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Neuroscience

Vertical T-Labyrinth Wahl Assay für Gliederfüßer Response to Geruchsstoffe

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

Eine vertikale, T-Labyrinth Olfaktometer wird zur Bestimmung des Verhaltens Reaktion der Arthropoden beschrieben. Das Olfaktometer ermöglicht der Experimentator, Entscheidungen von Versuchspersonen durchgeführt messen, wenn zwei potenzielle Geruch Feldern ausgesetzt. Beide Attraktion und Abstoßung von Geruchsstoffen kann mit diesem Gerät gemessen werden.

Abstract

Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Insekten und Spinnentiere als Schädlinge von Nutzpflanzen, städtischen Umgebungen oder als Träger von Anlagen und menschliche Krankheiten werden verschiedene Technologien als Kontrollinstrumente entwickelt. Eine Teilmenge dieser Tools konzentriert sich auf Änderung des Verhaltens von Arthropoden durch Anziehung oder Abstoßung. Daher sind Arthropoden oft im Mittelpunkt von Verhaltens Untersuchungen. Diverse Tools wurden entwickelt, um Arthropoden Verhalten, einschließlich Windkanäle, Flug Mühlen, servospheres, und verschiedene Arten von Olfaktometer messen. Der Zweck dieser Werkzeuge ist zu Insekt oder arachnid Reaktion auf visuelle oder öfter Geruchssinn zu messen. Die vertikale T-Labyrinth oflactometer hier beschriebenen Maßnahmen Entscheidungen von Insekten in Reaktion auf Lockmittel oder Repellents durchgeführt. Es ist ein High Throughput-Assay-Gerät, das den Vorteil hat der positive Phototaxis (Anziehung zu hell) und negativen Geotaxis (Neigung zu laufen oder fliegen nach oben) von vielen Arthropoden ausgestellt. Die olfactometer besteht aus einer 30 cm Glasröhre, in der Hälfte mit einem Teflonband bilden ein T-Labyrinth wird geteilt. Jede Hälfte dient als Arm des Olfaktometer ermöglicht die Probanden die Wahl zwischen zwei möglichen Geruch Felder in Assays, die Lockstoffe machen. In Assays, die Abwehrmittel können Fehlen normaler Reaktion auf bekannte Lockstoffe auch als dritte Variable gemessen werden.

Introduction

Arthropoden (einschließlich Insekten und Spinnentiere) werden oft als Schädlinge definiert, weil sie mit den menschlichen Verzehr entweder konkurrieren in landwirtschaftlichen oder städtischen Einstellungen oder übertragen kausalen Erreger der Krankheit ein. Eine große Menge an Investitionen in die Entwicklung von Instrumenten zur solche Schädlinge gemacht. Diese Tools können stark variieren und bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung biorational Werkzeugen, die entweder zu ändern oder zu nutzen das natürliche Verhalten von Schädlingen mit dem Einsatz von Behavioral Lockmittel oder Repellents 2,3 gemacht.

Arthropodenschädlinge verlassen sich oft auf olfaktorische Signale oder Hinweise für die Partnerwahl und / oder Host-Standort 4. Deshalb Entdeckung wirksamer Lockmittel oder Repellents für Schädlinge oft zu Entwicklung von Steuerungs-Tools führen. Dieser Prozess der Entdeckung erfolgt in mehreren Schritten. Erstens muss das natürliche Verhalten des Probanden zu verstehen. Beispielsweise muss man feststellen, ob ein Geschlecht einer bestimmten Art die entgegengesetzte anziehtSex für Mate Lage. Wenn ja, muss festgestellt werden, ob diese durch eine chemische Anziehungskraft vermittelt wird und wo diese chemische hergestellt wird. Weitere Schritte umfassen die Bestimmung, wenn die chemische produziert wird und ihre letztendliche Identifizierung. In diesem Verfahren muss der Versuchsperson (Insekten oder Milben) Verhaltensreaktion auf Geruchsstoffe getestet werden. Anfänglich wird das Verhalten des Probanden zu dem natürlichen Material getestet werden. Zum Beispiel kann eine männliche Motten Antwort auf die der Extrakt seiner weiblichen Artgenossen die Pheromon Verschraubung überprüft werden. Alternativ kann ein Pflanzenfresser Antwort auf den natürlichen Gerüche von der Wirtspflanze getestet werden. Während diese Untersuchungen oft eine praktische Schwerpunkt auf der Entwicklung von Management-Tools 5,6 haben, können sie auch für die Forschung, die mehr grundlegende Fragen, wie Artbildung 7 Adressen angewendet werden. Nachfolgende Schritte beinhalten die Prüfung der Arthropoden Antwort auf synthetische Versionen von identifizierten natürlichen Produkten.

Understanding wie Arthropoden Chemikalien reagieren erfordert die Entwicklung geeigneter Werkzeuge, um ihr Verhalten zu messen. Die Daten von diesen Tools generiert wird davon abhängen, wie gut die Forscher in der Lage, natürliche Verhaltensweisen in einer kontrollierten Umgebung zu messen. Mehr als sechs Jahrzehnte her, da waren anhaltenden Flug Olfaktometer und Tunnel entwickelt, um Insekten Reaktion auf Duftstoffe 8,9 messen. Olfaktometer erheblich variieren in Design und sind oft auf die spezifische Insekten oder Problem untersucht zugeschnitten. Das Ziel dieses Artikels ist es, das Design und die Verwendung von einem vertikal ausgerichteten, T-Labyrinth Olfaktometer zur Messung Insekten Reaktion auf Duftstoffe (Abbildung 1) zu beschreiben. Die Olfaktometer die vertikale Ausrichtung nutzt die negativen Geotaxis (Tendenz nach oben) von vielen Insekten ausgestellt. Eine Lichtquelle direkt oberhalb der Olfaktometer positioniert nutzt die positive Phototaxis (Neigung zur Lichtquelle hin bewegt) durch viele Insekten ausgestellt. Die olfactometer ist besonders nützlich für hemipteran Insekten, die nicht auf eine Bewegung ohne weiteres zeigen in horizontal orientierten Olfaktometer und die stark von Lichtintensität bezüglich Ausrichtung beeinflusst neigen. Jedoch kann diese Vorrichtung für eine Vielzahl von fliegenden und kriechenden Insekten, Spinnentieren sowie verwendet werden. Das Olfaktometer eingesetzt werden, um beide Lockmittel und Repellentien zu bewerten. Im Fall von Lockstoffen, wird der gegabelte Geruch Feld (Abbildung 1) mit dem putativen Lockstoff auf einer Seite gegenüber reiner Luft auf der gegenüberliegenden Seite freigesetzt sind etabliert. Eine Auswahl wird aufgezeichnet, wenn das Insekt an der Basis des Olfaktometers freigesetzt wählt eines der beiden Felder Geruch. Im Falle von Wirkstoffen, eine dritte Verhalten möglich. Neben Aufwärtsbewegung in einem der beiden Felder Geruch, mangelnde Aufwärtsbewegung aufgezeichnet, die eine nicht antwortende Stimulus oder abstoßenden Reiz entweder von Geruch Felder werden.

Protocol

  1. Montage einer speziell angefertigten, zwei Ports aufgeteilt T-Olfaktometer zuvor Mann et al. 10 ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Olfaktometer besteht aus einem 30 cm Glasröhre, die in zwei separate Anschlüsse mit einem Teflonband bilden ein T-Labyrinth gegabelt ist. Jede Hälfte ist analog zu einem Arm eines 2-Wahl Stil Olfaktometer ermöglicht die Testperson zwischen zwei möglichen Geruchs Felder auszuwählen.
    1. Montage und anschließende Tests sollten innerhalb einer temperierten Raum oder Klimakammer nehmen.
    2. Mount Glas T-Labyrinth Olfaktometer vertikal, wie in Abbildung 1 dargestellt und positionieren Sie es unter einem Fluoreszenz-900 lux Glühbirne.
    3. Für eine optimale Lichtstreuung, sollte die Montage in einem 1,0 x 0,6 montiert werden x 0,6 m undurchsichtigen Behälter einheitliche Lichtstreuung zu maximieren.
    4. Schließen Sie die Olfaktometer Arme Geruch Quellen, die in fester Phase Micro-Extraktion Holding / Geruchsquelle chamb untergebracht werdener (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville) durch Teflon; Glasrohr-Anschlüsse. Jedes SPMEC aus einem geraden Glasrohr (17,5 cm lang x 3,5 cm breit) mit einem Einlass-und Auslassventil für ankommende und abgehende Luftströme (Abbildung 1) abgestützt besteht.
    5. Verbinden der Luftzufuhreinrichtung mit einer externen Quelle des befeuchteten und Kohlenstoff-gereinigte Luft, die unter konstantem Druck (das Luftzuführungssystem hat sowohl eine interne Kohlefilter zur Luftreinigung und eine Luft Gasspüler zur Befeuchtung wenn anderen Quellen verfügbar sind) ist.
    6. Lösen gewünschten chemischen Proben in geeigneten Verdünnungsmittel (Lösungsmittel) und Pipette auf eine langsame Freisetzung Substrat wie ein Baumwoll-Docht (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). Die Steuerung sollte die Behandlung eines Baumwolldocht mit Lösungsmittel nur imprägniert bestehen.
    7. Um erhebliche Verschmutzung der Gläser verhindern, umhüllen die Behandlungs-und Kontrollgruppe Baumwolldochte im Labor Gewebe (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) und Platz in den beiden SPMEC Arme (ARS, Inc., Gainesville, FL). Im Fall von lebenden Pflanze Proben kann eine Guillotine flüchtigen Sammelkammer zum Olfaktometer enthaltenden Behandlungen anstelle des SPMEC (Abbildung 1) befestigt werden.
    8. Liefern gereinigt und befeuchtete Luft durch das SPMEC (oder Guillotine flüchtigen Kammer) über zwei Pumpen, der mit einem Luftzuführungssystem (Abbildung 1). Pflegen Luftdurchsatz bei 0,1 L / min durch beide Arme des Olfaktometers.
  2. Verwendung Olfaktometer zur Arthropoden Reaktion auf putative Repellentien testen. In der vorliegenden Beschreibung wurde ein hemipteran Insekt, asiatische Zitrus psyllid, Diaphorina citri, als Test Arthropoden verwendet. Reaktion wurde Zitrus flüchtigen allein oder in Kombination mit einem Repellent (Dimethyldisulfid) und saubere Luft als Geruchsquellen getestet.
    1. Führe alle Experimente an einer standardisierten Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit.
    2. Vor allen Tests Setzen test Probanden um Luft gegenüber reiner Luft oder Lösungsmittel gegenüber Reinluft im T-Labyrinth Olfaktometer reinigen, um die Abwesenheit von Positionsdaten Vorspannung oder eine Wirkung auf das Verhalten des Lösungsmittels der Testperson zu verifizieren.
    3. Zuweisen einer Geruchsquelle zufällig einer der Arme des Olfaktometers zu Beginn eines jeden Bioassay. Rückwärts diese Position nach dem alle 10 Probanden untersucht, mindestens, um mögliche von Positionsdaten Bias zu beseitigen.
    4. Testen des Ansprechens eines mindestens 30 (und bis zu 120) Probanden pro Behandlung Kombination.
    5. Lassen Probanden 100-300 Sek. eine Verhaltensreaktion auf vorher festgelegten Reaktionszeit (Latenz) Intervalls aufweisen.
    6. Rekord, wenn das Motiv in die Behandlung Arm, Querlenker oder bleibt in der Release-Port oder unter dem T-Labyrinth Division.
    7. Note eine Behandlung oder Steuerarm Wahl, wenn ein Testsubjekt kreuzt die Teilung im T-Labyrinth und bewegt sich in beiden Olfaktometer Arm.
    8. Note ein Lösearms Wahl, wenn ein Test sorbehaltlich verbleibt in der Öffnung für die Freisetzung oder unterhalb des T-Labyrinths Division.
    9. Reinigen Sie die Olfaktometer und Verbindungsrohre gründlich mit 2% Seifenlösung und backen Sie die Komponenten aus Glas bei 200 ° F zwischen der Verwendung von unterschiedlichen Geruch Behandlungen.
    10. Für Assays, in dem putativen Repellent Behandlungen im T-Labyrinth Olfaktometer mit oder ohne chemische Behandlung versus Reinluft präsentiert werden, zu vergleichen, die Anzahl der Testpersonen verbleibenden am Abwurfpunkt und nicht in die Olfaktometer zwischen Behandlungen durch Einweg-Varianzanalyse ( ANOVA) gefolgt von HSD-Test Tukey (α <0,05). In Fällen, in denen die Probanden belassen Sie den Arm, vergleichen Sie die Anzahl der Wahl der Lenker gegenüber der Behandlung Arm mit Chi-Quadrat (χ 2) Analyse bei α <0,05.

Representative Results

Attraktion des Asian Citrus psyllid (Diaphorina citri) Erwachsene zu den Gerüchen ihrer Geburt Wirtspflanze flüchtigen (Zitrusfrüchte) ist in 2A dargestellt. Signifikant (α <0,05) mehr Erwachsene wählte den Arm des T-maze Olfaktometer empfangen Gerüche aus lebenden Zitruspflanzen wie mit einem leeren (saubere Luft) Kontrolle verglichen.

Ein Beispiel für Abstoßung in 2B gezeigt. In diesem Fall wurden die Insekten an einem Arm des T-Labyrinths Empfangen Zitrus flüchtigen ausgesetzt, während der zweite Arm aus einem empfangenen flüchtigen Zitrus Pflanze, die mit dem bekannten Repellent, Dimethyldisulfid 11 behandelt wurde. In diesem Fall wurden drei Arten von Verhaltensweisen beobachtet. Die Anzahl der Psylliden am Lösearm verhaftet und reagiert nicht statistisch nicht unterschiedlich von der Anzahl der Eingabe des Arms Empfangen der Gerüche von Zitruspflanzen allein (2B). Allerdings haben keine Blattflöhe den Arm mit ter Wirtspflanze flüchtigen, wenn sie mit der abweisenden (2B) co-präsentiert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der vertikal ausgerichteten T-Labyrinth Olfaktometer verbunden Luftzufuhrsystem und Geruch Behandlung Auslösevorrichtungen. Das Diagramm ist eine Adaption von Abbildung 1 in Mann et al. 10. Ein Prüfling wird einzeln in die Lösekammer des 2-Port geteilt T-Olfaktometer platziert. Es bewegt sich in Richtung der Gerüche durch ein Absperrventil, das bekämpft Aufwärtsbewegung gestattet in die Olfaktometer und verhindert das Insekt aus kriecht zurück in den Abwurfpunkt Bereich. Das Rohr gabelt 10 cm nach dem Tor Wert. Eine positive Reaktion auf einen Geruch wird erfasst, wenn das Insekt bewegt 0,5 cm in einer bestimmten Seite der Division. Büroschneidemaschine flüchtigen Sammelkammer kann anstelle eines Festkörper-PHAs eingesetzt werdene micro-Extraktion Holding / Geruchsquelle Kammer (SPMEC) als Geruchsquelle.

Abbildung 2
Abbildung 2. Response of Asian Citrus psyllid (Diaphorina citri) Erwachsene flüchtigen aus Zitrusfrüchten Wirtspflanzen gegenüber Clean Air Control (A) oder Zitrus flüchtigen gegenüber Zitrusfrüchten flüchtigen mit einer Repellent (Dimethyldisulfid) co-released (B) in einer vertikal ausgerichteten T -maze Olfaktometer 2A:. Ein-Wege-Analyse der Varianz (ANOVA) gefolgt von HSD-Test Tukey (α <0,05) gefolgt wurde durchgeführt, um die Anzahl der psyllid eine Wahl zwischen jedem Arm (2 Behandlungen, n = 120) zu vergleichen. Spalten durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet sind signifikant verschieden voneinander (α <0,05) 2B:. Einfach analysist der Varianz (ANOVA) gefolgt von HSD-Test Tukey (α <0,05) gefolgt wurde durchgeführt, um die Anzahl der psyllid eine Wahl zwischen entweder verbleibenden Arm oder im Freigabepunkt (3 Behandlungen, n = 120) zu vergleichen. Spalten durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet sind signifikant verschieden voneinander (α <0,05).

Discussion

Geruchsstoffe an Hierin werden eine Testvorrichtung und Protokoll zum Messen der Antwort von kleinen Arthropoden (: Hemiptera Psyllidae Insecta) beschrieben. Das Verfahren beinhaltet eine Auswahl-Test, so dass das Insekt, eine Wahl zwischen zwei Feldern Odorans im Falle von Assays Auswerten eines putativen Lockstoff machen. Ferner kann die Testperson drei Arten von Verhaltensweisen, die von dem Verlassen des Lösearm und Eingeben entweder eines von zwei möglichen Geruchs Felder, oder Verbleiben in dem Lösearm, im Falle von Assays Abweisungsvermögen anzuzeigen. Das Olfaktometer ermöglicht hohen Durchsatz Datenerhebung, weil sie ausnutzt der negativen geotactic (Tendenz nach oben zu bewegen) und positive phototaktischen (Tendenz in Richtung Licht bewegen) natürliche Verhaltensreaktion vieler Arthropoden. Obwohl die vorliegende Demo verwendet ein psyllid Insekten-Test kann beispielsweise der Test leicht auf Arthropoden breit, angepasst sowohl diejenigen, die Flucht zu nutzen oder zu Fuß als vorherrschende Verkehrsträger.

12. Die spezifischen Konstruktionen solcher Olfaktometer stark variieren, jedoch beschriebenen Variationen auf das allgemeine Thema des zweiteiligen Wahl Assay hier, wie auch, ähnlich Y-Schlauch Assays wurden oft verwendet, um ansprechend auf Arthropoden Chemikalien zu messen. Größere Flug Tunneln, die anhaltenden Flug der Insekten 9 verursachen auch in der Sammlung von wegweisenden Daten der Aufklärung der grundlegenden Mechanismen von Insekten Flug und Orientierung Semiochemikalien sowie Daten informieren praktischen Einsatz der Schädlingsbekämpfung Werkzeugen geführt.

Es ist oft notwendig, um maßgeschneiderte Design ein Olfaktometer und zugehörigen Geräten für die Biologie des spezifischen Arthropoden Testperson. Jene, die unter Olfaktometer einer allgemeinen Gruppe von Insekten verwendet werden können, sind nützlicher als diejenigen specific auf eine kleine Gruppe, aber manchmal ist die wirtschaftliche Bedeutung einer kleinen Gruppe von Insekten diktiert die Notwendigkeit der Entwicklung einer ganz bestimmten Olfaktometer und Assay-Technik. Die aktuell beschriebenen Design baut auf bisher bekannten Arthropoden Techniken. Es ermöglicht eine Standard-Zwei-Wahl Assay als Y-Rohr Bioassays, in denen die experimentelle Arena oder Choice-Test nimmt die Form eines Y-förmigen Glas 7 auf. Typischerweise wird ein Arm eines derartigen Y-Rohr erhalten eine Behandlung Odorans, während die andere leer gelassen werden 13. Variationen solcher Olfaktometer kann Zugabe von mehreren Strahler-Arme 14 und sogar Zugabe eines Bodens Medium zur Untersuchung auf das Verhalten der Organismen Bewegen durch den Boden 15. Bei der Entwicklung solcher Olfaktometer und zugehörige Tests ist es wichtig zu prüfen, wie eng natürlichen Bedingungen repliziert werden und somit die wahre Bedeutung der untersuchten Verhaltensreaktionen in Bezug auf die Probanden Biologie. Zu einem large Grad, werden die erhobenen Daten nur so nützlich wie die Relevanz des Verhaltens Bioassay mit Bezug auf des Organismus Verhaltensökologie 16.

Die aktuell beschriebenen Olfaktometer und Verhaltensstörungen Bioassay ist speziell für eine hemipteran Insekt, das die Flucht so kurz "springt" 16 zu initiieren tendiert konzipiert. Die vertikale Ausrichtung des Olfaktometer und die Lichtquelle Anordnung erleichtert die Einleitung Insekt Bewegung und damit eine nachfolgende chemisch-vermittelte Orientierungsverhalten kann getestet effizient und mit hoher Durchsatzleistung werden. Dieses Verhalten Assay Anordnung kann wahrscheinlich für eine breite Palette von Fliegen oder zu Fuß Arthropoden Taxa oder könnte auch leicht modifiziert werden, um die Notwendigkeit von Nicht-Arthropoden Organismen passen verwendet werden.

Disclosures

Der Autor wurde mit Mitteln, die von der Citrus Forschung und Entwicklung Foundation bereitgestellt.

Acknowledgments

Die Citrus Forschung und Entwicklung Foundation für die Finanzierung anerkannt. Dank Engel Hoyte und Michael Flores für die Durchführung von Bioassays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

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References

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Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

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