एक प्रतिनिधि स्लाइड की एक तेजी से मूल्यांकन इस तरह जी बैंडिंग, मछली, CGH, या आकाश के रूप में आगे की प्रक्रियाओं को आगे बढ़ने से पहले फसल की गुणवत्ता के बारे में जानकारी प्रदान करेगा. कुछ प्रयोगशालाओं ठोस दाग को तेजी से कटाई और गुणसूत्र मूल्यांकन के लिए कोशिकाओं को पसंद करते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक चरण विपरीत खुर्दबीन इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्लाइड्स सबसे अच्छा नमी लगभग 50% है जब तैयार है और तापमान परिवेश (20-25 डिग्री सेल्सियस) कर रहे हैं.

  1. 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र केवल 0.3-0.5 मिलीग्राम रहता है जब तक सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  2. बाद धीरे लगभग 45 डिग्री के कोण पर झुका हुआ है और निलंबन की अनुमति है जो एक स्लाइड पर लगभग 2 में से एक दूरी से सेल निलंबन की गोली, पिपेट तीन बूँदें resuspendingस्लाइड भर में रोल करने के लिए. स्लाइड पर ताजा Carnoy लगानेवाला की एक बड़ी गिरावट जोड़ें.
  3. एक कागज तौलिया पर स्लाइड के पीछे सूखा और फिर कम से कम 10 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए बाहर स्लाइड बैठते हैं. स्लाइड पूरी तरह से सूखा होना चाहिए.
  4. ताजा Giemsa धुंधला समाधान (गुर बफर और Giemsa दाग की 3:1 के अनुपात) तैयार करें. एक धुंधला रैक पर स्लाइड रखें. Giemsa धुंधला समाधान में पूरे स्लाइड कवर. स्लाइड 5 मिनट के लिए धुंधला समाधान में रहते हैं. आसुत जल के साथ स्लाइड्स कुल्ला नाली, और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं.
  5. 4 Permount की बूंदों और स्लाइड के लिए एक कवर पर्ची जोड़ें. यकीन coverslip के तहत कोई बुलबुले हैं. अतिरिक्त Permount एक कागज तौलिए से हटाया जा सकता है.
  6. 10X और 100X बढ़ाई के तहत एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण. मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं प्रचुर मात्रा में और अच्छी तरह से फैल रहे हैं, शेष स्लाइड्स अन्य प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. जी बैंडिंग trypsin और Giemsa (GTG) का उपयोग करना

<p> Trypsin उच्च transcriptional गतिविधि जिसके परिणामस्वरूप के साथ डीएनए क्षेत्रों में euchromatic histones denatures जो एक proteolytic एंजाइम है. Giemsa धुंधला के बाद इन क्षेत्रों प्रकाश बैंड के रूप में दिखाई देगा. कम या कोई transcriptional गतिविधि (हेट्रोक्रोमैटिन) के साथ बेहद सघन chromatin trypsin से संरक्षित इसके histones का एक बड़ा हिस्सा होगा और इसलिए Giemsa धुंधला निम्नलिखित अंधेरे में दाग होगा. यह शुरू में जी बैंड एक स्लाइड की स्थिति पर नजर रखने और यदि आवश्यक हो तो बाद में स्लाइड्स के लिए trypsin समय को समायोजित करने के लिए आवश्यक है.

  1. 4 Coplin जार के लिए निम्न समाधान जोड़ें.
    जार # 1 1x HBSS के = 30 मिलीग्राम और 10x trypsin के 4 मिलीलीटर (0.5%)
    1x HBSS के जार # 2 = 50 मिलीलीटर
    जार # 3 = 1x HBSS के 45 मिलीग्राम और भ्रूण गोजातीय सीरम के 5 मिलीलीटर
    1x HBSS के जार # 4 = 50 मिलीलीटर
  2. , 5 सेकंड के लिए जार # 1 में प्रत्येक स्लाइड, जार # 2 में त्वरित कुल्ला विसर्जित कर दिया, कम से कम 30 सेकंड के लिए जार # 3 में जार # 4 में त्वरित कुल्ला प्रत्येक स्लाइड छोड़ तो स्लाइड्स शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
  3. Fres तैयार करेंज Giemsa धुंधला समाधान (गुर बफर और Giemsa दाग की 3:1 के अनुपात). एक धुंधला रैक पर स्लाइड रखें. Giemsa धुंधला समाधान में पूरे स्लाइड कवर. स्लाइड 5 मिनट के लिए धुंधला समाधान में रहते हैं.
  4. वे दाग रहे थे कि उसी क्रम में आसुत जल में स्लाइड्स कुल्ला. स्लाइड्स के बारे में 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. स्लाइड पूरी तरह से सूखा होना चाहिए.
  5. 4 Permount की बूंदों और स्लाइड के लिए एक कवर पर्ची जोड़ें. यकीन coverslip के तहत कोई बुलबुले हैं. अतिरिक्त Permount एक कागज तौलिए से हटाया जा सकता है.
  6. 10X और 100X बढ़ाई के तहत एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण. पहली स्लाइड के परिणामों पर आधारित स्लाइड के बाकी के trypsin समय को समायोजित.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

उच्च गुणवत्ता मेटाफ़ेज़ फैलता गुणसूत्र विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं. एक सफल परख अच्छी तरह से फैला है और उपयुक्त गुणसूत्र आकारिकी की कर रहे हैं, जो क्रोमोसोम पैदावार. ठीक से जी बंधी गुणसूत्रों विशेषता प्रकाश और अंधेरे बैंडिंग पैटर्न होते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. गुणसूत्रों औसत लंबाई के होते हैं, जिसमें एक सफल गुणसूत्र फैला है, अच्छी तरह से फैला है और आसानी से एक दूसरे से आचार, और प्रकाश और अंधेरे बैंड के बीच पर्याप्त विपरीत. अच्छा गुणसूत्र आकारिकी संकेत किसी भी rearrangements के लिए व्यक्तिगत क्रोमोसोम और मूल्यांकन की पहचान के लिए अनुमति देता है गुणसूत्र अस्थिरता की.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम विभिन्न मानव से प्राप्त प्रकार की कोशिकाओं, रीसस मकाक, चूहों, और चूहों 11,20-22 सहित विभिन्न जीवों की कोशिकाओं से गुणसूत्र अलगाव के लिए वर्तमान प्रक्रिया का उपयोग किया है. मानक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण कदम है और चर कोशिकाओं के इन विविध प्रकार के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. कई विशेष कदम गुणसूत्र तैयारी और परिणाम के सर्वोत्तम संभव गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए जी बैंडिंग दोनों में महत्वपूर्ण हैं. परख प्रभावित कर सकते हैं जो चरों के एक Colcemid ऊष्मायन समय है. Colcemid में अपर्याप्त समय कम मेटाफ़ेज़ फैलता है और लंबे समय तक, छा गुणसूत्रों पैदावार. Colcemid में अब ऊष्मायन बार का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हैं, जो छोटे और मोटा गुणसूत्रों में परिणाम होगा. एक अन्य महत्वपूर्ण चर hypotonic समाधान के molarity है. एक 0.075 एम पोटेशियम क्लोराइड समाधान सिर्फ पर्याप्त कोशिकाओं lysing बिना, प्रसार उचित गुणसूत्र उपज के लिए कोशिकाओं को प्रफुल्लित होगा. जोड़ने के दौरानजबकि मिश्रण Carnoy लगानेवाला समाधान, पहले 5 मिलीलीटर गोली जोड़ा जाना चाहिए. इस अतिरिक्त प्रोटीन के सभी नमूने संग्रहीत करने या स्लाइड तैयार करने से पहले हटा रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है. कोशिकाओं काफी अच्छी तरह से मिश्रित नहीं कर रहे हैं कि मामले में अगर, एक पीला प्रोटीन टोपी बाद की प्रक्रिया के दौरान जटिलताएं पैदा कर सकता है, जो गोली के शीर्ष पर बनेगी.

उचित स्लाइड तैयार करने के लिए आवश्यक है. स्लाइड पर resuspended सेल गोली छोड़ने जबकि, स्लाइड लगभग 45 डिग्री कोण तक झुका हुआ है कि बनाना और क्रोमोसोम ठीक से विश्लेषण के लिए स्लाइड पर फैलाने सकता है कि इतना पर्याप्त दूरी (कम से कम 2 इंच) स्लाइड में ड्रॉपर से है . लगानेवाला तुरंत स्लाइड पर कोशिकाओं छोड़ने के बाद के साथ स्लाइड बाढ़ भी प्रसार करने के गुणसूत्रों में मदद मिलेगी. सेल निलंबन स्लाइड करने पर सूख जाता है कि कितनी तेजी से प्रभावित करती है जो तापमान और आर्द्रता, प्रसार गुणसूत्र को प्रभावित करने वाले अन्य कारक हैं. ये हो सकता है लगभग 50% आर्द्रता और के बारे में 20-25 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक वातावरण में स्लाइड्स की तैयारी द्वारा नियंत्रित है, और / या तेजी से सुखाने के लिए गर्म एक स्लाइड पर स्लाइड रखकर. जी बैंडिंग के लिए, गुणसूत्रों की गुणवत्ता को प्रभावित करता है कि मुख्य कारक trypsin जोखिम बार है. एक लंबे समय तक trypsin जोखिम के साथ, गुणसूत्रों दूर तक फैला हुआ है और सूजन दिखाई दे सकते हैं. इसके विपरीत, एक अपर्याप्त कम trypsin ऊष्मायन अप्रभेद्य बैंड और थोड़ा विपरीत के साथ गुणसूत्रों निकलेगा. trypsin ऊष्मायन समय प्रत्येक विशेष सेल लाइन और कटाई की स्थिति के आधार पर परिवर्तन के अधीन है. इसलिए, एक प्रतिनिधि जी बंधी स्लाइड पहली स्लाइड के बाकी धुंधला पहले trypsin की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए तैयार रहना चाहिए. भ्रूण गोजातीय सीरम पूर्व धुंधला करने trypsin गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम Giemsa (GTG) का उपयोग प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, लेकिन राइट के दाग GTW बैंडिंग और पैदावार इसी तरह के परिणाम के लिए बजाय Giemsa का इस्तेमाल किया जा सकता है.

टी "> इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती और प्रभावी है. जी बैंडिंग ऐसे सामान्यतः दुर्दमताओं, आनुवंशिक विकार में देखा जाता है जो अनुवादन, हटाना, और Aneuploidy के रूप में गुणसूत्र असामान्यताओं का पता लगाने के लिए, और इन विट्रो 10,11 में सुसंस्कृत स्टेम कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , 13. इस गुणसूत्र के संविधान और कई कक्षों में पूरे जीनोम की वैश्विक मूल्यांकन के अपरिहार्य दृश्य प्रदान करता है. यह आमतौर पर कैंसर की कोशिकाओं में 10. प्रसव पूर्व और के निदान, रोग का निदान, और चिकित्सीय के मूल्यांकन के लिए दुनिया भर में नैदानिक ​​और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है प्रसव के बाद ऊतक के नमूने नियमित रूप से ऐसे डाउन सिंड्रोम के रूप में आनुवंशिक विकारों के कारण जो संख्यात्मक और संरचनात्मक असामान्यताएं की पहचान के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. स्टेम सेल तेजी से गुणसूत्र अस्थिरता की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि, जी बैंडिंग के संकल्प की पहचान के लिए सीमित है के रूप में metas में देखा microdeletions या जटिल गुणसूत्र असामान्यताएंtatic दुर्दमताओं.

दिनचर्या गुणसूत्र जी बैंडिंग ऐसे स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH), और वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) के रूप में प्रक्रियाओं के साथ पूरक है इसलिए, जब गुणसूत्र असामान्यताओं का पता लगाने की दर नाटकीय रूप से 23 से बढ़ रहे हैं. इस कारण से, इन अन्य आणविक cytogenetic प्रक्रियाओं के साथ संयोजन में मौजूद प्रोटोकॉल का उपयोग तेजी से नैदानिक ​​अनुसंधान और दोनों 13-15 सेटिंग में गुणसूत्र अस्थिरता के मूल्यांकन के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में वर्णित काम पैट्रिक एफ टेलर फाउंडेशन से धन के द्वारा संभव बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
  2. Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
  3. Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
  4. Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
  5. Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
  6. Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
  7. Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
  8. Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
  9. Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
  10. Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
  11. Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
  12. Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
  13. Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
  14. Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
  15. Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
  16. Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  17. Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
  18. Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
  19. Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
  20. Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
  21. Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
  22. Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
  23. McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).

Tags

बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 83 गुणसूत्र cytogenetic कटाई कुपोषण प्रतिदीप्ति मछली
संवर्धित कोशिकाओं से क्रोमोजोम तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F.… More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter