Summary
Модель имплантации стента в артерии мыши сонных описано. По сравнению с другими подобными методами, эта процедура является очень быстрым, простым и доступным, предлагая возможность учиться в удобном виде сосудистой реакции стены различных стентов с лекарственным покрытием и молекулярные механизмы рестеноза.
Abstract
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в развитии стента в последние десятилетия, сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смерти в западных странах. Помимо преимуществ, предлагаемых развитие различных стентов с лекарственным покрытием, коронарной реваскуляризации несет и опасных для жизни риски в тромбоз стента и рестеноза. Исследование новых терапевтических стратегий нарушается из-за отсутствия соответствующих методов для изучения имплантации стента и рестеноза процессов. Здесь мы описываем быстрой и доступной процедурой имплантации стента в сонную артерию мышь, которая предоставляет возможность учиться в удобном виде молекулярных механизмов ремоделирования сосудов и влияния различных покрытий препарата.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания, вызванные прогрессирование атеросклероза являются ведущей причиной смерти в промышленно развитых странах. Атеросклероз представляет собой координационный, воспалительные фиброзно-пролиферативный ответ сосудистой стенки к повреждение эндотелия 1, в результате чего формирование расширенной бляшки в просвет сосуда, влияющие на кровоток в коронарных артерий. Более 75% инфарктов миокарда результат от разрыва тонкой крышкой волокнистых воспаленного 2 бляшки. Так как это осложнение может быть фатальным, чрескожная (коронарная) ангиопластика (ЧТКА) с имплантацией стента стал первым выбором терапии в современной медицинской практике. Метод позволяет расширение суженной коронарной артерии и, следовательно, восстановление кровотока. Одновременно это вызывает степень повреждения эндотелия и стенки сосуда 3. Однако длительное действие этой терапии ограничена чрезмерной артериальной ReModeЛин и рестеноза 4.
По занятость стентов, PTCA стал более эффективным в лечении сложных поражений, позволяя реваскуляризации после экстренного закрытия сосуда 5. Этот способ снижает частоту рестеноза в стенте до менее чем 10% 6. Помимо этих преимуществ, это первый выбор терапии для коронарной реваскуляризации несет и опасных для жизни риски в тромбоз стента и рестеноза.
В тромбоза вызвана де-эндотелизации сосуда, а затем массовый адгезию тромбоцитов и фибрина пострадавшим сайта. 26% пациентов страдают от В-тромбоза стента и 63% умирают от инфаркта миокарда 7. Рестеноз относится к процессу заживления раны после механического повреждения стенки сосуда, включая гиперплазию неоинтимы (миграцию и пролиферацию клеток гладких мышц сосудов (VSMC), отложение внеклеточного матрикса (ECM) и ремоделированиесосуда. Часто инвазивных повторное вмешательство становится необходимым dilatate сильно сузился атеросклеротических сосудов за счет В-тромбоза стента и рестеноза.
Для предотвращения в тромбоз стента, длительное лечение с анти лекарственные препараты необходимо 8. Для предотвращения рестеноза, новое поколение покрытых стентов элюирования антипролиферативные агенты, такие как иммунодепрессанты (например, сиролимус, эверолимуса, Zotarolimus) и противораковых лекарственных средств (например, паклитаксел) с полимерным покрытием в течение нескольких месяцев 9,10. Хотя эти препараты уменьшить образование неоинтимы и рестеноза, они сохраняют высокий риск в тромбоза путем ингибирования повторного эндотелизации.
После повреждения артерий, содержание эндотелиальных отсека является необходимым для предупреждения тромботических осложнений. В физиологических условиях эндотелия человека показывает небольшую текучесть кадров 11. Под Pathological условиях, однако, эндотелиальные целостность нарушена, так что быстрое восстановление окружающими зрелых эндотелиальных клеток и циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (EPC) требуется 12,13.
Изучение этих сложных молекулярных механизмов в более крупных животных в 14-16 или мыши артерии аорты является очень сложной процедурой, предлагая ограниченные данные 17-19. Для проверки работоспособности новых стент-покрытий для уменьшения в тромбоз стента и рестеноза новых моделей являются императивными.
Нитинол представляет собой идеальную платформу для стентов из-за его "высокая эластичность, эффект памяти формы и хорошую переносимость у пациентов, успешно используются в качестве голых металлических стентов в клинической практике. Этот сплав сделали возможным создание миниатюрных стента с внешним диаметром 500 мкм, которое может быть нанесено покрытие 20 и имплантировали в сонной артерии мышей. Развитие миниатюрных нитинола стента для мыши сarotid артерии, позволяет исследовать точные молекулярные механизмы индуцированного имплантации стента и дает возможность проверить быстрого и эффективного воздействия различных наркотиков покрытия для предотвращения рестеноза. Более того, существование различных нокаут мышей штаммами представляет огромное преимущество в выяснении роли различных молекул, участвующих в росте и неоинтима в тромбоз стента.
Protocol
1. Стент Подготовка и внедрение
- Стент-распорки (Fort Wayne Metals, Castlebar, Ирландия) были плетеные, а затем сократить до нужного размера в Институте текстильной технологии и машиностроения, Университет Аахена в Германии (рис. 1А).
- До имплантации стентов должны быть переданы в два силиконовую трубку см, с помощью пинцета и помещают 2 мм на одну концевую область, называемый передним концом (рис. 1А).
- Передняя часть должна быть сокращена наклонно, чтобы обеспечить острый наконечник для имплантации.
- До имплантации стента должно быть обильно поливают, чтобы обеспечить скольжение.
2. Имплантация стента
- 10-12 недель самцам мышей C57BL / 6 мышей дикого типа, 25-27 г анестезируют использованием внутрибрюшинной инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина. Правильное обезболивания подтверждена до операции в связи с отсутствием рефлексов иборода движения. Для предотвращения сухости под наркозом, мышь глаза покрыты пленкой крема bepanthene.
- После бритья и надлежащей дезинфекции вентральной области шеи, небольшой средний разрез 1 см выполняется под стереомикроскопом, с помощью ножниц. После разделения две жирные тела стерильной пинцетов, левую общую сонную артерию можно видеть пульсирующий вместе с трахеи.
- 1 см левой общей сонной артерии и бифуркации должна быть свободна подготовлены. 1 узел, используя 5/0 шелковой нити будут связаны вокруг левой общей сонной артерии, два узла с использованием 7/0 шелковые нити будут связаны вокруг левой наружной сонной артерии, и один узел использованием 7/0 шелковой нити будут связаны вокруг внутренней сонной артерии (рис. 1В).
- Кровоток затем прекращают путем связывания узлов на внутреннюю сонную артерию и проксимальный наружной сонной артерии прочно, а также путем вытягивания узла объемногоING общей сонной артерии. Судно должно быть установлено таким образом, чтобы общее и наружной сонной артерии находятся в прямой линии.
- Небольшой разрез в наружной сонной артерии выполняется, вблизи проксимального узел, используя Vannas ножницами. Кремний трубки, содержащей стент вводят в наружную сонную артерию, с острым концом вперед, используя направляющий проволоки. После того, как стент достигнет желаемого положения, силиконовую трубку отводится назад по направляющей проволоки и позволяет с памятью формы расширении стента (фиг.1В).
- Дистальный узел на наружной сонной артерии связать плотно закрыть месте разреза и узлы на внутренней и общей сонной артерии удаляются, тем самым восстановление кровотока.
- Разрез кожи закрывают 3-4 шва Мишель клипы и Мишель щипцов. Мышь помещали под красным светом до полного выздоровления. Обезболивающей терапии не является необходимым.
- доски могут быть проанализированы через 1-3 недель. Для изучения повторного эндотелизации, ранее последнего времени необходима точка (3-4 дня). Мы наблюдали в нашей модели имплантации стента, что через 4 недели после этого хирургического вмешательства, особенно при использовании конкретных покрытий biofunctionalize миниатюрных стенты, неоангиогенезом происходит приблизительно 30% образца. Это задние для реконструкции и регенеративных процессов, с различными механизмами и представляющих другого патологического проблемы. Сосредоточиться на неоинтимы, внутри стента стеноз и / или анализа механизмов, лежащих в основе этих побочных эффектов после имплантации стента последнего времени точка 3 недели было бы полезно, чтобы не перепутать с регенеративные эффекты, вызванные наступлением неоангиогенезом.
3. Анализ образования зубного налета
- В конце-временной точке, животных анестезируют использованием внутрибрюшинной инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина.Правильное обезболивания подтверждена до операции в связи с отсутствием рефлексов и бороду движения.
- Животные погибают от внутрисердечную обескровливания. Сыворотке крови собирают для последующего анализа.
- После открытия грудной полости и PBS стиральной через внутрисердечной пункции, тело перфузии 4% параформальдегида (PFA) раствор выполняется в течение 5 мин. Левую сонную артерию содержащей стент рассеченные, непосредственно помещали в 4%-ном растворе PFA и по крайней мере 16 часов позже embbeded в пластик.
- Толщиной 50 мкм разделам выполняются из пластика-встроенные образцы помощью алмазной ленточной пилой.
- Для измерения размера бляшки, Гимза окрашивания выполняется.
- Для анализа скорости повторного эндотелизации внутри стента площадь поперечного сечения сосуда, иммуногистохимии для выявления фактора фон Виллебранда (ФВ) выполняется.
Representative Results
- Имплантация стента миниатюрных нитинолом в левую сонную артерию мышей занимает 25-30 мин и показывает смертность на 10% в основном за счет повреждения судна во время вмешательства. Лучший коэффициент выживаемости наблюдали у мышей, имеющего массу более 25 г в момент имплантации стента (смертность на 5%). Поэтому мы выбрали для имплантации мышам с весом 25-27 г. После операции, мыши оправиться от наркоза в течение 2-5 мин, а не физические недостатки, как, например, паралича, не наблюдается. Micro-компьютерной томографии (микро-КТ) изображения выполняется через неделю после имплантации стента показали, что стенты не осложненный кровотока (рис. 1в). К сожалению, анализ неоинтимы в этих изображениях не представляется возможным в связи с металлом полученных артефактов (рис. 1D, 1E).
- Мы не наблюдали любого судна или повреждения эндотелиальных unstented площади судна, непосредственно под стента, Как обнаруживается гистологические (фиг. 2А) и конкретными окрашивание на эндотелий (Фиг.2В, анти-CD31 антитело мыши). Для лучшего обзора, раздел был сканировать с помощью двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии (рис. 2В, 2С).
- В стентированного сосуд, постоянное расширение 15% обнаружено (отношение стента: артерии, 1,15:1) на мышах весом 25-27 г. Неоинтимы и тромб формирования могут быть проанализированы классические гистологического окрашивания (например, гематоксилин-эозином, Гимзе, Movat, Toluidin синий, Массон-Trichrom-Голднером, 3А, 3В). Так как пластинка наружный и международных не видны больше, зубной налет размер рассчитывали как разность внешнего и просвета областей (среднее площади бляшки: 234566 ± 3315 мкм 2, средняя площадь просвета: 12036 ± 2662 мкм 2). Внешняя окружность также измеряли (в среднем 1799 ± 14 мкм). Для анализаклеточного состава, секции должны быть deplastified и окрашивали специфических маркеров. Для повторного эндотелизации мы использовали Cy-3 конъюгированных анти-CD31 антитело и пролиферации клеток гладких мышц FITC-конъюгированные анти-SMA антитела (фиг.3С). Повторное эндотелизации рассчитывали как процент CD-31 положительных окрашенных к общей поверхности просвета (среднее: 23,07 ± 3,14%) через одну неделю после имплантации стента.
Конечно, неограниченное количество специфического окрашивания можно, в зависимости от каждой лаборатории опыт. Анализ тяжелой цепи миозина, за лучшую характеристику гладкомышечных клеток, а также анализ проникли клетки (моноциты, лимфоциты) или окрашивания для различных воспалительных цитокинов также может быть выполнена, в зависимости от цели исследования.
C = "/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg" />
Рисунок 1. Схематический обзор хирургической процедуры (A). Кровоток прерван путем связывания узлов на внутреннюю сонную артерию и проксимальный наружной сонной артерии прочно, а также путем вытягивания узла окружающих общей сонной артерии. Кремний трубки, содержащей стент вводят в наружную сонную артерию через небольшой разрез на наружной сонной артерии. После того, как стент достигнет желаемого положения, силиконовую трубку отводится назад по направляющей проволоки и позволяет с памятью формы расширении стента. Микро-CT изображения, показывающие положения стента через одну неделю после хирургической имплантации (B). Благодаря материалу полученных артефактов, анализ роста неоинтимы не возможно (С, D).
3fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Unstented площади судна не влияет на время хирургической процедуры, как показано на Toluidin синий (А) и эндотелиальных конкретных CD31 окрашивание (B, C).
Рисунок 3. Анализ доски могут быть выполнены классической гистологического окрашивания (например Masson-Trichrom-Goldner) (А). Организованной тромб может быть обнаружен черный окрашенных отложений фибрина внутри неоинтимы в некоторых случаях полной окклюзии сосуда наблюдается (В). Повторное эндотелизации (Cy3, красный) или пролиферации клеток гладких мышц (FITC, зеленый) был обнаружен двойной иммунофлуоресценции окрашивание с использованием специфических маркеров.Контрастного проводили с 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, синий) (С). Мы заметили, завершил повторное эндотелиализацию стента (слева, двойной стрелки) по сравнению с незавершенного просвета повторного эндотелизации (справа, одна стрелка).
Discussion
Для снижения риска в тромбоз стента и рестеноза, а также обеспечить разработку новых покрытий для стентов с лекарственным покрытием, легким, простым и доступным методом имплантации стента в животной модели не требуется. Мышей доставить идеальной системы для изучения сложных механизмов артериальной ремоделирования после имплантации стента и эффективность таких препаратов. Существующие модели для рестеноза стента в мышь трудно, требует высоких хирургических навыков и подразумевают высокий риск осложнений, как кровотечение или паралич 17-19. Например, в модели стента имплантации в торакальной аорты мыши-донора после баллонной дилатации сосуда и затем трансплантации стентированного сегмента в сонной артерии у мыши получатель 17, изучение пато-механизмы не влияет только получатель реакция на донорский материал, но и массивным повреждением сосуды ваз и адвентиции. Имплантация нержавеющей SteeL стента непосредственно в брюшной аорты после баллонной дилатации 19 сопровождается высокой смертностью (35%) из-за паралич задних конечностей после тромбоза или кровотечения из брюшного отдела аорты на сайте артериотомии. Имплантация спиралевидные саморасширяющимся нитинолом-стента в брюшную аорту через бедренную артерию 18 нуждается в высокой хирургических навыков, в основном из-за слепо направляя стента вдоль отходящих от бедренной артерии в аорту поставить стент в нужное положение. Эта процедура выполняется высоким риском повреждения бедренный нерв, поэтому паралич задних ног. По сравнению с этими процедурами, наша модель имплантации стента в мышь не нужно высоких хирургических навыков.
Наша модель предлагает простой, легкий и эффективный метод для анализа влияния различных наркотиков покрытий на артериальную реконструкцию, размещение стента производится по виду, и нет риска повреждения нервов или других структур. COMсложные молекулярные механизмы могут быть исследованы проще в нашей модели мыши стентирование сонной артерии, не только прямой доступ судна, но и в связи с существованием различных нокаут мышей штаммами.
Как одно ограничение, по сравнению с клинической процедуры, наша модель использует здоровых мышей / артерии и не выполняет стентирования на уже существующих бляшек (не в рестенозом, но внутри стента стеноз). Мы также не выполняют баллонного расширения стента до имплантации. Тем не менее, в связи с массовым повреждение стенки сосуда в обеих моделях репарационных процессы аналогичны. К сожалению, из-за металла полученных артефактов в естественных условиях мониторинга неоинтимы рост не является возможным существующих методов визуализации, как УЗИ или компьютерной томографии. Другим ограничивающим фактором является тонким секционирования на основе металлов стенты, которые требуется некоторый опыт в обработке металла.
С помощью этого метода мыудалось показать, что нейтрофилы инструктаж biofunctionalized миниатюрных нитинолом-стенты, покрытые LL-37 снижения рестеноза внутри стента, обеспечивая новую концепцию содействия сосудистой заживления после инвазивного лечения 21.
Несмотря на эти ограничения, эта модель, кажется, до сих пор, наиболее подходящие системы, тем самым денег и экономия времени, исследовать новый препарат-покрытий для стентов и их влияния на молекулярные события, во время артериальной реконструкции. Кроме того, эта модель может быть легко адаптирована к хомяк, который больше похож на человека, так что каждый терапевтических гипотеза может быть проверена до обращения в более крупных животных или человека, чтобы избежать неприятных и неожиданных эффектов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жа Ангела Фройнд за отличную техническую помощь в секционирования пластиковых встроенных стентов. Мы благодарим также г-жа Roya Солтан и г-жа Ангела Фройнд для профессиональной помощи иммуногистохимического окрашивания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nitinol-stents (self-made from nitinol-struts) | Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 μm | custom-made product | Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering |
| silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500 μm, section thickness 100 μm, polytetrafluorethylene catheter |
| stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | |
| forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0.17 mm |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | ||
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | ||
| Bepanthene | Bayer, Germany | ||
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | |
| 5/0 Silk | Seraflex | IC 108000 | |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
| guide-wire | Abbott Vascular | 1001782-HC | 0.014-inch angioplastie guide-wire |
| Michel suture clips | Aesculap, Germany | BN507R | 7.5 x 1.75 mm |
| Michel Forcep | Aesculap, Germany | BN730R |
References
- Ross, R., et al. Response to injury and atherogenesis. Am. J. Pathol. 86, 675-684 (1977).
- Virmani, R., et al. Pathology of the vulnerable plaque. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 13-18 (2006).
- Farb, A., et al. Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans. Circulation. 99, 44-52 (1999).
- Weber, C., Noels, H. Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic options. Nat. Med. 17, 1410-1422 (2011).
- Lenzen, M. J., et al. Management and outcome of patients with established coronary artery disease: the Euro Heart Survey on coronary revascularization. Eur. Heart J. 26, 1169-1179 (2005).
- Babapulle, M. N., et al. A hierarchical Bayesian meta-analysis of randomised clinical trials of drug-eluting stents. Lancet. 364, 583-591 (2004).
- Wiviott, S. D., et al. Intensive oral antiplatelet therapy for reduction of ischaemic events including stent thrombosis in patients with acute coronary syndromes treated with percutaneous coronary intervention and stenting in the TRITON-TIMI 38 trial: a subanalysis of a randomised trial. Lancet. 371, 1353-1363 (2008).
- van Werkum, J. W., et al. Predictors of coronary stent thrombosis: the Dutch Stent Thrombosis Registry. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 1399-1409 (2009).
- Finn, A. V., et al. Vascular responses to drug eluting stents: importance of delayed healing. Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 27, 1500-1510 (2007).
- Joner, M., et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk. J. Am. Coll. Cardiol. 48, 193-202 (2006).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Hristov, M., Weber, C. Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J. Cell Mol. Med. 8, 498-508 (2004).
- Rabelink, T. J., et al. Endothelial progenitor cells: more than an inflammatory response? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 834-838 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110, 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Differential neointimal response to coronary artery injury in pigs and dogs. Implications for restenosis models. Arterioscler. Thromb. 14, 395-400 (1994).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J. Am. Coll. Cardiol. 19, 267-274 (1992).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc. Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209, 359-366 (2010).
- Costa, F., et al. Covalent immobilization of antimicrobial peptides (AMPs) onto biomaterial surfaces. Acta Biomaterialia. 7, 1431-1440 (2011).
- Soehnlein, O., et al. Neutrophil-derived cathelicidin protects from neointimal hyperplasia. Science Translational Medicine. 3, 103ra198 (2011).
