Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Вертикальный Т-образном лабиринте Choice анализа для членистоногих ответ на Отдушки

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

Вертикальные, Т-образном лабиринте Ольфактометр описано для опробования поведенческая реакция членистоногих. Ольфактометр позволяет экспериментатору для измерения выборы выполняемых испытуемыми при воздействии на двух потенциальных полей запах. Оба влечения к и отталкивания от пахучих веществ может быть измерена с этим устройством.

Abstract

Учитывая экономическую важность насекомых и паукообразных, как вредители сельскохозяйственных культур, городской среде или в качестве векторов растений и болезни человека, различные технологии, которые разработаны как инструменты управления. Подмножество этих средств направлена ​​на изменение поведения членистоногих на притяжение или отталкивание. Таким образом, членистоногие, часто в центре внимания поведенческих исследований. Различные инструменты были разработаны для оценки поведения членистоногих, в том числе аэродинамических трубах, полет мельницы, servospheres, а также различные типы olfactometers. Цель этих инструментов заключается в измерении насекомых или паукообразных ответ на зрительные или чаще, обонятельные сигналы. Вертикальные Т-образном лабиринте oflactometer описанные здесь меры выборы выполняется насекомых в ответ на аттрактантов или репеллентов. Это высокая пропускная способность устройств анализа, который использует положительный фототаксис (привлечение к свету) и отрицательный геотаксис (склонность идти или лететь вверх) выставлены многих членистоногих. Olfactometэ состоит из 30 см стеклянная трубка, которая разделена на две половины полосы тефлоновым формирования Т-образном лабиринте. Каждая половина служит руку Ольфактометр позволяет испытуемых сделать выбор между двумя потенциальными поля запаха в тестах с участием аттрактантов. В тестах с участием репелленты, отсутствие нормального ответа на известный аттрактанты также может быть измерена в качестве третьей переменной.

Introduction

Членистоногие (в том числе насекомые и паукообразные) часто определяется как вредители, потому что они либо конкурировать с потребления человеком в сельскохозяйственных или городских условиях или передавать причинно возбудителей болезней 1. Большой объем инвестиции сделаны в развитие средств управления для таких вредителей. Эти инструменты могут варьироваться в широких пределах и на значительный прогресс, достигнутый в разработке biorational инструменты, которые либо изменить или использовать естественное поведение вредителей с использованием поведенческого аттрактантов или репеллентов 2,3.

Членистоногих вредителей часто полагаются на обонятельные сигналы или сигналы для партнера и / или места размещения 4. Поэтому открытие эффективных аттрактантов или репеллентов для вредителей часто может привести к разработке средств борьбы. Этот процесс открытия включает в себя несколько этапов. Во-первых, естественное поведение испытуемого должно быть понято. Например, необходимо удостовериться в том, одного пола данного вида привлекает противоположныйсекс за мат месте. Если так, то надо определить, является ли привлечение опосредовано химическим и где это химическое вещество производится. Дальнейшие шаги включают в себя определения, когда химическое вещество производится и его возможной идентификации. На протяжении этой процедуры (насекомых или клещей) испытуемого поведенческий ответ на пахучих веществ должны быть проверены. Изначально поведение испытуемого будут проверены на природный материал. Например, в ответ мужчина моли может быть проверен на что экстракт из его женщин конспецифичный феромоном железы. Кроме того, ответ травоядное к естественным запахом своего хозяина завода может быть проверена. Хотя эти исследования часто имеют практическую направленность на развитие средств управления 5,6, они также могут быть применены к исследованиям, которые направлены более фундаментальные вопросы, такие, как видообразование 7. Последующие шаги включают в себя тестирование ответ членистоногих на синтетической версии определили натуральные продукты.

Understanding как членистоногие реагируют на химические вещества требует разработки соответствующих инструментов для оценки их поведения. Данные, полученные в таких инструментов будет зависеть от того, насколько хорошо следователь может измерять природные поведения в контролируемых условиях. За шесть десятилетий назад, устойчивый olfactometers полета и туннели были разработаны для измерения насекомых ответ на отдушки 8,9. Olfactometers существенно различаются по дизайну и часто приспосабливают к конкретным насекомым или проблемы ведется расследование. Целью данной статьи является описание конструкции и использования в вертикальном положении, Т-образном лабиринте Ольфактометр для измерения насекомых ответ на пахучих веществ (рис. 1). Вертикальная ориентация Ольфактометр занимает преимущество отрицательных геотаксис (тенденция к движению вверх) выставлены многие насекомые. Источник света расположен непосредственно над Ольфактометр использует положительный фототаксис (тенденция двигаться в направлении источника света) выставлены многие насекомые. Olfactomметр особенно полезно для hemipteran насекомых, как правило, не проявляют движения легко в горизонтально-ориентированным olfactometers и сильно зависят от интенсивности света по отношению к ориентации. Тем не менее, это устройство может быть использовано для широкого круга летающих и ползающих насекомых, а также паукообразных. Ольфактометр могут быть использованы для оценки как аттрактанты и репелленты. В случае аттрактанты, раздвоенные поле запаха (рис. 1) устанавливается с предполагаемым аттрактанта выпущен на одной стороне по сравнению с чистым воздухом выпущен на противоположной стороне. Выбор регистрируется, когда насекомое выпущен на базе Ольфактометр выбирает один из двух полей запах. В случае репелленты, третий поведение возможно. В дополнение к восходящего движения в любом из двух запахов полей, отсутствие движения вверх могут быть записаны указывает не отвечающих стимул или отталкивающих стимул либо запах полей.

Protocol

  1. Собрание специально разработан, два порта разделена T-Ольфактометр описано ранее в Mann и др. 10. Показано на рисунке 1. Ольфактометр состоит из 30 см стеклянная трубка, которая раздвоенный на два отдельных портов с полосой тефлоновым формирования Т-образном лабиринте. Каждая половина аналогичный руки 2-выбор стиля Ольфактометр позволяет испытуемому выбирать между двумя потенциальных полей запах.
    1. Ассамблеи и последующие анализы должны проводиться в пределах контролируемой температурой помещения или экологической камеры.
    2. Горы стекла Т-образном лабиринте Ольфактометр вертикально, как показано на рисунке 1 и поместить его под флуоресцентным 900 лампочка люкс.
    3. Для оптимального рассеивания света, сборка должна быть установлена ​​в пределах 1,0 х 0,6 х 0,6 м непрозрачном контейнере максимально равномерного рассеивания света.
    4. Подключите Ольфактометр оружия запах источников, которые будут размещены в твердой фазе микро-добыча холдинга / запаха источник chambER (SPMEC) (ARS, Inc, Gainesville) через тефлоновую; стекло разъемы трубы. Каждый SPMEC состоит из прямой стеклянной трубке (17,5 см х 3,5 см) поддерживается с впускным и выпускным клапаном для входящего и исходящего потоков воздуха (рис. 1).
    5. Подключите систему подачи воздуха к внешнему источнику увлажненной и углерод-очищенный воздух, который находится под постоянным давлением (система подачи воздуха имеет как внутренний угольный фильтр для очистки воздуха и воздушный барботер для увлажнения, если внешние источники недоступны).
    6. Растворите желаемого образцов химического вещества в рамках соответствующего растворителя (растворителей) и пипетки на медленном подложки релизе, такие как хлопковый фитиль (Petty Джон Packaging, Inc, Конкорд, Северная Каролина). Контроль лечения должна состоять из хлопка фитилем пропитанной растворителем только.
    7. Для предотвращения значительного загрязнения посуды, обволакивают обработанных и контрольных хлопка фитили в лаборатории ткань (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) и поместить в две руки SPMEC (ARS, Inc, Gainesville). В случае живые образцы растений, гильотины летучих камеры коллекции можно прикрепить к Ольфактометр содержащих процедуры в месте SPMEC (рис. 1).
    8. Доставка очищенный и увлажненный воздух через SPMEC (или гильотина летучих камеры) с помощью двух насосов, подключенных к системе подачи воздуха (рис. 1). Поддерживать скорость воздушного потока на уровне 0,1 л / мин через обе руки Ольфактометр.
  2. Используя Ольфактометр для проверки членистоногих ответ на предполагаемую репелленты. В настоящем описании, насекомых hemipteran, азиатские psyllid цитрусовых, Diaphorina citri, была использована в качестве теста членистоногих. Ответ был протестирован на цитрусовые летучих отдельно или в комбинации с репеллентом (диметилдисульфид) и чистый воздух, запах источников.
    1. Проведение всех экспериментов на стандартизированные температуры и относительной влажности.
    2. До всех испытаний, разоблачить тEst предметы для очистки воздуха по сравнению с чистым воздухом или растворителя по сравнению с чистым воздухом в Т-образном лабиринте Ольфактометр, чтобы убедиться в отсутствии позиционные ошибки или влияние растворителя на поведение испытуемого.
    3. Назначьте источник запаха случайно в одном из рук Ольфактометр в начале каждого биопроб. Обратный эту позицию через каждые 10 испытуемых исследовали, как минимум, для устранения потенциальных позиционной ошибки.
    4. Проверить реакцию, как минимум, 30 (до 120) испытуемых в лечении комбинацией.
    5. Разрешить испытуемых 100-300 сек проявляют поведенческие реакции на основе ранее установленных ответа (задержка) интервала.
    6. Запись, если объект входит в лечении руку, рычаг или остается в освобождении порта или ниже Т-образном лабиринте дивизии.
    7. Забьет выбора лечения или рычага, когда испытуемый проходит разделение в Т-образном лабиринте и движется в любой Ольфактометр руку.
    8. Забьет выбор релиз руку, когда испытание сubject остается в релизе порта или ниже Т-образном лабиринте дивизии.
    9. Очистите Ольфактометр и соединительные трубки тщательно с 2% мыльным раствором и выпекать стеклянных компонентов при 200 ° F между использованием различных методов лечения запаха.
    10. Для тестов, в которых предполагаемый репелленты лечения представлена ​​в Т-образном лабиринте Ольфактометр с или без химической обработки по сравнению с чистым воздухом, сравнить число испытуемых, оставшихся в релизе точку и не входящих в Ольфактометр между курсами лечения одного дисперсионного анализа ( ANOVA) с последующим HSD тест Тьюки (α <0,05). В случаях, когда испытуемые оставить выпуска рука, сравнить количество выборе рычагов по отношению к лечению руку с хи-квадрат (χ 2) анализ на α <0,05.

Representative Results

Привлечение азиатских цитрусовых psyllid (Diaphorina citri) взрослые запахи своей натальной растения-хозяина летучие вещества (цитрусовые) изображен на рисунке 2А. Значительно (α <0,05) более взрослых выбрал рука Т-образном лабиринте Ольфактометр получения запахов из живых растений цитрусовых по сравнению с пустой (чистый воздух) управления.

Например отталкивания показано на рисунке 2B. В этом случае, насекомые подвергаются одной руке Т-образном лабиринте получения летучих цитрусовых, а вторая группа получала летучих веществ из цитрусовых растений, которые обрабатывают известный репеллент, диметилдисульфид 11. В этом случае, три типа поведения не наблюдалось. Число псиллид арестован в релизе руку и не отвечает не отличается статистически от числа входящих руку получения запахов из цитрусовых в одиночку (рис. 2В). Тем не менее, не псиллид вошел в руке содержащие тОн растения-хозяина летучих при совместном представлены репелленты (рис. 2В).

Рисунок 1
Рисунок 1. Принципиальная схема вертикально ориентированные Т-образном лабиринте Ольфактометр присоединился к воздушной системе доставки и запах устройств обработки релизе. Диаграмма адаптации Рисунке 1 в Mann и соавт. 10. Испытуемый находится индивидуально в релизе палаты 2-портовый разделен T-Ольфактометр. Она движется к запахам через задвижку, которая позволяет управлять восходящее движение в Ольфактометр и предотвращает от ползания насекомых обратно в область точки релизе. Трубы раздваивается 10 см после того, как ворота значения. Положительный ответ на запах регистрируются один раз насекомое движется 0,5 см в определенной части дивизии. Гильотина летучих камеру коллекция может быть использована вместо твердой фа-электронной микро-добыча холдинга / запаха источник камера (SPMEC) в качестве источника запаха.

Рисунок 2
Рисунок 2. Реакция азиатских цитрусовых psyllid (Diaphorina citri) взрослых летучих веществ из цитрусовых растений-хозяев по сравнению с чистым воздухом управления (A) или цитрусовых летучих веществ по сравнению с цитрусовыми летучих совместно выпустили с репеллентом (диметилдисульфид) (B) в вертикально ориентированных T -лабиринт Ольфактометр рис. 2A. один дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим HSD тест Тьюки (α <0,05) было проведено с целью сравнить количество psyllid сделать выбор между одной группе (2 лечения, n = 120). Колонны указано разные буквы значительно отличаются друг от друга (α <0,05) Рисунок 2B. Один конец analysявляется дисперсионный (ANOVA) с последующим HSD тест Тьюки (α <0,05) было проведено с целью сравнить количество psyllid сделать выбор между либо руку или оставшихся в релизе точке (3 лечения, n = 120). Колонны указано разные буквы значительно отличаются друг от друга (α <0,05).

Discussion

При этом, устройство анализа и протокола описаны для измерения реакции мелких членистоногих (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) для отдушки. Метод включает в себя выбор теста, что позволяет насекомым сделать выбор между двумя полями одоранта в случае анализа оценки предполагаемых аттрактанта. Кроме того, испытуемый может отображать три типа поведения, оставляя выпуск руку и введя один из двух потенциальных полей запах, или оставаться в релизе руку, в случае отталкивание анализов. Ольфактометр позволяет обеспечить высокую пропускную сбор данных, поскольку она использует отрицательные geotactic (тенденция к движению вверх) и положительный phototactic (тенденция двигаться к свету) природные поведенческие реакции многих членистоногих. Хотя настоящая демонстрация использует psyllid тестовый пример насекомых, анализ может быть легко адаптирован для членистоногих широко, как те, которые используют полета или при ходьбе, как преобладающей видами транспорта.

12. Конкретные проекты такого olfactometers варьироваться в широких пределах, однако, вариации на общую тему двух выбором анализа, описанного здесь, а также, аналогично Y-трубка анализы были часто используются для измерения членистоногих ответ на химические вещества. Увеличенная полета туннелей, которые могут вызвать устойчивый полет насекомых 9 также привели к коллекции новаторский данных выяснение фундаментальных механизмов полета насекомых и ориентации на semiochemicals, а также данных, информирование практического использования вредителями инструментов управления.

Это часто бывает необходимо адаптировать дизайн Ольфактометр и связанные с ними приборы для биологии конкретных членистоногих испытуемый. Те, olfactometers которые могут быть использованы среди общей группы насекомых являются более полезными, чем те, билдИФИК к небольшой группе, однако иногда экономическое значение небольшой группы насекомых диктует необходимость развития очень специфический Ольфактометр и анализа техники. В настоящее время описанная конструкция опирается на ранее знакомые методы членистоногих. Это позволяет более двух стандартных выбором, чем анализ Y-трубка биопроб, в которых экспериментальные арене или выбора теста осуществляется в форме У-образный стеклянный прибор 7. Как правило, одна рука такой Y-трубка будет получать лечение запахом, в то время как другие будут оставлены пустыми 13. Вариации на такие olfactometers может включать в себя добавление нескольких излучающих оружия 14 и даже добавление почвенной среды для анализом поведения организмов перемещения через почву 15. При разработке таких olfactometers и связанных с ним анализы, важно рассмотреть, насколько тесно природные условия реплицируются и, таким образом истинную значимость оценки поведенческих реакций с точки зрения биологии испытуемых. Для а-ляRGE степени, данные, собранные будет только так полезна, как актуальность поведенческий биологической активности по отношению к поведенческой экологии организма 16.

В настоящее время описано Ольфактометр и поведенческого анализа биологической активности разработан специально для насекомых hemipteran, которая имеет тенденцию начинать полет в качестве коротких "скачки" 16. Вертикальная ориентация Ольфактометр и свет расположения источника облегчения начала движения насекомого и, следовательно, последующие химически-опосредованной ориентации поведения могут быть проанализированы эффективно и с высокой пропускной способностью. Этот поведенческий анализ расположения вероятнее всего, может быть использован для широкого спектра летать или ходить таксонов членистоногих или могут быть также легко изменен, чтобы соответствовать потребности не-членистоногими организмов.

Disclosures

Автор получил финансирование, которое было предоставлено исследований цитрусовых и Фонд развития.

Acknowledgments

Исследования цитрусовых и Фонд развития признается за предоставление финансирования. Благодаря Ангел Хойт и Майкл Флорес для проведения биопробы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Resh, R. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. Academic Press, Elsevier Science. USA. (2003).
  2. Biorational tree-fruit pest management. Aluja, M., Lesky, T. C., Vincent, C. CABI. USA. (2009).
  3. Rodriquez-Saona, C., Stelinski, L. L. Behavior-modifying strategies in IPM: Theory and Practice. Integrated Pest Management: Innovation - Development Process. Peshin, R., Dhawan, A. K. Springer. NY. 261-311 (2009).
  4. Cardé, R. T., Millar, J. G. Advances in insect chemical ecology. Cambridge University Press. UK. (2004).
  5. Knight, A. L., Stelinski, L. L., Hebert, V., Gut, L., Light, D., Brunner, J. Novel dispensers simultaneously releasing pear ester and sex pheromone for disruption of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 79-86 (2012).
  6. Mann, R. S., Tiwari, S., Smoot, J. M., Rouseff, R. L., Stelinski, L. L. Repellency and toxicity of plant-based essential oils and their constituents against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 87-96 (2012).
  7. Forbes, A. A., Powell, H. Q., Stelinski, L. L., Smith, J. J., Feder, J. L. Sequential sympatric speciation across trophic levels. Science. 323, (5915), 776-779 (2009).
  8. Kennedy, J. S. The visual responses of flying mosquitos. Proceedings of the Zoological Society of London A. 109, (4), 221-242 (1940).
  9. Miller, J. R., Roelofs, W. L. Sustained-flight tunnel for measuring insect responses to wind-borne sex pheromones. Journal of Chemical Ecology. 4, (2), 187-198 (1978).
  10. Mann, R. S., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Castle, W. S., Stelinski, L. L. Sulfur volatiles from Allium spp. affect Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), response to citrus volatiles. Bulletin of Entomological Research. 101, (1), 89-97 (2011).
  11. Onagbola, E. O., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Stelinski, L. L. Guava leaf volatiles and dimethyl disulfide inhibit response of Diaphorina citri Kuwayama to host plant volatiles. Journal of Applied Entomology. 135, (6), 404-414 (2011).
  12. Baker, T. C., Linn, C. E. Wind tunnels in pheromone research. Techniques in Pheromone Research. Hummel, H., Miller, T. A. Springer-Verlag. New York. 75-110 (1984).
  13. Stelinski, L. L., Rodriguez-Saona, C., Meyer, W. L. Recognition of foreign oviposition marking pheromone in a multitrophic context. Naturwissenschaften. 96, (5), 585-592 (2009).
  14. Gökçe, A., Stelinski, L. L., Whalon, M. E. Behavioral and electrophysiological responses of leafroller moths to selected plant extracts. Environmental Entomology. 34, (6), 1426-1432 (2005).
  15. Ali, J. G., Alborn, H. T., et al. herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats. PLoS ONE. 7, (6), e38146 (2012).
  16. Mann, R. S., Ali, J. G., et al. Induced release of a plant defense volatile 'deceptively' attracts insect vectors to plants infected with a bacterial pathogen. PLoS Pathogens. 8, (3), e1002610 (2012).
Вертикальный Т-образном лабиринте Choice анализа для членистоногих ответ на Отдушки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter