Summary
Kromosomer kan bli isolert fra levende celler slik som lymfocytter eller hudfibroblaster, og fra organismer inkludert mennesker eller mus. Disse kromosompreparater kan videre benyttes for rutinemessig G-banding og molekylære cytogenetiske prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY).
Abstract
Kromosom (cytogenetisk) analyse er mye brukt for påvisning av kromosom ustabilitet. Ved etterfulgt av G-striper og molekylære teknikker som fluorescens in situ hybridisering (FISH), har denne analysen den kraftige evne til å analysere de enkelte celler for forstyrrelser som involverer gevinster eller tap av deler av genomet, og rearrangementer som omfatter en eller flere kromosomer. Hos mennesker, kromosomfeil forekommer hos ca 1 pr 160 levendefødte 1,2, 60-80% av alle spontanaborter 3,4, 10% av dødfødsler 2,5, 13% av personer med medfødt hjertesykdom 6, 3-6% av ufruktbarhet tilfeller to, og i mange pasienter med forsinket utvikling og fødselsskader 7. Cytogenetisk analyse av malignitet er rutinemessig brukt av forskere og klinikere, som observasjoner av klonale kromosomavvik har vist seg å ha både diagnostisk og prognostisk betydning 8,9.60; Kromosom isolasjon er uvurderlig for genterapi og stamcelleforskning organismer, inkludert ikke-menneskelige primater og gnagere 10-13.
Kromosomer kan bli isolert fra celler av levende vev, inkludert blod-lymfocytter, hudfibroblaster, amniocytes, placenta, benmargen, og vevsprøver. Kromosomene er analysert ved meta stadium av mitose, når de er mest kondensert og derfor mer synlig. Det første trinn i kromosomet isolasjon teknikken innebærer oppbrytning av spindefibre ved inkubasjon med Colcemid, for å hindre at celler fra å gå frem til det etterfølgende anaphase stadium. Cellene blir deretter behandlet med en hypoton løsning og bevart i sin utvidete form med Carnoy sin fikseringsmiddel. Cellene blir deretter slippes på ved sidene, og kan deretter benyttes for en rekke prosedyrer. G-banding omfatter trypsin behandling etterfulgt av farging med Giemsa å skape karakteristisk lys og mørke striper. Den samme procedure å isolere kromosomer kan anvendes for fremstilling av celler for prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) og spektral karyotyping (SKY) 14,15.
Introduction
Kromosomanalyse er en konvensjonell teknikk benyttes over hele verden til å diagnostisere kromosom ustabilitet og rearrangements fører til genetiske lidelser og malignitet 1,2,8,9. I tillegg kan en høyere oppløsning for diagnose og forskning av konstitusjonelle og kreft-ervervet genetiske avvik oppnås med en kombinasjon av de klassiske cytogenetiske prosedyrer og molekylære cytogenetiske metoder som fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) , og spektral karyotyping (SKY) 14,15. I den senere tid har disse teknikker blitt benyttet for evaluering av kromosom ustabilitet forbundet med stamceller. Karyotypic abnormaliteter som aneuploidy av langsiktige dyrkede embryonale celler (ES) og voksne stamceller av ulike organismer har blitt rapportert av flere laboratorier. Nyere bevis støtter at noen cellelinjer er iboende mer tilbøyelig til kromosom instabiLity uavhengig av kultur forhold. Av denne grunn, ved å etablere og / eller opprettholde menneske, mus eller Rhesus stamcellelinjer, er kromosom analyse anbefalt som en del av kvalitetskontrollen. Mange rapporter beskriver den økende interesse for bruk av rutinemessige og molekylære cytogenetikk å overvåke det kromosomale stabiliteten av stamceller og maligne celler eller forskjellige organismer i kulturen 10-13. Disse protokollene er i økende grad blir brukt av nongenetic laboratorier for rask kromosom vurdering av sine dyrkede celler 13. Vi presenterer våre grunnleggende prosedyrer for kromosom forberedelse fra ulike celletyper, som kan brukes for både klinisk og forskningsformål og celler som stammer fra ulike organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Kromosom Høsting av heftende celler
- Standard protokoll
- Grow celler i henhold til bestemte celledyrking forhold. Når cellene har nådd logaritmisk fase (80% konfluens), tilsett 10 ul / ml av Colcemid til cellekulturkolbe. Et minimum på 2 x 10 celler 6 er anbefalt.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 45 min. Ved hjelp av en steril pipette, overføre media fra cellene til en 15 ml konisk tube. Sett til side.
- Forsiktig vaske cellene ved tilsetning av 2 ml HBSS-buffer inn i kolben. Swirl buffer og deretter fjerne ved hjelp av en pipette. Kast.
- Tilsett 1 ml av trypsin, noe som sikrer at det dekker hele overflaten av kolben. Bare forlater cellene i trypsin i ca 2 min. Når størstedelen av cellene har frittliggende, pipettere mediet i det koniske røret tilbake på cellene.
- Overfør cellesuspensjonen i 10 ml aliquoter i 15 ml koniske rør.Sentrifuger ved 200 xg i 10 min. Fjern supernatant og resuspender pelleten.
- Tilsett 10 ml av 0,075 M KCl, som er blitt forvarmet til 37 ° C til den gjenværende pellet i den koniske tube. Vortex røret ved middels hastighet for å blande KCl og celler.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 10 min. Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved 25 ° C. Fjern supernatanten (til ca 0,5 ml restene) og resuspender pellet.
- Tilsett forsiktig 5 ml frisk Carnoy største Fixative (3:1 metanol: iseddik) til cellene, mens virvling. Deretter tilsett 5 ml flere av fikseringsmiddel uten å virvle i totalt 10 ml.
- Sentrifuger ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender celler. Tilsett 5 ml av fiksativ i hvert rør.
- Sentrifuger ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender celler. Tilsett 5 ml av fiksativ i hvert rør. Cellene kan nå lagres i 4 ° C i opp til ett år.
- Modifisering til protokoll: Kromosom harvesting av lymfoblastoide cellelinjer
- Grow celler i henhold til bestemte celledyrking forhold. (Bruk Flaske egnet for mengden av celler som dyrkes). Når cellene har nådd logaritmisk fase (ca. 2 dager etter at cellene er delt), tilsett 10 ul / ml av Colcemid til cellekulturkolbe.
- Modifisering til protokoll: Kromosom høsting fra fullblod
Fytohemagglutinin (PHA), en lectin avledet fra røde nyrebønne, er et kraftig mitogen for humane T-celler 16. 72 timer etter tilsetning av PHA til kulturen, ca 45% av cellene i S-fasen. Dette representerer den høyeste mitotisk aktivitet, og er det optimale punktet der å høste for kromosom studier. Andre mitogener som pokeweed (1-10 ug / ml) kan anvendes ved analyse av B-celler 17,18.- Samle minst 1 ml helblod i en grønn topp natriumheparin røret. Brukes innen 3 dager etter samlingen. Butikk blod ved RT unTil klar til bruk.
- Delmengde 0,25 ml helblod i 10 ml RPMI komplett medium inneholdende L-glutamin (20% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% Fungizone, og 1% PHA). Kultur ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Modifisering til protokoll: Kromosom høsting fra benmargen
Cytogenetisk analyse på benmargen er nyttig i mange maligne hematologiske lidelser som observasjon av en chromosomally unormal klone kan være diagnostisk for en bestemt type leukemi. Kromosom studier er også brukt for å vurdere sykdomsprogresjon eksempel utbruddet av blastkrise og respons på behandling. Siden benmargceller er aktivt å dele, er ingen mitogen stimulering nødvendig 9,19. For akutt leukemi 24 og 48 timers kulturer er også satt opp.- Samle minst 1 ml benmarg i en grønn topp natriumheparin tube. Delmengde 0,25 ml benmarg i 10 ml av komplette RPMI medier som inneholder L-glutamin (20% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% Fungizone). Kultur ved 37 ° C med 5% CO 2.
2. Slide Forberedelse og Solid Farging
En rask evaluering av én representant lysbilde vil gi informasjon om kvaliteten på avlingen før du fortsetter til ytterligere prosedyrer som for eksempel G-banding, FISK, CGH, eller SKY. Noen laboratorier foretrekker å solid flekken cellene for rask høsting og kromosom vurdering. Eventuelt kan et fasekontrastmikroskop anvendes for denne analysen. Slides er best forberedt når luftfuktigheten er ca 50% og omgivelsestemperatur (20-25 ° C).
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min ved 25 ° C. Fjern supernatanten til kun 0,3-0,5 ml restene.
- Etter forsiktig risting av pelleten, pipette tre dråper av cellesuspensjonen fra en avstand på omtrent 2 i på et lysbilde, som er skråstilt i en vinkel på omtrent 45 ° og lar suspensjonenå rulle over lysbildet. Legg en stor dråpe frisk Carnoy sin Fixative til lysbildet.
- Tørk baksiden av lysbildet på et papirhåndkle og deretter sitte raset ut til tørke i minst 10 min. Raset skal være helt tørr.
- Forbered frisk Giemsas Farging Solution (03:01 ratio på Gurr Buffer og Giemsa Stain). Plasser lysbildene på en flekker rack. Dekk hele lysbildet i Giemsa flekker løsning. La skinnene forblir i fargings oppløsningen i 5 minutter. Skyll lysbilder med destillert vann, avløp, og la det lufttørke.
- Tilsett 4 dråper Permount og et dekkglass til lysbildet. Pass på at det ikke er noen bobler under dekkglass. Det overskytende Permount kan fjernes med et papirhåndkle.
- Analyser celler med et lysmikroskop i henhold til 10X og 100X forstørrelse. Dersom metafase-celler er rikelig og godt spredt, kan de resterende lysbilder brukes til andre eksperimentelle prosedyrer.
Tre. G-banding Bruke Trypsin og Giemsa (GTG)
<p> Trypsin er et proteolytisk enzym som denatures euchromatic histoner i DNA regioner med høyere transcriptional aktivitet resulterer. Etter Giemsa flekker, vil disse regionene vises som lyse striper. Sterkt kondensert kromatin med liten eller ingen transkripsjonsaktivitet (heterochromatin) vil ha en stor del av dets histoner beskyttet fra trypsin og vil derfor sette flekker mørkt følgende Giemsa farging. Det er viktig å begynne med G-band ett lysbilde å overvåke forholdene og justere trypsin timing hvis det er nødvendig for de påfølgende lysbilder.- Legg til følgende løsninger til 4 Coplin krukker.
Jar # 1 = 30 ml 1 x HBSS og 4 ml av 10x trypsin (0,5%)
Jar # 2 = 50 ml 1x HBSS
Jar nr. 3 = 45 ml 1 x HBSS og 5 ml føtalt bovint serum
Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS - Fordyp hvert lysbilde i Jar # 1 for 5 sek, rask skylling i Jar # 2, la hvert lysbilde i Jar # 3 i minst 30 sek, rask skylling i Jar # 4 så la lysbilder tørke.
- Forbered fresh Giemsas Farging Solution (03:01 ratio på Gurr Buffer og Giemsa Stain). Plasser lysbildene på en flekker rack. Dekk hele lysbildet i Giemsa flekker løsning. La skinnene forblir i fargings oppløsningen i 5 minutter.
- Skyll lysbilder i destillert vann i samme rekkefølge som de ble farget. La skinnene tørke i ca 10 min. Raset skal være helt tørr.
- Tilsett 4 dråper Permount og et dekkglass til lysbildet. Pass på at det ikke er noen bobler under dekkglass. Det overskytende Permount kan fjernes med et papirhåndkle.
- Analyser celler med et lysmikroskop i henhold til 10X og 100X forstørrelse. Juster trypsin timing av resten av skinnene, basert på resultatene av den første lysbilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høy kvalitet metafase spreads er avgjørende for kromosomanalyse. En vellykket analysen gir kromosomer som er godt spredt og av egnet kromosom morfologi. Riktig G-båndede kromosomer inneholder den karakteristiske lyse og mørke båndmønstrene.
Figur 1. Vellykket kromosomal spredning hvori kromosomene er av gjennomsnittlig lengde, godt spredt og lett synlige fra hverandre, og tilstrekkelig kontrast mellom lys og mørke bånd. God morfologi kromosom gir mulighet for identifisering av de enkelte kromosomer og evaluering for eventuelle rearrangements indikative av kromosom ustabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har benyttet dagens prosedyre for kromosom isolert fra celler av ulike organismer, inkludert ulike celletyper hentet fra menneske, rhesus-aper, rotter og mus 11,20-22. Standarden protokollen er gitt, men enkelte viktige skritt og variabler kan være nødvendig å justere for disse ulike typer celler. Flere konkrete tiltak er avgjørende både i kromosom forberedelse og G-banding for å sikre best mulig kvalitet på resultatene. En av de variable som kan påvirke analysen, er den Colcemid inkubasjonstid. Utilstrekkelig tid i Colcemid gir færre metafase sprer og lengre, lappes kromosomer. Lengre inkubasjonstider i Colcemid vil resultere i kortere og tykkere kromosomer som er vanskelig å analysere. En annen viktig variabel er molariteten av hypoton løsning. En 0,075 M kaliumklorid-løsning vil svelle cellene akkurat nok til å gi skikkelig kromosom sprer seg, uten å lysere cellene. Mens leggeden Carnoy sin Fixative løsning, må de første 5 ml legges til pellet mens du mikser. Dette sikrer at alle de ekstra proteiner fjernes før lagring av prøvene eller forbereder lysbilder. Hvis i tilfellet at cellene ikke blir blandet godt nok, vil det gule protein cap dannes på toppen av pellet, som kan føre til komplikasjoner under påfølgende prosedyrer.
Riktig lysbilde forberedelse er viktig. Mens slippe resuspenderte cellen pellet på lysbilder, sørg for at lysbildet er vippet til ca 45 ° vinkel, og det er nok avstand (minst to inches) fra dropper å lysbildet slik at kromosomene kan riktig spre på lysbildet for analyse . Flooding glide med fiksativ umiddelbart etter slippe cellene på lysbildet vil også bidra til kromosomene til å spre seg. Temperatur og fuktighet, noe som påvirker hvor fort cellesuspensjonen tørker på lysbildet, er andre faktorer som påvirker kromosom spredning. Disse kan bli kontrollert ved å fremstille glir i et miljø med omtrent 50% fuktighet og en temperatur på omtrent 20-25 ° C, og / eller ved å plassere lysbilder på et lysbilde varmere for hurtigere tørking. For G-banding, den viktigste faktoren som påvirker kvaliteten på kromosomene er de gangene trypsin eksponering. Med en lengre trypsin eksponering, kan kromosomer vises diffust og hoven. Omvendt vil et mangelfullt kort trypsin inkubasjon gi kromosomer med utvisket band og lite kontrast. Trypsin inkubasjon timing er kan endres avhengig av hvert enkelt cellelinje og innhøstingsforhold. Derfor bør en representant G-banded lysbilde være første forberedt på å vurdere trypsin forhold før farging resten av lysbildene. Føtalt bovint serum blir brukt til å inaktivere trypsin-aktivitet før farging. Vi gir protokollen med Giemsas (GTG), men Wrights flekken kan brukes i stedet for Giemsa for GTW banding og avkastning lignende resultater.
t "> Denne fremgangsmåten er relativt billig og effektiv å utføre. G-bånd kan bli brukt til å diagnostisere kromosom abnormaliteter som translokasjoner, slettinger og aneuploidy som vanligvis sees i ondartede sykdommer, genetiske sykdommer, og stammen celler dyrket in vitro 10,11 , 13. Dette gir uunnværlig visualisering av kromosom grunnloven og den globale evaluering av hele genomet i flere celler. Det er ofte brukt i kliniske og forskningslaboratorier verden over for diagnose, prognose, og terapeutisk evaluering av kreftceller 10. Prenatal og postnatale vevsprøver blir rutinemessig undersøkt for identifisering av numeriske og strukturelle forandringer som forårsaker genetiske forstyrrelser slik som Downs syndrom. Stamceller hurtig kan evalueres for tilstedeværelse av kromosom ustabilitet. imidlertid oppløsningen av G-banding er begrenset for å identifisere microdeletions eller kompliserte kromosomfeil som sett i metasTatic maligniteter.Derfor, når rutinen kromosom G-banding er supplert med prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY), er deteksjon priser for kromosomavvik økt dramatisk 23. Av denne grunn er bruken av den foreliggende protokoll i kombinasjon med disse andre molekylære cytogenetisk prosedyrer økende grad brukt av forskjellige laboratorier for evaluering av kromosom ustabilitet i både kliniske og forsknings innstilling 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet er beskrevet i dette manuskriptet ble gjort mulig ved midler fra Patrick F. Taylor Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
