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Biology

배양 세포에서 염색체 준비

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드(물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

Abstract

염색체 (염색체) 분석에 널리 염색체 불안정성의 검출에 사용된다. G-밴딩과 같은 현장 하이브리드(물고기)의 형광 등의 분자 기술에 의해 다음 경우,이 분석은 하나 이상의 염색체를 포함하는 게놈 재 배열 부분의 이익 또는 손실을 포함 수차에 대한 개별 세포를 분석 할 수있는 강력한 기능을 가지고 있습니다. 인간의 염색체 이상이 약 1 160 명당 1, 2, 모든 유산 60 ~ 80 %가 발생하는 3,4, 사산의 10 % 2,5, 선천성 심장 질환 6 3-6 %를 개인의 13 % 불임의 경우 2, 발달 지연과 출생 결함 (7)을 가진 많은 환자에서. 클론 염색체 이상을 관찰 모두 진단 및 예후 중요성 8,9이 표시되었습니다로 악성 종양의 세포 유전 학적 분석은 정기적으로, 연구자와 임상의에 의해 사용된다.60, 염색체 분리는 유전자 치료에 대한 소중하고 인간이 아닌 영장류와 설치류 10-13를 포함하여 생물의 줄기 세포 연구.

염색체는 혈액 림프구, 피부 섬유 아세포, amniocytes, 태반, 골수, 종양 표본을 포함한 살아있는 조직의 세포로부터 단리 할 수​​있다. 그들이 가장 응축 때문에 더 명확하게 볼 수 있습니다 때 염색체는 유사 분열의 중기 단계에서 분석된다. 염색체 분리 기술의 첫번째 단계는 후속 anaphase 단계로 진행하는 세포를 방지하기 Colcemid 함께 인큐베이션 스핀들 섬유의 파괴를 수반한다. 세포는 그 다음 저장성 용액으로 처리하고 Carnoy의 고착성과의 팽윤 상태로 보존된다. 세포는 그 다음 슬라이드에 떨어 된 후 다양한 절차에 이용 될 수있다. G-밴딩이 특징 빛과 어둠 밴드를 만들 지엠 사 (Giemsa)로 염색 한 다음 트립신 처리를 포함한다. 같은 홍보염색체를 분리 ocedure는 원위치 혼성화 (FISH) 형광, 비교 게놈 혼성화 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 (SKY) 14,15 같은 절차에 대한 세포의 제조에 사용될 수있다.

Introduction

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염색체 분석은 염색체 불안정성과 유전 질환 및 악성 종양의 1,2,8,9로 이어지는 재 배열을 진단하기 위해 전 세계적으로 이용되는 기존의 기술입니다. 또한, 헌법과 암 획득 유전자 이상을 진단 및 연구에 대한 높은 해상도는 형광 제자리 교잡 (FISH)와 같은 고전적인 세포 유전 학적 절차 및 분자 유전 학적 방법의 조합, 비교 게놈 교잡 (CGH)을 달성 할 수 있습니다 그리고 스펙트럼의 핵형 분석 (SKY) 14, 15. 더 최근에, 이러한 기술은 줄기 세포 연구와 관련된 염색체 불안정성의 평가에 이용되어왔다. 이러한 장기 배양 된 배아 세포 (ES)와 다양한 생물의 성체 줄기 세포의 이수성으로 핵형 이상은 여러 실험실에서보고되었다. 최근의 증거는 어떤 세포주가 본질적으로 염색체 instabi하는 경향 것을 지원에 관계없이 배양 조건의 품 질. 확립 및 / 또는 인간, 마우스 또는 히말라야 줄기 세포주를 유지하면 이러한 이유로, 염색체 분석 품질 관리 프로세스의 일부로서 추천. 많은 보고서 배양 10-13 줄기 세포 및 악성 세포 또는 다양한 유기체의 염색체 안정성을 모니터링 루틴 세포 유전학 및 분자의 사용에 대한 관심의 증가를 설명한다. 이러한 프로토콜은 점점 그 배양 세포 (13)의 급속한 염색체 평가에 비유 전적 연구소에서 사용되고있다. 우리는 다양한 유기체에서 파생 된 임상 및 연구 목적으로 세포 모두에 적용 할 수있는 다양한 종류의 세포에서 염색체 준비를위한 우리의 기본적인 절차를 제시한다.

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Protocol

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1. 자기편 세포의 염색체 수확

  1. 표준 프로토콜
    1. 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. 세포가 로그 단계 (80 % 컨 플루)에 도달 한 경우, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. 2 × 10 6 세포의 최소 권장합니다.
    2. 45 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 멸균 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 세포에서 미디어를 전송할 수 있습니다. 옆으로 설정합니다.
    3. 조심스럽게 플라스크에 HBSS 버퍼 2 ㎖를 추가하여 세포를 씻으십시오. 소용돌이 버퍼링 한 후 피펫을 사용하여 제거합니다. 폐기하십시오.
    4. 이 플라스크의 전체 표면을 커버 것을 보장, 트립신 1 ML을 추가합니다. 약 2 분 동안 트립신의 세포를 둡니다. 세포의 대다수가 분리 한 후에 다시 셀에 원추형 튜브 미디어 피펫.
    5. 15 ML 원뿔 튜브에 10 ㎖ 분량 씩에 세포 현탁액을 전송합니다.10 분 200 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 펠렛을 재현 탁.
    6. 원뿔 튜브에 남아있는 펠릿에 37 ° C에 데워진 된 0.075 M의 KCl 10 ㎖를 추가합니다. 의 KCl과 세포를 혼합하는 중간 속도의 소용돌이 관.
    7. 10 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 25 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 과에 resuspend 펠렛 (약 0.5 ml의 유적까지) 뜨는을 제거합니다.
    8. 소용돌이로 교반하면서 세포 : 조심스럽게 신선한 Carnoy의 정착액 5 ㎖ (빙초산, 메탄올의 비율은 3:1)를 추가합니다. 그런 다음 10 ㎖의 총 텍싱없이 정착보다 5 ㎖를 추가합니다.
    9. 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다.
    10. 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다. 세포는 지금까지 1 년에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 의정서 수정 : 염색체 harvesti임파 세포 라인의 NG
    1. 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. (사용은 세포가 배양되는 금액에 대해 적절한 플라스크). 세포가 로그 단계 (세포가 분할되어 대략 2 일 후)에 도달하면, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다.
  3. 의정서 수정 : 전체 혈액에서 염색체 수확
    피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)는 빨간색 신장 콩에서 유래 된 렉틴은, 인간 T-세포 (16)에 대한 강력한 유사 분열 물질이다. 72 시간 배양에 PHA의 첨가 후, 세포의 약 45 %는 S 단계에있다. 이 피크 유사 분열 활동을 대표하는, 염색체 연구에 수확하는 최적의 지점입니다. B 세포에게 17,18 분석시 등의 pokeweed (1-10 ㎍ / ㎖)와 같은 다른 유사 분열 물질이 사용될 수있다.
    1. 녹색 정상 나트륨 헤파린 튜브에 전체 혈액의 적어도 1 ㎖를 수집합니다. 수집 후 3 일 이내에 사용하십시오. RT UN에서 보관 혈액사용할 준비가 나타나기 전까지는.
    2. 분취 L-글루타민 (20 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone 및 1 % PHA)를 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 전혈 0.25 밀리리터. 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화.
  4. 의정서 수정 : 골수에서 염색체 수확
    염색체 이상 클론의 관찰이 백혈병의 특정 유형에 대한 진단 할 수 있으므로 골수에서 세포 유전 학적 분석은 많은 악성 혈액 질환에 도움이됩니다. 염색체 연구는 또한 폭발의 위기와 치료에 대한 반응의 증상으로 질병의 진행을 평가하는 데 사용됩니다. 골수 세포는 활발하게 분열하고 있기 때문에, 어떠한 미토 겐 자극 9,19 필요 없다. 급성 백혈병의 경우 24, 48 시간 배양도 설정되어 있습니다.
    1. 녹색 정상 나트륨 헤파린 관에서 골수의 최소 1 ㎖를 수집합니다. L-글루타민 (2을 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 골수의 분취 0.25 밀리리터0 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone). 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화.

2. 슬라이드 준비 및 고체 염색

한 대표 슬라이드의 신속한 평가는 G-밴딩, FISH, CGH, 또는 SKY로 추가 절차를 계속하기 전에 수확의 품질에 대한 정보를 제공합니다. 일부 연구소는 고체 얼룩에 빠른 수확 및 염색체 평가를위한 세포를 선호합니다. 대안 적으로, 위상차 현미경은이 분석을 위해 사용될 수있다. 슬라이드는 유용한 습도가 약 50 % 일 때 제조 및 주위 온도 (20-25 ℃)된다.

  1. 25 ℃에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 만 0.3 ~ 0.5 ㎖의 유적까지 뜨는을 제거합니다.
  2. 야간 부드럽게 약 45 °의 각도로 기울어 및 현탁액이 허용되는 슬라이드에 대해 2의 거리에서 세포 현탁액의 펠릿, 피펫 세 방울을 재현 탁슬라이드 가로 질러. 슬라이드에 신선한 Carnoy의 정착액의 하나의 큰 방울을 추가합니다.
  3. 종이 타월에 슬라이드 뒷면을 건조 후 적어도 10 분 동안 건조 밖으로 슬라이드를 앉아. 슬라이드가 완전히 건조해야한다.
  4. 신선한 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1)를 준비합니다. 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자. 증류수로 슬라이드를 씻어 흘려 공기 건조 할 수 있습니다.
  5. 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다.
  6. 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 중기 세포가 풍부하고 잘 확산되는 경우에, 나머지 슬라이드는 다른 실험 절차를 위해 사용될 수있다.

3. G-밴딩 트립신과 지엠 사 (Giemsa) (GTG)를 사용하여

<P> 트립신 높은 전사 활동의 결과로 DNA의 지역에서 실 염색질 (euchromatin) 히스톤을 변성 단백질 분해 효소이다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 후,이 지역은 빛 밴드로 나타납니다. 거의 또는 전혀 전사 활동 (이질)와 매우 응축 된 염색질은 트립신 보호의 히스톤의 큰 부분이있을 것이다, 따라서 지엠 사 (Giemsa) 염색 다음 어둡게 얼룩 것입니다. 그것은 처음에 G-밴드 하나의 슬라이드에 조건을 모니터링하고 필요한 경우 후속 슬라이드의 트립신의 타이밍을 조절하는 것이 필수적입니다.

  1. 4 코 플린 단지에 다음과 같은 솔루션을 추가합니다.
    항아리 # 1 1X HBSS의 = 30 ㎖ 및 10 배 트립신 4 ㎖ (0.5 %)
    1X HBSS의 항아리 # 2 = 50 ㎖
    항아리 # 3 = 1X HBSS 45 ㎖ 및 소 태아 혈청 5 ㎖
    1X HBSS의 항아리 # 4 = 50 ㎖
  2. 5 초 동안 단지 1 위의 각 슬라이드, 항아리 # 2의 빠른 헹굼을 담가, 적어도 30 초 동안 항아리 # 3 항아리 # 4 빠른 헹굼을 각 슬라이드를 떠나 다음 슬라이드를 건조 할 수 있습니다.
  3. 청정제를 준비H 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1). 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자.
  4. 그들은 더러워졌다 동일한 순서로 증류수에 슬라이드를 헹군다. 슬라이드를 약 10 분 동안 건조하도록 허용합니다. 슬라이드가 완전히 건조해야한다.
  5. 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다.
  6. 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 첫 번째 슬라이드의 결과에 기초하여 슬라이드의 나머지의 트립신 타이밍을 조정한다.

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Representative Results

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고품질 중기 스프레드 염색체 분석을 위해 필수적입니다. 성공적인 분석이 잘 확산 적합한 염색체 형태의있다 염색체를 얻을 수 있습니다. 제대로 G-밴드 염색체는 특성 밝은 부분과 어두운 줄무늬 패턴이 포함되어 있습니다.

그림 1
그림 1. 염색체는 평균 길이가되는 성공적인 염색체 확산, 잘 확산 쉽게 서로 식별 가능하고, 빛과 어둠 밴드 사이에 충분한 대비. 좋은 염색체 형태가 나타내는 모든 재배에 대한 개별 염색체 및 평가의 식별 가능 염색체 불안정.

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Discussion

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우리는 다양한 인간에서 얻은 세포 유형, 붉은 털 원숭이, 쥐, 생쥐 11,20-22 등 다양한 생물의 세포에서 염색체 분리를위한 본 절차를 이용했다. 표준 프로토콜은 제공되지만, 특정 주요 단계와 변수는 세포의 이러한 다양한 유형의 조정해야 할 수도 있습니다. 몇몇 특정 단계 염색체 제제 및 결과의 최상의 품질을 보장​​하기 위해 G-밴딩 모두에 중요하다. 분석에 영향을 미칠 수있는 변수 중 하나는 Colcemid 배양 시간입니다. Colcemid의 부족 시간이 적은 중기 확산과 이상, 중복 염색체를 얻을 수 있습니다. Colcemid의 긴 배양 시간을 분석하기 어려운 짧고 두꺼운 염색체가 발생합니다. 또 다른 중요한 변수는 저장성 용액의 몰 농도이다. 0.075 M 염화칼륨 용액은 충분한 세포를 용균없이 확산 적절한 염색체을 수득 세포를 팽창한다. 추가 할 때혼합하면서 Carnoy의 고착성 용액을, 제 5 ml의 펠릿에 첨가되어야한다. 이 여분의 단백질 모두가 샘플을 저장하거나 슬라이드를 준비하기 전에 제거되었는지 확인합니다. 셀이 충분히 혼합되지 않은 상태에있는 경우 경우 노란색 단백질 캡은 후속 과정에서 합병증을 일으킬 수있는 펠릿의 상부에 형성 할 것이다.

적절한 슬라이드 준비는 필수적이다. 슬라이드에 재 부유 세포 펠렛을 삭제하는 동안 슬라이드가 약 45 °의 각도로 기울어 져 있는지 확인하고 염색체가 제대로 분석을위한 슬라이드에 분산 할 수 있도록 충분한 거리 (최소 2 인치) 슬라이드로 적기에서가 . 정착 즉시 슬라이드에 세포를 떨어 뜨리고 다음과 슬라이드를 홍수도 확산 염색체 도움이 될 것입니다. 세포 현탁액은 슬라이드에 말린다 얼마나 빨리 영향 온도 및 습도는, 염색체 확산에 영향을주는 다른 요인이다. 이들은이 될 수 있습니다 약 50 %의 습도와 20 ~ 25 ° C의 온도와 환경에서 슬라이드를 준비하여 제어 및 / 또는 더 빠른 건조 워머 슬라이드에 슬라이드를 배치함으로써. G-밴딩, 염색체의 품질에 영향을 미치는 주요 요인은 트립신 노광 시간이다. 이상 트립신 노출, 염색체 확산 부어 나타날 수 있습니다. 반대로, 부적절하게 짧은 트립신 배양는 구별 밴드와 명암 염색체를 얻을 것입니다. 트립신 보육 타이밍은 각각의 특정 세포 라인과 수확 상황에 따라 변경 될 수 있습니다. 따라서, 대표적인 G-밴드 슬라이드는 첫 번째 슬라이드의 나머지 부분을 염색하기 전에 트립신 조건을 평가하기 위해 준비를해야합니다. 태아 혈청 전에 염색법 트립신 활성을 불 활성화하기 위해 사용된다. 우리는 지엠 사 (Giemsa) (GTG)를 사용하여 프로토콜을 제공하지만, 라이트의 얼룩이 GTW 밴딩 수율 유사한 결과를 지엠 사 (Giemsa) 대신에 사용될 수있다.

t ">이 절차를 수행하는 데 상대적으로 저렴하고 효과적입니다. G-밴딩은 일반적으로 악성 종양, 유전 질환에서 볼 수 있습니다 전좌, 삭제 및 이수성 같은 염색체 이상을 진단하고 시험관 10, 11에서 배양 줄기 세포를 할 수 있습니다 13.이 염색체 헌법과 여러 세포의 전체 게놈의 글로벌 평가의 필수 시각화를 제공합니다. 그것은 일반적으로 암 세포 10. 산전의 진단, 예후 및 치료 평가를 위해 전 세계적으로 임상과 연구 실험실에서 사용되는 출생 후의 조직 샘플은 통상적으로 그러한 다운 증후군 등 유전 적 질환의 원인이 수치와 구조적 이상의 식별을 위해 평가된다. 줄기 세포 급속 염색체 불안정성의 존재에 대해 평가할 수있다. 그러나 G-밴딩의 해상도의 식별에 한정 같은 METAS에서 볼 microdeletions 복잡한 염색체 이상tatic 악성 종양.

일상 염색체 G 밴딩이 같은 현장 하이브리드(물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 절차를 보충 할 때 따라서 염색체 이상을 검출 속도는 극적으로 23 증가한다. 이러한 이유로, 다른 분자 유전 학적 절차와 함께 본 프로토콜의 활용은 점점 임상과 연구 모두 13-15 설정 염색체 불안정성의 평가를 위해 다른 실험실에 의해 사용되고있다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 논문에서 설명하는 작업은 패트릭 F. 테일러 재단의 자금에 의해 가능하게되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

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배양 세포에서 염색체 준비
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Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

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