Summary
Kromosomer kan isoleres fra levende celler, såsom lymfocytter eller hudfibroblaster og fra organismer, herunder mennesker eller mus. Disse kromosom præparater kan yderligere udnyttes til rutinemæssig G-banding og molekylære cytogenetiske procedurer såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY).
Abstract
Kromosom (cytogenetisk) analyse er almindeligt anvendt til påvisning af kromosom ustabilitet. Når efterfulgt af G-banding og molekylære teknikker såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), denne analyse har den magtfulde evne til at analysere de enkelte celler for aberrationer, der involverer gevinst eller tab af dele af genomet og omlejringer involverer et eller flere kromosomer. Hos mennesker forekommer kromosomfejl i cirka 1 per 160 levendefødte 1,2, 60-80% af alle aborter 3,4, 10% af dødfødsler 2,5, 13% af personer med medfødt hjertesygdom 6, 3-6% af infertilitet tilfælde 2, og i mange patienter med forsinkelse udviklingsmæssige og fosterskader 7. Cytogenetisk analyse af malignitet anvendes rutinemæssigt af forskere og klinikere, som observationer af klonede kromosomafvigelser har vist sig at have både diagnostisk og prognostisk betydning 8,9.60, Kromosom isolation er uvurderlig for genterapi og stamcelleforskning af organismer, herunder menneskelige primater og gnavere 10-13.
Kromosomer kan isoleres fra celler af levende væv, herunder blod-lymfocytter, hudfibroblaster, amniocyter, placenta, knoglemarv og tumorprøver. Kromosomer analyseres på metafase i mitosen, når de er mest kondenseres og derfor mere tydeligt. Det første trin af kromosomet isolation teknik indebærer afbrydelse af spindel fibre ved inkubation med Colcemid, for at forhindre cellerne i at foretage den efterfølgende anafase fase. Cellerne behandles derefter med en hypotonisk opløsning, og bevaret i kvældet tilstand med Carnoys fiksativ. Cellerne derefter faldt på objektglas og kan derefter anvendes til en række forskellige procedurer. G-banding indebærer trypsinbehandling efterfulgt af farvning med Giemsa at skabe karakteristisk lys og mørke bånd. Det samme procedure at isolere kromosomer kan anvendes til fremstilling af celler til procedurer såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY) 14,15.
Introduction
Kromosomanalyse er en konventionel teknik udnyttet over hele verden til at diagnosticere kromosom ustabilitet og omrokeringer, der fører til genetiske sygdomme og malignitet 1,2,8,9. Desuden kan en højere opløsning til diagnose og forskning af forfatningsmæssige og kræft-erhvervede genetiske abnormiteter opnås med en kombination af de klassiske cytogenetiske procedurer og molekylære cytogenetiske metoder såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) , og spektral karyotyping (SKY) 14,15. For nylig har disse teknikker blevet brugt til vurdering af kromosom ustabilitet forbundet med stamcelleforskning. Karyotypic abnormiteter såsom aneuploidi af langsigtede dyrkede embryonale celler (ES) og voksne stamceller fra forskellige organismer er blevet rapporteret af flere laboratorier. Nylige undersøgelser understøtter, at nogle cellelinjer er i sagens natur mere tilbøjelige til kromosom instabilitet uanset dyrkningsbetingelser. Af denne grund, når du opretter og / eller opretholde menneske, mus eller Rhesus stamcellelinjer er kromosomanalyse anbefales som en del af kvalitetskontrollen. Mange rapporter beskriver den stigende interesse for brugen af rutine og molekylær cytogenetik at overvåge kromosom stabilitet af stamceller og maligne celler eller forskellige organismer i kultur 10-13. Disse protokoller bliver i stigende grad brugt af nongenetic laboratorier til hurtig kromosomal vurdering af deres dyrkede celler 13. Vi præsenterer vores grundlæggende procedurer for forberedelse kromosom fra forskellige celletyper, som kan anvendes til både kliniske og forskningsmæssige formål og celler afledt af forskellige organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kromosom Høst af adhærerende celler
- Standard protokol
- Grow cellerne overensstemmelse med specifikke celledyrkningsbetingelser. Når cellerne har nået logaritmisk fase (80% konfluens), tilsættes 10 ul / ml Colcemid til cellekulturen kolben. Et minimum på 2 x 10 6 celler anbefales.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 45 min. Ved hjælp af en steril pipette medier fra celler i en 15 ml konisk rør. Braklægning.
- Vask forsigtigt cellerne ved tilsætning af 2 ml HBSS buffer ind i kolben. Swirl buffer og derefter fjerne ved hjælp af en pipette. Kassér.
- Tilsæt 1 ml trypsin sikre, at den dækker hele overfladen af kolben. Kun forlade cellerne i trypsin i ca 2 min. Når de fleste af cellerne har fritliggende, pipetteres medierne i den koniske rør tilbage på cellerne.
- Overfør cellesuspension i 10 ml aliquoter i 15 ml koniske rør.Centrifuger ved 200 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender pelleten.
- Der tilsættes 10 ml 0,075 M KCI, som er blevet forvarmet til 37 ° C til den resterende pellet i den koniske rør. Vortex rør ved middel hastighed til at blande KCl og celler.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Centrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved 25 ° C. Fjern supernatanten (indtil omkring 0,5 ml rester) og resuspender pellet.
- Tilsættes forsigtigt 5 ml frisk Carnoys Fixative (3:1 methanol: iseddikesyre) til de celler, mens omhvirvling. Derefter tilsættes 5 ml mere af fiksativ uden vortex for i alt 10 ml.
- Centrifuger ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne. Der tilsættes 5 ml fixativ til hvert rør.
- Centrifuger ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne. Der tilsættes 5 ml fixativ til hvert rør. Cellerne kan nu opbevares i 4 ° C i op til et år.
- Ændring til protokol: Kromosom harvesting lymfoblastoidcellelinier
- Grow celler i overensstemmelse med specifikke celledyrkningsbetingelser. (Brug kolbe passende for mængden af celler, der dyrkes). Når cellerne har nået logaritmisk fase (ca. 2 dage efter cellerne er split) tilsættes 10 ul / ml Colcemid til cellekulturen kolben.
- Ændring til protokol: Kromosom høst fra fuldblod
Phytohemagglutinin (PHA), et lectin udvundet fra den røde nyre bønner, er en kraftfuld mitogen for humane T-celler 16. 72 timer efter tilsætning af PHA til kulturen, omkring 45% af cellerne er i S-fase. Dette repræsenterer den maksimale mitotisk aktivitet og er det optimale tidspunkt at høste til kromosomundersøgelser. Andre mitogener såsom kermesbær (1-10 mg / ml), kan anvendes, når man analyserer B-celler 17,18.- Saml mindst 1 ml fuldblod i en grøn top natrium heparin rør. Anvendes inden 3 dage efter opsamling. Store blod ved stuetemperatur unto klar til brug.
- Afmål 0,25 ml fuldblod i 10 ml komplet RPMI-medium indeholdende L-glutamin (20% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% fungizon og 1% PHA). Dyrkning ved 37 ° C med 5% CO2.
- Ændring til protokol: Kromosom høst fra knoglemarv
Cytogenetisk analyse på knoglemarv er nyttigt i mange maligne hæmatologiske lidelser som observation af et kromosomalt unormal klon kan være diagnostisk for en bestemt type leukæmi. Kromosomundersøgelser også anvendes til at vurdere sygdomsprogression såsom indtræden af blastkrise og reaktion på behandlingen. Da knoglemarvsceller aktivt delende ingen mitogen stimulation er nødvendig 9,19. For akut leukæmi 24 og 48 timers kulturer også oprettet.- Saml mindst 1 ml knoglemarv i en grøn top natrium heparin rør. Afmål 0,25 ml knoglemarv i 10 ml komplet RPMI-medium indeholdende L-glutamin (20% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% fungizon). Dyrkning ved 37 ° C med 5% CO2.
2. Slide Forberedelse og Solid Farvning
En hurtig evaluering af en repræsentant slide vil give oplysninger om kvaliteten af høsten, før du fortsætter yderligere procedurer såsom G-banding, FISH, CGH eller SKY. Nogle laboratorier foretrækker at solid plet cellerne for hurtig høst og kromosom vurdering. Alternativt kan et fasekontrast-mikroskop anvendes til denne analyse. Slides fremstilles bedst, når luftfugtigheden er ca 50%, og temperaturen omgivelsestemperatur (20-25 ° C).
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 min ved 25 ° C. Fjern supernatanten, indtil der kun 0,3-0,5 ml rester.
- Efter forsigtig resuspendering af pellet, pipette tre dråber af cellesuspensionen fra en afstand på omkring 2 på et objektglas, der er vippet i en vinkel på cirka 45 ° og tillade suspensionenat rulle på tværs af dias. Tilsæt en stor dråbe frisk Carnoys Fixative til diaset.
- Tør bagsiden af dias på et stykke køkkenrulle og derefter sidde slide ud til tørre i mindst 10 min. Slæden skal være helt tørre.
- Fremstilles frisk Giemsa farveopløsning (3:1 forholdet Gurr Buffer og Giemsa Stain). Anbring dine dias på farvningsrack. Dæk hele dias i Giemsa farvning løsning. Lad objektglassene forblive i farveopløsning i 5 min. Skyl objektglassene med destilleret vand, afløb, og lad det lufttørre.
- Tilsæt 4 dråber Permount og et dækglas til diaset. Sørg for, at der ikke er bobler under dækglasset. Den overskydende Permount kan fjernes med en papirserviet.
- Analyser celler med et lysmikroskop under 10X og 100X forstørrelse. Hvis celler i metafase er rigelige og godt spredt, kan de resterende objektglas anvendes til andre eksperimentelle procedurer.
3. G-banding anvendelse af trypsin og Giemsa (GTG)
<p> Trypsin er et proteolytisk enzym, som denaturerer euchromatic histoner i DNA-regioner med højere transkriptionsaktivitet deraf. Efter Giemsa, vil disse regioner som lyse bånd. Stærkt kondenseret kromatin med ringe eller ingen transkriptionel aktivitet (heterochromatin) vil have en stor del af sine histoner beskyttet mod trypsin og derfor vil plette mørkt efter Giemsa. Det er vigtigt at begynde med G-bånd ét dias til at overvåge de betingelser og juster trypsin timing hvis det er nødvendigt for de efterfølgende dias.- Tilføj følgende løsninger til 4 Coplin-skåle.
Jar # 1 = 30 ml 1x HBSS og 4 ml 10x trypsin (0,5%)
Jar # 2 = 50 ml 1x HBSS
Jar nr. 3 = 45 ml 1x HBSS og 5 ml kalvefosterserum
Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS - Fordyb hvert dias i Jar # 1 for 5 sek, hurtig skylle i Jar # 2, lade de enkelte dias i Jar # 3 i mindst 30 sek, hurtig skylle i Jar # 4 så lad objektglassene tørre.
- Forbered fresh Giemsa farveopløsning (3:1 forholdet Gurr Buffer og Giemsa Stain). Anbring dine dias på farvningsrack. Dæk hele dias i Giemsa farvning løsning. Lad objektglassene forblive i farveopløsning i 5 min.
- Skyl objektglassene i destilleret vand i samme rækkefølge, som de blev plettet. Lad objektglassene tørre i cirka 10 minutter. Slæden skal være helt tørre.
- Tilsæt 4 dråber Permount og et dækglas til diaset. Sørg for, at der ikke er bobler under dækglasset. Den overskydende Permount kan fjernes med en papirserviet.
- Analyser celler med et lysmikroskop under 10X og 100X forstørrelse. Juster trypsin timing af resten af dias er baseret på resultaterne af det første dias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høj kvalitet metafasespredninger er afgørende for kromosomanalyse. En vellykket analyse giver kromosomer, som er godt spredt, og af passende kromosom morfologi. Korrekt G-banded kromosomer indeholder den karakteristiske lyse og mørke båndmønstre.
Figur 1.. En vellykket kromosomal spredning, hvor kromosomerne er af gennemsnitlige længde, godt spredt og let ses fra hinanden, og tilstrækkelig kontrasten mellem lys og mørke bånd. God kromosom morfologi giver mulighed for identifikation af individuelle kromosomer og evaluering for eventuelle omrokeringer vejledende af kromosom ustabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udnyttet den foreliggende procedure for kromosom isoleret fra celler af forskellige organismer, herunder forskellige celletyper opnået fra human, makakaber, rotter og mus 11,20-22. Den standard-protokol er forudsat, men visse vigtige skridt og variabler skal muligvis justeres for disse forskellige typer af celler. Flere specifikke trin er afgørende i både forberedelsen kromosom-og G-banding at sikre den bedst mulige kvalitet af resultaterne. En af de variabler, som kan påvirke analysen er Colcemid inkubationstid. Utilstrækkelig tid i Colcemid giver færre metafasespredninger og længere, overlappede kromosomer. Længere inkubationstider i Colcemid vil resultere i kortere og tykkere kromosomer, som er vanskelige at analysere. En anden vigtig variabel er molariteten af hypotonisk opløsning. En 0,075 M kaliumchloridopløsning vil svulme cellerne lige nok til at give korrekt kromosom spredning, uden lysering af cellerne. Samtidig med at tilføjeDen Carnoys Fixative opløsning, de første 5 ml sættes til pelleten under blanding. Dette sikrer, at alle de ekstra proteiner fjernes før opbevaring af prøverne eller fremstilling af objektglas. Hvis der i tilfælde af, at cellerne ikke blandes godt nok, vil en gul protein hætte dannes på toppen af pelleten, hvilket kan forårsage komplikationer under efterfølgende procedurer.
Korrekt præparatglaspræpareringsprotokol er afgørende. Mens droppe resuspenderede cellepelleten på dias, skal du sørge for, at slæden er vippet til ca 45 ° vinkel, og der er nok afstand (mindst 2 inches) fra pipette til diaset, så kromosomerne kan ordentligt sprede på slide for analyse . Oversvømmelser slide med fiksativ umiddelbart efter droppe cellerne på dias vil også hjælpe kromosomer til at sprede sig. Temperatur og luftfugtighed, som påvirker, hvor hurtigt cellesuspensionen tørrer på diaset, er andre faktorer, der påvirker kromosom sprede sig. Disse kan være kontrolleres ved at fremstille slides i et miljø med 50% fugtighed og en temperatur på omkring 20-25 ° C og / eller ved at placere objektglassene på et objektglas varmere for hurtigere tørring. For G-Banding, den vigtigste faktor, der påvirker kvaliteten af kromosomerne er trypsin eksponeringstider. Med en længere trypsin eksponering kan kromosomer forekomme diffust og hævede. Omvendt vil en utilstrækkeligt kort trypsin inkubation give kromosomer med skelnes bands og lidt kontrast. Trypsin inkubation timing er underlagt forandring afhængig af hver enkelt cellelinje og høstforhold. Derfor bør en repræsentativ G-stribede slide være første parat til at evaluere trypsin betingelser, før farvning resten af dias. Føtalt bovint serum anvendes til at inaktivere trypsin aktivitet før farvning. Vi leverer protokollen hjælp Giemsa (GTG), men Wrights plet kan anvendes i stedet for Giemsa for GTW banding og udbytter lignende resultater.
t "> Denne fremgangsmåde er relativt billig og effektiv til at udføre. G-banding kan bruges til at diagnosticere kromosomfejl såsom translokationer, deletioner og aneuploidi, som almindeligvis ses i maligniteter, genetiske sygdomme og stamceller dyrket in vitro 10,11 13. Dette giver den uundværlige visualisering af kromosomet forfatning og den samlede evaluering af hele genomet i flere celler. Det er almindeligt anvendt i kliniske og forskningslaboratorier over hele verden til diagnose, prognose, og terapeutisk evaluering af kræftceller 10.. prænatal og postnatal vævsprøver rutinemæssigt vurderes til identifikation af numeriske og strukturelle abnormiteter, som forårsager genetiske sygdomme såsom Downs syndrom. Stamceller hurtigt kan undersøges for tilstedeværelsen af kromosom ustabilitet. Imidlertid er løsningen af G-banding begrænset til identifikation af mikrodeletioner eller komplekse kromosomfejl, som ses i metasTatic maligniteter.Derfor, når rutine kromosom G-banding er suppleret med procedurer såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY), at blive opdaget af kromosomafvigelser steget dramatisk 23. Af denne grund, er udnyttelsen af denne protokol i kombination med disse andre molekylære cytogenetiske procedurer i stigende grad brugt af forskellige laboratorier til evaluering af kromosom ustabilitet i både klinisk og forskningsmæssig indstilling 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet er beskrevet i dette manuskript blev muliggjort af midler fra Patrick F. Taylor Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
