Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Koku için Arthropod Tepki için Dikey T-labirent Seçim Testi

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

Dikey bir T-labirent salgılanan eklembacaklıların davranışsal tepki içlin tarif edilmektedir. Salgılanan iki potansiyel koku alanlara maruz kaldığında deneyci denekler tarafından gerçekleştirilen seçimler ölçmek için sağlar. Her ikisi için çekim ve koku maddesi arasından itme bu cihaz ile ölçülebilir.

Abstract

Tarım ürünleri, kentsel ortamlarda veya bitki ve insan hastalıkların vektörleri olarak zararlıları böcekler ve arachnids ekonomik önemi göz önüne alındığında, çeşitli teknolojiler kontrol araçları olarak geliştirilmektedir. Bu araçların bir alt kümesi çekim ya da itme tarafından eklembacaklıların davranışını değiştirerek odaklanır. Bu nedenle, eklembacaklılar genellikle davranışsal araştırmaların odak vardır. Çeşitli araçları rüzgar tünelleri, uçuş fabrikaları, servospheres ve olfactometers çeşitli türleri de dahil olmak eklembacaklı davranışı ölçmek için geliştirilmiştir. Bu araçların amacı, koku daha sık görsel veya ipuçları için böcek veya örümcek yanıtı ölçmektir. Burada açıklanan dikey T-labirent oflactometer cezbedicilerde veya kovucular yanıt olarak böcekler tarafından gerçekleştirilen seçimler ölçer. Bu olumlu phototaxis (ışık cazibe) ve birçok eklembacaklılar tarafından sergilenen olumsuz geotaxis (yürümek ya da yukarı uçmak eğilimi) yararlanır yüksek verimlilik test cihazıdır. Olfactometer bir T-labirent oluşturan bir Teflon şerit ile ikiye bölünmüş olan bir 30 cm cam tüp oluşur. Her yarım denek Cezbedici içeren testler iki potansiyel koku alanlar arasında bir seçim yapmak sağlayan salgılanan bir kolu olarak hizmet vermektedir. Iticiler içeren analizlerde, cezbediciler bilinen normal tepki olmaması, aynı zamanda, üçüncü bir değişkenin olarak ölçülebilir.

Introduction

Onlar da tarım veya kentsel ortamlarda insan tüketimi ile rekabet veya hastalık 1 nedensel patojenleri çünkü Eklembacaklılar (böcekler ve örümcekler gibi) sık sık, zararlıları olarak tanımlanır. Yatırımın büyük bir miktarı gibi zararlıların kontrol araçlarının geliştirilmesine yönelik yapılır. Bu araçlar büyük ölçüde değişebilir ve önemli ilerleme ya değiştirmek veya davranışsal çekiciler veya kovucular 2,3 kullanımı ile zararlıların doğal davranış istismar biorational araçları geliştirilmesi konusunda ilerleme kaydedilmiştir.

Arthropod zararlılar genellikle eşini ve / veya konak yeri 4 koku sinyalleri veya ipuçları güveniyor. Bu nedenle zararlıları için etkili cezbedicilerde veya kovucular keşif sıklıkla kontrol araçlarının gelişmesine yol açabilir. Bu keşif sürecinde çeşitli adımlar içerir. Birincisi, test konu doğal davranışı anlaşılmalıdır. Örneğin, belirli bir tür bir cinsiyet ters çeken olmadığını anlamak gerekirdostum konum için seks. Eğer öyleyse, bir bu cazibe bir kimyasal aracılık etmektedir ve nerede olduğu kimyasal üretti olup olmadığını belirlemek gerekir. Ayrıntılı adımlar kimyasal üretilir zaman belirleme ve nihai tanımlama içerir. Bu prosedür boyunca, koku için test öznenin (böcek veya akarı) davranışsal tepkisi test edilmelidir. İlk olarak, test konusu davranışını doğal malzeme ile test edilir. Örneğin, bir erkek güve yanıtın onun dişi conspecific feromon bezinin özü ki için test edilebilir. Alternatif olarak, bu bitkinin doğal kokular için bir otçulun tepkisini test edilebilir. Bu araştırmaların çoğu yönetim araçları 5,6 gelişimine pratik bir odak var, onlar da böyle bir türleşme 7 gibi daha temel sorular, adresleri araştırma uygulanabilir. Sonraki adımları tespit doğal ürünler sentetik sürümleri için eklembacaklı tepkisini test etmeyi gerektirir.

Ueklembacaklılar kimyasallar nasıl tepki nderstanding uygun araçlar geliştirme davranışlarını ölçmek için gerektirir. Bu tür araçlar tarafından oluşturulan veriler araştırmacı kontrollü bir ortamda doğal davranışları ölçebilir ne kadar iyi bağlıdır. Fazla altı yıl önce, sürekli uçuş olfactometers ve tüneller koku 8,9 böcek yanıtı ölçmek amacıyla geliştirilmiştir. Olfactometers tasarım önemli ölçüde değişebilir ve genellikle araştırılan belirli böcek veya probleme tasarlandı. Bu makalenin amacı, koku (Şekil 1) böcek tepkisini ölçmek için bir dikey odaklı, T-labirent salgılanan tasarım ve kullanımını tarif etmektir. Salgılanan dikey yönlendirme birçok böcekler tarafından sergilenen olumsuz geotaxis (yukarı taşımak eğilimi) yararlanır. Doğrudan salgılanan üzerine yerleştirilmiş bir ışık kaynağı birçok böcekler tarafından sergilenen olumlu phototaxis (ışık kaynağına doğru hareket eğilimi) yararlanır. Olfactometre yatay odaklı olfactometers içinde kolaylıkla hareket sergilemeye ve yoğun yönelimi açısından ışık yoğunluğu etkili olduğunu değil eğilimindedir hemipteran böcekler için özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, bu cihaz uçan böceklerin ve tarama gibi örümcekler, geniş bir aralığı için de kullanılabilir. Cezbedici salgılanan ve geri püskürtme ajanları değerlendirmek için kullanılabilmektedir. Cezbedici durumunda, çatallı koku alanı (Şekil 1) karşı tarafında serbest temiz hava karşı bir tarafında serbest farzedilen cezbedici ile elde edilir. Salgılanan tabanında serbest böcek iki koku alanlarından birini seçtiği zaman bir seçim kaydedilir. Kovucular durumunda, üçüncü bir davranış mümkündür. İki koku alan, yukarı hareketi eksikliği ya duyarlı olmayan uyarana gösteren veya koku alanların birinden uyaran kovucu kayıt edilebilir içine yukarı hareketi dışında.

Protocol

  1. Montajı bir, iki bağlantı noktası bölünmüş, özel olarak tasarlanmış T-salgılanan önceden Mann ve ark içinde tanımlanmıştır. 10, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Salgılanan bir T-labirent oluşturan bir Teflon şerit ile iki ayrı portu içine çatal bir 30 cm cam tüp oluşur. Her yarım denek iki potansiyel koku alanları arasında seçim sağlayan bir 2-seçim tarzı salgılanan bir kola benzer.
    1. Montaj ve sonraki deneyler sıcaklık kontrollü bir oda ya da çevre bölmesi içinde yer almalıdır.
    2. Montaj cam T-labirent salgılanan dikey olarak Şekil 1'de gösterildiği gibi ve bir floresan 900 lüks ampul altında yerleştirin.
    3. Optimum ışık dağılımı için, montaj x 0,6 m opak konteyner muntazam ışık difüzyon maksimize etmek için bir 1.0 x 0.6 içinde monte edilmelidir.
    4. Katı faz mikro ekstraksiyon tutma / koku kaynağı chamb muhafaza edilecektir koku kaynaklarına salgılanan kolları takın-cam tüp konnektörleri; teflon aracılığıyla er (SPMEC) (ARS, Inc, Gainesville, FL). Her SPMEC gelen ve giden hava akışı (Şekil 1) için bir giriş ve çıkış vanası ile desteklenen düz bir cam tüp (x 3,5 cm genişliğinde 17,5 cm uzunluğunda) oluşmaktadır.
    5. Sabit basınç (harici kaynaklardan doluysa hava dağıtım sistemi nemlendirme için hava temizleme için dahili bir karbon filtre ve hava bubbler ikisi var) altında nemlendirilmesi ve karbon-saflaştırılmış hava harici bir kaynak için hava dağıtım sistemi bağlayın.
    6. Böyle bir pamuk fitil (Petty John Ambalaj A.Ş., Concord, NC) olarak yavaş salınımlı yüzeye uygun seyreltici (çözücü) ve pipet içinde istenen kimyasal örnekler çözülür. Kontrol tedavi sadece çözücü emdirilmiş bir pamuk fitil oluşmalıdır.
    7. Cam önemli kirlenmesini önlemek için, laboratuar dokusunda tedavi ve kontrol pamuk fitilleri (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell zarfın, GA) ve iki SPMEC silah (ARS, Inc, Gainesville, FL) içine yerleştirin. Canlı bitki örnekleri durumunda, bir giyotin uçucu toplama haznesi SPMEC yerine (Şekil 1) ihtiva eden tedaviler salgılanan eklenebilir.
    8. Saflaştırıldı ve bir hava dağıtım sistemi (bkz. Şekil 1) bağlı iki pompa vasıtasıyla SPMEC (ya da giyotin uçucu oda) ile nemlendirilmiş hava sunun. 0,1 L / salgılanan kolları hem aracılığıyla dk hava akımı hızı koruyun.
  2. Varsayılan kovucular da artropod cevabı test etmek için salgılanan istihdam. Mevcut tarifte, bir böcek hemipteran, Asya narenciye psyllid, Diaphorina citri, bir test artropod olarak kullanılmıştır. Tepki narenciye uçucular tek veya kombine olarak bir kovucu (dimetil disülfür) ve koku kaynağı olarak temiz hava ile karşı test edilmiştir.
    1. Standart sıcaklık ve bağıl nem tüm deneyler yürütmek.
    2. Önce tüm testleri, t maruzest konular konumsal sapma veya denek davranışları üzerinde çözücü bir etki olmaması doğrulamak için T-labirent salgılanan hava karşı temiz hava veya solvent karşısında temiz hava temizlemek için.
    3. Rasgele her bir bioassay başında salgılanan ve bir kolu için bir koku kaynağı atama. Her 10 denek test sonrası pozisyonel yanlılık potansiyelini ortadan kaldırmak için, en azından, bu pozisyon Ters.
    4. En az 30 (ve üstü 120) tedavi kombinasyonu başına deneklerin tepkisi sınayın.
    5. Denekler 100-300 sn önce kurulmuş yanıt (gecikme) aralığına dayalı bir davranışsal tepki göstermeye izin ver.
    6. Rekor eğer konu tedavi kolunda, kontrol kolu girer veya serbest liman veya T-labirent bölümü aşağıda kalır.
    7. Bir denek T-labirent ve ya salgılanan kolda içine hamle bölümü geçtiğinde bir tedavi veya kontrol kolu seçim Atar.
    8. Ne zaman bir test s çıkarma kolu seçim Atarubject serbest liman veya T-labirent bölümü aşağıda kalır.
    9. % 2 sabun solüsyonu ile iyice salgılanan ve bağlantı boruları temizleyin ve farklı koku tedavilerin kullanımı arasında 200 ° F 'de cam parçaları pişirin.
    10. Varsayılan kovucu tedavileri ile veya temiz hava karşısında kimyasal arıtma olmaksızın T-labirent salgılanan sunulmuştur hangi testlerde, serbest noktada kalan deneklerin sayısını karşılaştırın ve tedaviler arasında salgılanan tek yönlü varyans analizi ile girmemek ( ANOVA) Tukey HSD testi (α <0.05) izledi. Denekler serbest kolu terk ettiği durumlarda, Ki-kare (χ 2) α <0.05 analizi ile tedavi kolunda karşı kontrol koldan numarasını karşılaştırın.

Representative Results

Kendi doğum konukçu bitki uçucu (turunçgil) ve kokulara Asya narenciye psyllid (Diaphorina citri) yetişkin Atraksiyon Şekil 2A tasvir edilir. Boş (temiz hava) kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak (α <0.05) fazla yetişkin yaşayan turunçgiller kokuları alan T-labirent salgılanan bir kol seçti.

Itme bir örnek, Şekil 2B'de gösterilmiştir. Ikinci kol bilinen itici, dimetil disulfide 11 ile muamele edilmiş, bir narenciye bitki uçucular, alınan Bu durumda, böcekler, T-alıcı labirent narenciye uçucu bir kol maruz bırakıldı. Bu durumda, üç tip davranış gözlendi. Serbest kol tutuklandı ve yalnız turunçgiller (Şekil 2B) kokuları alma kolu giren sayısını istatistiksel fark yoktu yanıt vermiyor psyllids sayısı. Bununla birlikte, psyllids t ihtiva eden kol girdi(Şekil 2B) kovucu ile birlikte sunulduğunda o uçucu bitki barındırabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Dikey yönelimli T-labirent salgılanan şematik diyagramı hava dağıtım sistemi ve koku önleyici işlem sürüm cihazları katıldı. Diyagramı Mann ve ark Şekil 1 bir uyarlamasıdır. 10. Bir test tabi 2-port bölünmüş T-salgılanan serbest odasına ayrı ayrı yerleştirilir. Bu salgılanan içine kontrol yukarı doğru hareketi sağlar ve bırakma noktası alanına geri taramasını böcek engelleyen bir kapı vana aracılığıyla kokuları doğru hareket eder. Tüp geçit değerden sonra 10 cm ikiye bölen. Böcek bölümü belirli bir yan içine 0,5 cm hareket kez bir koku için bir olumlu yanıt kaydedilir. Giyotin uçucu toplama haznesi bir katı faza ayrılmış yerine kullanılabilirlerbir koku kaynağı olarak e mikro-ekstraksiyon tutma / koku kaynağı odası (SPMEC).

Şekil 2,
Şekil 2.. (B), dikey T turunçgil konukçuları karşı temiz hava kontrol (A) veya narenciye uçucu karşı narenciye uçucu maddelerden kaynaklanan uçucu bir kovucu (dimetil disülfür) ile birlikte yayımlanan için Asya narenciye psyllid (Diaphorina citri) yetişkin Tepki -labirent salgılanan Şekil 2A:. Tukey HSD testi (α <0.05) izledi varyans tek yönlü analizi (ANOVA) psyllid ya kolu (2 tedaviler, n = 120) arasında bir seçim yapma sayısını karşılaştırmak için yapıldı. Farklı harflerle gösterilir Kolon başka (α <0.05), bir önemli ölçüde farklı Şekil 2B:. Tek yönlü analizi çalışanTukey HSD testi (α <0.05) izledi varyans (ANOVA) olan psyllid bırakma noktası ya kol veya kalan (3 tedaviler, n = 120) arasında bir seçim yapma sayısını karşılaştırmak için yapıldı. Farklı harflerle gösterilir Kolon Bir diğeri (α <0.05) önemli ölçüde farklı.

Discussion

Koku için yazıda, bir test cihazı ve protokol küçük eklembacaklılar (Psyllidae: Hemiptera Insecta) yanıtı ölçmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, bir böcek varsayılan cezbedici değerlendirmek testlerin durumunda iki odorant alanları arasında bir seçim yapmak için izin veren bir seçim testi içerir. Bundan başka, test konusu geçirmezliğini testlerin halinde, serbest kol serbest bırakma kolu ve iki potansiyel koku alanlar ya da bir girme, ya da geri kalan göre davranışları üç tip gösterebilir. Bu negatif geotactic (yukarı doğru hareket etme eğilimi) ve pozitif phototactic (ışığa doğru hareket etme eğilimi) birçok eklembacaklıların doğal davranışsal tepkisi yararlanır nedeniyle salgılanan yüksek verimlilik veri toplama için izin verir. Bugünkü gösterinin psyllid böcek testi örnek kullanmasına rağmen, tahlil kolayca, genel eklembacaklılar uçuş kullananlar veya ulaşım baskın modları olarak yürüyüş hem adapte edilebilir.

12 durulaştırmada önemli bir rol oynamıştır. Bu tür olfactometers ve özel tasarımlar geniş ölçüde değişiklik gösterir, ancak, iki tercih tahlil genel teması üzerine varyasyonlar benzer Y tüp testlerinin genellikle kimyasal artropod yanıtı ölçmek için kullanılmaktadır ve aynı zamanda, burada tarif. Böcekler 9 destekli uçuş neden olabilir Büyük uçuş tüneller de haşere kontrol araçları pratik kullanımı bilgilendirilmesi temel yarı-kimyasallara Böcek uçuş ve yönlendirme mekanizmaları yanı sıra, veri durulaştırmada çığır veri toplama sonuçlandı.

Bu terzi tasarım genellikle belirli bir eklembacaklı denek biyolojisi için salgılanan ve bunlarla ilgili cihaz gereklidir. Olanlar spec göre bir böcek genel grup içinde de kullanılabilir O olfactometers daha yararlıdırküçük bir grup IFIC, ancak bazen böcekler küçük bir grup ekonomik önemi çok özel salgılanan ve tahlil tekniğinin geliştirilmesi gerekliliğini belirler. Şu anda açıklanan tasarım, önceden aşina eklembacaklı teknikleri üzerine inşa edilmiştir. Bu deneysel arena ya da seçim testi Y-şekilli bir cam cihaz 7 biçimini aldığı Y tüp biyodeneyler daha fazla standart iki seçenek tahlil için olanak sağlar. Diğer 13 boş kalır iken Tipik olarak, bu gibi bir Y-tüpün bir kol, bir tedavi odorant alır. Bu tür olfactometers üzerinde varyasyonlar birden fazla ışıma kollar 14, ek ve hatta toprak ile 15 arasında hareket eden organizmaların davranışlarını test edilmesi için bir toprak ortam ilave içerebilir. Böyle olfactometers ve ilgili testlerin geliştirilmesi, bu doğal koşullar denekler 'biyoloji açısından değerlendirilen davranışsal tepkilerin doğru alaka çoğaltılır ve böylece ne kadar yakından dikkate almak önemlidir. A la içinrge derecesi, toplanan verilerin sadece organizmanın davranışsal ekolojik 16 ile ilgili davranış biyoassay uygunluğu olarak yararlı olacaktır.

Şu anda açıklanan salgılanan ve davranışsal biyoassay özellikle kısa "atlar" 16 olarak uçuş başlatmak eğilimindedir hemipteran böcek için tasarlanmıştır. Salgılanan bir dikey yönlendirme ve ışık kaynağı düzenleme böcek hareketi başlatma kolaylaştırmak ve böylece daha sonraki kimyasal aracılığında oryantasyon davranış verimli bir şekilde ve yüksek bir verimlilik ile test edilebilir. Bu davranış düzenleme tahlil muhtemel uçan veya artropod takson yürüme ya da kolayca olmayan artropod organizmaların ihtiyacı uyacak şekilde modifiye edilebilir, geniş bir dizi için de kullanılabilir.

Disclosures

Yazar Narenciye Araştırma ve Geliştirme Vakfı tarafından sağlanan fon aldı.

Acknowledgments

Narenciye Araştırma ve Geliştirme Vakfı finansman sağlamak için kabul edilmektedir. Biyoanalizlere yürütmek için Melek Hoyte ve Michael Flores sayesinde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Resh, R. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. Academic Press, Elsevier Science. USA. (2003).
  2. Biorational tree-fruit pest management. Aluja, M., Lesky, T. C., Vincent, C. CABI. USA. (2009).
  3. Rodriquez-Saona, C., Stelinski, L. L. Behavior-modifying strategies in IPM: Theory and Practice. Integrated Pest Management: Innovation - Development Process. Peshin, R., Dhawan, A. K. Springer. NY. 261-311 (2009).
  4. Cardé, R. T., Millar, J. G. Advances in insect chemical ecology. Cambridge University Press. UK. (2004).
  5. Knight, A. L., Stelinski, L. L., Hebert, V., Gut, L., Light, D., Brunner, J. Novel dispensers simultaneously releasing pear ester and sex pheromone for disruption of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 79-86 (2012).
  6. Mann, R. S., Tiwari, S., Smoot, J. M., Rouseff, R. L., Stelinski, L. L. Repellency and toxicity of plant-based essential oils and their constituents against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 87-96 (2012).
  7. Forbes, A. A., Powell, H. Q., Stelinski, L. L., Smith, J. J., Feder, J. L. Sequential sympatric speciation across trophic levels. Science. 323, (5915), 776-779 (2009).
  8. Kennedy, J. S. The visual responses of flying mosquitos. Proceedings of the Zoological Society of London A. 109, (4), 221-242 (1940).
  9. Miller, J. R., Roelofs, W. L. Sustained-flight tunnel for measuring insect responses to wind-borne sex pheromones. Journal of Chemical Ecology. 4, (2), 187-198 (1978).
  10. Mann, R. S., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Castle, W. S., Stelinski, L. L. Sulfur volatiles from Allium spp. affect Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), response to citrus volatiles. Bulletin of Entomological Research. 101, (1), 89-97 (2011).
  11. Onagbola, E. O., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Stelinski, L. L. Guava leaf volatiles and dimethyl disulfide inhibit response of Diaphorina citri Kuwayama to host plant volatiles. Journal of Applied Entomology. 135, (6), 404-414 (2011).
  12. Baker, T. C., Linn, C. E. Wind tunnels in pheromone research. Techniques in Pheromone Research. Hummel, H., Miller, T. A. Springer-Verlag. New York. 75-110 (1984).
  13. Stelinski, L. L., Rodriguez-Saona, C., Meyer, W. L. Recognition of foreign oviposition marking pheromone in a multitrophic context. Naturwissenschaften. 96, (5), 585-592 (2009).
  14. Gökçe, A., Stelinski, L. L., Whalon, M. E. Behavioral and electrophysiological responses of leafroller moths to selected plant extracts. Environmental Entomology. 34, (6), 1426-1432 (2005).
  15. Ali, J. G., Alborn, H. T., et al. herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats. PLoS ONE. 7, (6), e38146 (2012).
  16. Mann, R. S., Ali, J. G., et al. Induced release of a plant defense volatile 'deceptively' attracts insect vectors to plants infected with a bacterial pathogen. PLoS Pathogens. 8, (3), e1002610 (2012).
Koku için Arthropod Tepki için Dikey T-labirent Seçim Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter