Summary
肺灌注全身支气管动脉和肺动脉。在大多数肺病理学，它是较小的全身血管，显示了强大的新血管形成。停止肺血流量，促进轻快的支气管血管生成。我们提供诱导左肺动脉缺血，促进支气管新生血管的手术细节。
Abstract
成人肺灌注全身支气管动脉和整个下肢静脉回流流经肺动脉。在大多数肺癌病症，它是规模较小的全身血管，增强肺灌注需要作出响应，并显示强大的新生血管。已经显示出肺血管局部缺血诱导的肺动脉梗阻导致快速全身动脉血管生成的人以及在几个动物模型。虽然组织学评估过程中的时间支气管动脉增殖的影响进行了仔细的描述的1的威贝尔，机制，负责本组织生长的新船是不明确的。我们提供左肺动脉缺血诱导的大鼠，导致支气管新生血管的手术细节。血管生成的程度的定量的呈现的两个内的肺血管床的存在下，由于一个额外的挑战。方法确定新生血管形成的基础上标记的微球注射。
Introduction
全身血管生成的肺是大家公认的。在疾病状态下，如哮喘，肺间质纤维化3，癌症，慢性肺血栓栓塞症，全身血管和周围的肺中繁衍，侵入肺实质。然而，动物模型来研究这种差别激活的系统，而不是肺循环的毕竟是少数。也许全身新生血管在成年哺乳动物的肺是最可重复性的模型是发生诱导慢性肺动脉缺血后。左肺动脉阻塞在人类5-7，狗，猪，羊，豚鼠，大鼠，12日，13日和小鼠14支气管动脉和肋间动脉的快速普及。全身neovasculari负责的机制zation的肺肺缺血后，在很大程度上是未知的，并没有被广泛研究。支气管左肺动脉阻塞后的大鼠血管生成的过程中的时间已被仔细描述在病理工作威贝尔1。这项工作在大鼠延伸的，我们的实验室已集中生长的重要因素，以及在这个过程中的生理结果本新生血管在肺。结果表明缺血后早期和中和抗体治疗大鼠CXCR2的趋化因子CINC-3升高，CINC-3受体，抑制血管新生13。新成立的支气管肺缺血发作后的14天内被证明是血管异常显着提高蛋白质的通透性15。左肺功能弥散能力下降和减少肺容积15中的表现不正常。虽然新生血管可能有合作ntributed慢性肺缺血肺组织的保护，它似乎不正常，可能会导致肺功能持续下降。
这种模式最奇怪的方面之一可能涉及血管增殖的空间分布。尽管在肺实质因缺血而释放生长因子，新生血管起源于比较大的上游支气管动脉。出现正常的支气管动脉从主动脉的一个小分支和侵入呼吸道树，在气管隆突。这样的机制，其中生长因子诱导的初始阶段动脉生成是不明确的。我们建议，大鼠，用类似人类的血管解剖，提供一个独特的机会来研究负责全身血管生成在肺缺血的机制。虽然左肺动脉完全阻塞是一种罕见的发生在人类的主题，增加支气管血管患者出现同样引起任何部位和大小的肺动脉阻塞16。因此，我们提供了手术结扎左肺动脉在大鼠和的一种手段，以量化的大小的血管生成的方法的详细描述。
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Protocol
对老鼠进行的所有协议，由美国约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准，并按照与美国国立卫生研究院的指导方针。只要有可能，动物应该是手术准备在从手术区域分开的区域的外科手术部位，以尽量减少污染。
1。麻醉/镇痛
- 放置在感应腔注入3％异氟醚的大鼠（只SD雄性大鼠，125-150克;哈伦，印第安纳波利斯，IN）。
- 将板的鼻锥和呼吸机连接到3％异氟醚麻醉手术麻醉大鼠。使用无菌技术的所有程序。悬垂老鼠，以确保无菌操作领域。
2。插管法
- 仰卧位，用医用胶带固定附加物。
- 删除大鼠的鼻锥，延长舌与软垫钳。
- 使用14号intracath与钝的金属stilet的为导向。滑动后面ngue，进气管。
- 取出金属stilet离开的白色塑料intracath在气管。确保将大鼠呼吸和空气流过管子。
- 更换鼻锥直接转接器导管，连接呼吸机（90次/分，潮气量8毫升/公斤;啮齿动物呼吸机型号683，哈佛装置，州Holliston，马萨诸塞州）的老鼠。
- 应用Puralube（巴特勒施恩，都柏林，OH）兽医药膏眼睛。
3。开胸手术
- 地点大鼠右侧下来，用医用胶带固定附属物。
- 剃须左侧胸腔区。
- 删除多余的皮毛，小真空。
- 聚维酮碘棉棒（Dynarex公司，Orangebur，NY），其次是用酒精擦拭消毒领域。这个过程重复2次（共3磨砂）。
- 横切口用无菌无菌手术刀解剖剪刀或在中心场。
- 钝性解剖，通过L艾尔斯的组织和脂肪肋骨（最后一层薄膜覆盖肋骨）。
- 计数肋骨，以确定第三肋间。
- 45°格雷夫使用无菌镊子，3 次和第 4肋骨之间切开钝。
- 将肋骨分离器，拉轻轻地创建开放作废，完全可视化的肺，在缝合的地方磁带保持开放。
4。左肺动脉结扎术
- 90°格雷夫钳，将左肺用右手。
- 使用杜蒙模式第5直线镊子，用左手抓住左肺动脉和呼吸道。左肺动脉，将为在气道。确保镊子直接垂直于工作台。此外，它是最有效的在最前端的位置（最近的实质）拿起左肺动脉/左主支气管。将左肺外的通风这左手机动的。
- 使用杜蒙模式＃5 45°弯钳分离左肺动脉，在其自然边界的左主支气管。这种分离出现薄白线之间的两个独立的结构。
- 分离直接下动脉，而无需通过容器;顺畅地滑动沿分离的钳子提示保持在一起。
- 继续直到提示钳明显分开，左肺动脉和左主支气管。只有一小点的提示，需要通过充分。如果血液可以可视化的钳子的前端上，然后它是不能完全通过和不应该尝试结扎。一旦通过的空间，左肺动脉，将为在曲线上的钳子。保持在这个位置。
- 轻轻松开直钝镊子手柄（左手）和抢一块的预切缝（2-3英寸聚丙烯缝线大小6-0 MYCO医疗，卡里，NC）。
- 打开弯钳抱着左肺动脉和g拉布缝合。通过空间之间的左肺动脉和左主支气管向上的相对运动的曲线的钳子轻轻地拉缝合。
- 系紧阻断左肺动脉与一个平结，仔细剪断剩余的缝合线。
- 关闭肋骨4-0安装到19毫米，3/8圈反向切割止血针（MYCO医疗，卡里，NC），小心不要使用钝钳按住肋骨和缝合用聚丙烯（蓝色单丝）尺寸缝合皮肤（仅肋骨）。
- 完成一个宽松的平结，肺膨胀，积极呼气末正压（PEEP 2-5 CMH 2 O），hyperinflate肺当时的安全结得紧紧的，另一个结前剪断缝合其余的。移除PEEP和可视化，持续30秒，以确保，肺不折叠。将5滴布比卡因（APP制药，Schaumbur，IL）。
- 关闭皮肤组织胶对伤口和皮肤一起推动使用返回END棉棒涂抹。给布比卡因（2.0毫克/公斤皮下）在切口部位随后每8小时，24小时或直到动物恢复正常活动。作为在这方面的皮下组织层是非常薄的，它是不容易在其自己的缝合。当组织胶施加和皮肤被推到一起，它也会关闭皮下层。
- 关闭异氟醚气体，但继续的老鼠通风室内空气1-2分钟，直到自愿运动的回报。脱离呼吸机，拔除气管导管，确保将大鼠自主呼吸，然后再将其取出。
- 擦去Puralube眼睛用棉签和监控运动和恢复。注射盐酸丁丙诺啡（0.05 mg / kg腹腔，巴特勒施恩，都柏林OH）。继续48小时手术后镇痛，每12小时交付。
5。左侧颈总动脉插管
要评估的幅度支气管perfus离子在期望的时间点后，左肺动脉结扎缺血左肺，注射标记的微球通过左侧颈动脉到主动脉弓。准备大鼠以上1-2。
- 切中线，沿着颈部中，冲解剖发现气管和左侧颈总动脉（微球注射部位）。
- 插入导管充满肝素盐水，钝尖PE20管（Becton Dickinson公司，火花MD）连接到25克针，4路，1毫升注射器活塞的容器。
- 将一瓶的微球（15μm的深红色聚苯乙烯荧光微球，1×10 6个球/毫升; Invitrogen公司，尤金，OR）在水中的超声波发生器30秒。
- 取出瓶，涡和玻璃注射器1毫升汉密尔顿（Hamilton公司，雷诺，内华达州）至20克针吸取0.5毫升（500,000微球）。
- 将4路活塞的汉密尔顿注射器注入微球注射泵（率：500μl/ min的精灵此外，肯特科学，Torringt上，CT）。
- 移除Hamilton注射器和冲洗装置用1毫升heparized生理盐水，在500μl/ min的。
- 执行完整的胸部开胸切断对大鼠下腔静脉抽血。
- 拆下左侧的肺和其他组织的利益。
- 要提取从组织中的微球，采取整个左肺后大鼠放血2M KOH（4-6毫升）中，并将其放置。在55°C水浴和离开组织消化过夜。加入吐温80（0.25％）洗珠，涡旋（10秒），并离心（2,000 rpm转速，20℃，10分钟）。除去上清液，添加2 - 乙氧基乙基乙酸酯（1毫升），涡旋，并静置1小时。后离心，离心（2000转;（20°C，10分钟），取出2 - 乙氧基乙酯水层含有的荧光，放置在试管和措施，使用日立F-2500型荧光分光光度计（激发612/emission 618 Digilab，州Holliston，MA）。
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Representative Results
血管铸型：左肺动脉缺血大鼠的影响的结果是在图1中所示。显示的是甲基丙烯酸酯演员的支气管血管和广泛的血管，气道左边的树后的28天内LPAL。要获得此铸造，注射全身血管与甲基丙烯酸酯的混合物（红色），降主动脉逆行进入气管插管和注射一个白色的基于硅的材料。血管铸型提供了一个显着的肺支气管血管生成的可视化。特别值得一提的是大，曲折上游的支气管血管的左肺。虽然此图像中显示，右侧支气管是正常的，孤独的，右支气管动脉大血管，但基本上没有。
组织学：在气道血管变化可视化在左肺组织学切片，在图2中所示。支气管炎胶质船只后3天和14天观察到LPAL所示， 图2A中示出了气道部分从左肺后3天LPAL。注意突出支气管气道壁内的船只。插图是从2A染PCNA（增殖细胞核抗原）的串行部分。注意PCNA阳性内皮细胞内衬支气管容器。 图2B示出了从大鼠后14天内，LPAL左肺部。请注意在这个时间点和枯萎的肺动脉支气管血管的大小增加。
功能性血管生成：为了评估通过支气管动脉左肺全身灌流的幅度，荧光微球注入闭塞左颈动脉，使得所有的微球混合在主动脉弓的心输出量的一部分。从这个大小的微球（15微米）的荧光几乎是无法察觉的左肺天真的影响。但是有实质性的，重大的和一致的水平在大鼠左肺测量研究后14天内LPAL。
图1红色丙烯酸甲酯演员曲折的新生血管与左支气管（白色）28天后左肺动脉结扎（LPAL“）的。
图2A。左左肺动脉（PA）支气管血管附 近一个较大的肺动脉结扎后第3天的大鼠肺的气道部分。插图示出了串行部件与PCNA染色，以确定支气管动脉（BA）的增殖的内皮细胞。距离酒吧表示200微米。
<IMG SRC =“所有/ files/ftp_upload/50217/50217fig2B.jpg”ALT =“图2B”/>
图2B。左肺部分从大鼠后14天内LPAL。注意支气管动脉的尺寸的大幅增加。距离酒吧表示500微米。
图3。分析荧光微球（LPAL N = 3只）在左肺天真组（N = 2只），左肺动脉结扎后14天内提出。
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Discussion
左肺动脉结扎在所有物种进行测试导致的缺血性强大的全身新生血管的肺。我们已经提出了详细的手术方法在大鼠模型。我们的研究结果所产生血管铸型，组织病理学，并在体内标记表明支气管动脉增殖和灌注肺实质。因此，的支气管血管生成机制，可以研究平行的人类生存条件的慢性肺血栓栓塞症的动物模型。此外，临床上相关的小动物模型提供了一个机会，学习的形式和功能的新生血管形成的人体实验是站不住脚的。
外科手术提供足够的细节，动物手术经验的技术人员应该能够快速掌握这些技术。虽然我们的观察，主要是在大鼠男大鼠（75-100克），其他菌株也同样适用于研究。我们没有系统地评估了年龄依赖的程度，支气管血管生成。我们还提供了详细的左侧颈总动脉插管。我们已经使用了测量的荧光微球注入到左侧颈动脉逆行，混合作为全身灌注肺缺血，因此，功能性血管发生的一个标记为在主动脉，其后在左肺的小屋。我们承认，这种测量可以是可变的输液的时间期间，由于心输出量的变化。然而，同时不断在这个测量过程之前和期间大鼠全身血压测量显示心血管状态没有变化。此外， 图3中给出的结果表明大鼠的一组内的一个小的可接受的范围内的变异。有趣的是，天真的动物表现出minimallŸ检测的荧光表明正常大鼠支气管灌注在一个非常低的水平。使用更小的大小的微球的可允许检测到一个不同的基础水平的灌注。
我们的研究结果显示发达的血管后28天内LPAL。的甲基丙烯酸酯施放左支气管与支气管血管提供了一个显着的视图的广泛和曲折的新生血管形成响应于肺缺血。也许少戏剧性的，但与血管铸型一致的是从左肺后14天内，LPAL（ 图2B）的组织切片，获得的图像的。大鼠放血组织收获前所示的部分。然而，支气管血管的生长是LPAL（ 图2A）后3天获得的组织切片左肺支气管船只的大小比较时，尤其明显。支气管内皮细胞表现出明显的迹象扩散作为评估采用PCNA染色。因此，血管生成的过程中，开始早期发病后肺缺血。
我们的方法来确定的新生血管程度不等的支气管内皮细胞增殖的全功能的微球测量，支气管血管灌注和血管铸型从早期的组织学评估。我们的目的是提供一种立体支气管血管生成的过程中，随着时间的推移。增殖血管计数需要精确的评估，足够的样本量，并假设与气道的血管是早期血管生成的原发灶。在肺微住宿的评估需要一个全面发展的血管新生血管，因此一晚的现象。此外，该方法假定球体充分混合在输液过程中，在操作过程中，心输出量没有变化，并且该变化的数量提出spher上课反映灌流船只和不是血管反应性变化的数目中的变化。我们认识到，持续的挑战，以更好地定义流程的全身血管生成的器官，通常有两种不同的血管床和肺网络似乎仍然专利缺血。内皮细胞在大鼠的标签没有表现出独特的血管生成表型组织化学分离vasculatures。 活体成像是阻碍通气和心脏运动。我们将继续寻找其他方法来更精确的量化程度的新生血管形成。面临的挑战仍然识别小，但增长的全身血管床，在其他非灌注肺毛细血管网络。
负责缺血诱导的血管生成的机制尚不完全清楚。过去的工作牵连CXC趋化因子在某个阶段发挥作用，在整个过程中13。卡特莱特AUSE左肺在这个模型中是缺血性的，但充分通风，缺氧诱导因子是不大可能发生在全身新生血管发挥作用。应该强调的是，这种情况是与其他器官不同，是伴随着组织缺氧缺血。因此，完整的支气管内的肺血管生长的生长因子负责需要被完全定义。虽然出现增长的新船缺血组织的保护是至关重要的，已被证明是血管生成支气管血管扩张，亲炎症，hyperpermeable的15日，17。这些异常血管的慢性后果包括持续气道狭窄，由于血管扩张和呼吸道水肿18。
该模型涉及到的部位生长因子的释放和响应的船只有关的其他问题。尽管肺缺血，它是全身性的支气管血管，respond到缺血性刺激，而不是其他肺血管内的肺。目前尚不清楚缺血性刺激传送到上游支气管血管。尽管可能由缺血性实质组织，源自主动脉的船只如何被诱导增殖左肺唯一释放多种生长因子是不明确的。未来的试验需要解决这些问题。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们认识到，工作堡，的博士Adlah的MD协助铸造的肺。这项工作已经由NHLBI，HL088005。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| buprenorphine hydrochloride, Puralube | Butler Schein | ||
| bupivicaine | APP Pharmaceuticals | ||
| Povidone-Iodine swabstick | Dynarex Corporation | ||
| polypropylene suture size 6-0, 3/8 circle reverse cutting needle | Myco Medical | ||
| PE20 tubing | Becton Dickinson | ||
| 15 μm crimson polystyrene fluorospheres | Invitrogen | ||
| 1 ml Hamilton glass syringe | Hamilton Company | ||
| Equipment: | |||
| Genie Plus syringe pump | Kent Scientific | ||
| Fluorescence Spectrophotometer | Digilab | ||
| Rodent Ventilator Model 683 | Harvard Apparatus | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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