Summary
En model af stent implantation i mus carotidarterie beskrevet. Sammenlignet med andre lignende metoder, denne procedure er meget hurtig, enkel og tilgængelig, der giver mulighed for at studere på en praktisk måde karvæggen reaktion på forskellige narkotika-stents, og de molekylære mekanismer i restenose.
Abstract
På trods af den betydelige fremskridt i stent udvikling i de seneste årtier, er fortsat hjertekarsygdomme den hyppigste dødsårsag i de vestlige lande. Udover de fordele, som udviklingen af forskellige narkotika-stents, bærer koronar revaskularisering også livstruende risici for in-stent trombose og restenose. Forskning i nye terapeutiske strategier hæmmes af manglen på egnede metoder til at studere stent implantation og restenose processer. Her beskriver vi en hurtig og tilgængelig procedure for stent implantation i mus halspulsåren, hvilket giver mulighed for at studere i en bekvem måde de molekylære mekanismer i fartøjets remodellering og virkningerne af forskellige narkotika belægninger.
Introduction
Kardiovaskulære sygdomme forårsaget af progression af atherosklerose er den hyppigste dødsårsag i de industrialiserede nationer. Aterosklerose er en fokal, inflammatorisk fibro-proliferative respons af karvæggen til endotelbeskadigelse 1, hvilket resulterer i dannelsen af en udvidet plak i lumen af fartøjet, der påvirker blodgennemstrømningen gennem koronararterier. Over 75% af myokardieinfarkter skyldes brud på den tynde fibrøst hætten af betændte plak 2.. Da denne komplikation kan være dødelig, blev en perkutan transluminal (koronar) angioplastik (PTCA) med stentimplantering det første valg behandling i den nuværende medicinske praksis. Fremgangsmåden tillader dilatation af forsnævrede kranspulsåren og dermed genoprettelse af blodgennemstrømningen. Samtidig, det forårsager et omfang skade på endotelet og karvæggen 3.. Imidlertid er den langsigtede virkning af denne terapi begrænses af en overdreven arteriel Remodelange og restenose 4..
Ved ansættelse af stents, blev PTCA mere effektiv i behandlingen af komplicerede læsioner, så revaskularisering efter en akut karlukning 5.. Denne metode nedsætter forekomsten af i-stent restenose til mindre end 10% 6. Udover disse fordele, bærer denne første-choice behandling for koronar revaskularisering også livstruende risici for in-stent trombose og restenose.
I stenttrombose skyldes en de-endotelisering af fartøjet, efterfulgt af en massiv adhæsion af blodplader og fibrin til den sårede sted. 26% af patienterne lider i-stenttrombose og 63% dør af myokardieinfarkt 7.. Restenose refererer til processen med sårheling efter mekanisk skade på karvæggen, der involverer neointimahyperplasi (migration og proliferation af vaskulære glatte muskelceller (VSMC), aflejring af ekstracellulær matrix (ECM), og remodelleringaf fartøjet. Ofte en invasiv re-indgreb bliver nødvendigt at dilatate alvorligt indsnævret aterosklerotiske fartøjer følge in-stent trombose og restenose.
For at forhindre in-stent trombose, en langvarig behandling med anti-trombotiske lægemidler er nødvendig 8.. For at forhindre restenose, ny generation af narkotikarelaterede stents elueres anti-proliferative midler såsom immunosuppressive lægemidler (f.eks sirolimus everolimus, zotarolimus) og anti-cancer medicin (f.eks paclitaxel) fra en polymer belægning i flere måneder 9,10. Selv om disse stoffer mindske dannelsen af neointima og restenose, de opretholder en høj risiko for i-stenttrombose ved at hæmme reendotelialisering.
Efter arteriel skade, er opretholdelsen af endotel rum vigtigt at forhindre trombotiske komplikationer. Under fysiologiske betingelser, viser den menneskelige endotel en lille omsætningshastighed 11. Under Pathological forhold, men er den endotel integritet forringet, således at en hurtig genopretning ved at omgive modne endotelceller og cirkulerende endoteliale stamceller (EPC'er) er påkrævet 12,13.
Undersøgelsen af disse komplekse molekylære mekanismer i større dyr 14-16 eller i muse aortaarterien er en meget vanskelig procedure, der tilbyder begrænsede data 17-19. For at teste effektiviteten af nye stent-overfladebehandling for at reducere in-stent trombose og restenose nye modeller er bydende nødvendigt.
Nitinol er den ideelle platform for stenter på grund af sin 'høj elasticitet, form-memory-effekt og god tolerance hos patienter, med succes brugt som bare-metal stents i klinisk brug. Denne legering har gjort det muligt at skabe en miniaturiseret stent med en ydre diameter på 500 um, som kan overtrækkes 20 og implanteret i halspulsåren hos mus. Udviklingen af en miniaturiseret nitinol stent for muse carotid arterie tillader undersøgelse af præcise molekylære mekanismer fremkaldt af stent implantation og giver mulighed for at teste hurtigt og effektivt virkningerne af forskellige narkotika belægninger for at forhindre restenose. Desuden kan eksistensen af forskellige knock-out mus stammer repræsenterer en kæmpe fordel i at afklare den rolle forskellige molekyler, der er involveret i neointima vækst og in-stent trombose.
Protocol
1.. Stent Forberedelse og Implantation
- Stenten-stivere (Fort Wayne Metals, Castlebar, Irland) blev flettet og derefter skæres til i den ønskede størrelse ved Institut for Textile Technology og Mechanical Engineering, RWTH Aachen University i Tyskland (figur 1A).
- Før implantation, skal stenterne overføres til en 2 cm silicium rør, ved hjælp af pincet, og placeret 2 mm ved en terminal ende, nævnte forreste ende (figur 1A).
- Den forreste ende skal skæres skråt, for at sikre en skarp spids til implantation.
- Før implantation, bør stenten være rigeligt vandes, for at sikre slip.
2.. Stentimplantering
- 10-12 uger gamle C57BL / 6 vildtypemus, 25-27 g bedøves med intraperitoneal injektion af 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin. Korrekt bedøvelse bekræftes før kirurgi på grund af manglende reflekser ogskæg bevægelse. At forhindre tørhed under anæstesi, er muse øjne dækket af en film af bepanthene creme.
- Efter barbering og korrekt desinfektion af ventrale halsområdet er en lille median snit på 1 cm udført under et stereomikroskop, ved hjælp af en saks. Efter adskillelse af de to fede organer med sterile buet pincet, kan den venstre fælles halspulsåre ses pulserende sammen med luftrøret.
- 1 cm fra den venstre, fælles carotidarterie og bifurkation bør være fri forberedt. 1 knob anvendelse af en 5/0 silketråd vil blive bundet omkring den venstre fælles halspulsåre, vil 2 knob anvendelse af 7/0 silketråde være bundet omkring venstre ydre carotidarterie, og 1 knude ved hjælp af en 7/0 silketråd vil blive bundet omkring den indre carotidarterie (figur 1B).
- Blodgennemstrømningen afbrydes derefter ved at binde knuder på den indre halspulsåre og den proksimale ydre carotidarterie fast, samt ved at trække knuden surroundING den fælles halspulsåre. Fartøjet bør fastsættes på en sådan måde, at den fælles og ydre carotidarterie er i en lige linje.
- Et lille snit ved den ydre carotidarterie udføres nær den proximale knude ved hjælp af en Vännäs saks. Den silicium rør indeholdende stenten indføres i den ydre carotidarterie, med den spidse ende foran, med en guide-wire. Efter stenten når den ønskede position, er silicium røret trækkes tilbage over guide-wire og tillader SME-ekspansion af stenten (figur 1B).
- Den distale knude på den ydre carotidarterie binder stramt til at lukke fabrikken af indsnit og knuderne på den indre og fælles carotidarterie er fjernet, og dermed genoprette blodgennemstrømningen.
- Huden incision lukkes med 3-4 Michel sutur klip og en Michel pincetspidser. Musen er placeret under det røde lys, indtil fuld tilbagebetaling. Et analgetisk behandling er ikke nødvendig.
- Denplak kan analyseres efter 1-3 uger. At studere reendotelialisering, en tidligere end-tidspunkt er nødvendig (3-4 dage). Vi observerede i vores model for stentimplantering at 4 uger efter denne kirurgiske indgreb, navnlig ved anvendelsen af specifikke overtræk til biofunctionalize miniaturiserede stenter neoangiogenese forekommer hos ca 30% af prøven. Dette er en hind for ombygninger og regenererende processer med forskellige mekanismer og repræsenterer en anden patologisk problem. At koncentrere sig om neointima dannelse, in-stent stenose og / eller analyse af mekanismerne bag disse bivirkninger efter stent implantation en ende-tidspunkt på 3 uger vil være en fordel ikke at blande op med den regenererende effekt induceret af indtræden af neoangiogenesis.
3.. Analyse af plakdannelse
- Ved afslutningen-tidspunkt, er bedøves dyrene ved hjælp af intraperitoneal injektion af 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin.Korrekt bedøvelse er bekræftet før operation på grund af manglende reflekser og skæg bevægelse.
- Dyrene dræbes af intracardial afblødning. Serum opsamles til yderligere analyse.
- Efter åbning af brysthulen og PBS vask via intracardial punktur, et organ-perfusion med 4% paraformaldehyd (PFA) løsning er udført i 5 min. Den venstre halspulsåre indeholdende stenten dissekeret direkte anbragt i en 4% PFA opløsning og mindst 16 timer senere embbeded i plast.
- 50 um tykke sektioner udføres fra plastik-embedded prøver ved anvendelse af en diamant båndsav.
- At måle plak størrelse er Giemsa farvning udføres.
- At analysere hastigheden af reendotelialisering inden stentet del af fartøjet, er immunhistokemi for von Willebrand faktor (vWF) udføres.
Representative Results
- Implantation af en miniature nitinol stent ind i den venstre halspulsåre af mus tager 25-30 min og viser en dødelighed på 10% primært som følge af skader på skibet under interventionen. En bedre overlevelse er observeret i mus med en vægt på over 25 g på tidspunktet for stent implantation (dødelighed på 5%). Derfor valgte vi for implantation mus med en vægt mellem 25-27 gram. Efter operationen, inddrive de mus fra anæstesi inden 2-5 min, og ingen fysiske funktionsnedsættelser, som f.eks lammelse overholdes. Mikro-computertomografi (mikro-CT) udført en uge efter stent implantation viste, at stenterne ikke er forvredet af blodgennemstrømning (figur 1C). Desværre analyse af neointima dannelse i disse billeder er ikke muligt på grund af de metal-afledte artefakter (figur 1D, 1E).
- Vi har ikke observere nogen fartøj eller endotel skader af stentforsynede del af fartøjet, umiddelbart under stent, Som påviseligt ved histologiske (figur 2A) og ved specifik farvning for endotel (figur 2B, anti-muse CD31-antistof). For et bedre overblik, blev afsnittet scannet ved hjælp af en to-foton laser scanning mikroskopi (figur 2B, 2C).
- I stentet kar, er en permanent dilatation af 15% fundet (forholdet stent: arterie, 1,15:1) ved mus med en vægt på mellem 25-27 gram. Neointima dannelse og thrombe-dannelse kan analyseres ved klassiske histologiske farvninger (f.eks Hematoxilin-eosin, Giemsa, Movat, toluidin blå, Masson-Trichrom-Goldner, 3A, 3B). Da lamina externa og interna ikke er synlige længere, blev plak størrelse beregnet som forskellen mellem den eksterne og den luminale områder (betyder plaque areal: 234566 ± 3315 um 2, forstås luminale areal: 12036 ± 2662 um 2). Ekstern omkreds blev også målt (middelværdi: 1799 ± 14 um). Til analyse afcellulær sammensætning, afsnittene skal deplastified og farves med specifikke markører. For reendotelialisering, brugte vi en Cy3-konjugeret anti-CD31-antistof, og for glatmuskelcelleproliferation et FITC-konjugeret anti-SMA-antistof (figur 3C). Reendotelialisering blev beregnet som en procentdel af CD-31 positive farves til den samlede luminale overflade (gennemsnit: 23,07 ± 3,14%) en uge efter stentimplantering.
Selvfølgelig er et ubegrænset antal af specifik farvning muligt, afhængigt af den enkelte laboratorier erfaringer. Analyse af myosin tung kæde, for en bedre karakterisering af SMC'er, men også analyse af infiltrerede celler (monocytter, lymfocytter) eller farvninger for forskellige inflammatoriske cytokiner kan også udføres, afhængigt af formålet med undersøgelsen.
c = "/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg" />
Fig. 1. Skematisk oversigt over den kirurgiske procedure (A). Blodgennemstrømningen afbrydes ved at binde knuder på den indre halspulsåre og den proksimale ydre carotidarterie fast, samt ved at trække knude omkring den fælles halspulsåre. Den silicium rør indeholdende stenten indføres i den ydre carotidarterie gennem et lille snit på den ydre halspulsåre. Efter stenten når den ønskede position, er silicium røret trækkes tilbage over guide-wire og tillader SME-ekspansion af stenten. Mikro-CT-billeder viser stenten position en uge efter kirurgisk implantation (B). På grund af de materielle-afledte artefakter, en analyse af neointima vækst ikke er mulig (C, D).
3fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg "/>
Figur 2. Stentforsynede del af fartøjet påvirkes ikke af den kirurgiske procedure, som vist ved toluidin blå (A) og endotel-specifik CD31 farvning (B, C).
Figur 3.. Analyse af plak kan udføres ved klassiske histologiske farvninger (f.eks Masson-Trichrom-Goldner) (A). De organiserede trombe kan detekteres ved sort-farvede fibrin aflejringer inde neointimaen, i nogle tilfælde en fuldstændig tillukning af fartøjet er observeret (B). Reendotelialisering (Cy3, rød) eller proliferation af glatte muskelceller (FITC, grøn) blev påvist ved dobbelt immunfluorescensfarvning hjælp af særlige markører.Kontrastfarvning blev udført med 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blå) (C). Vi har bemærket en udfyldt reendotelialisering af stenten stivere (venstre, dobbelt pil) sammenlignet med en ikke gennemførte luminale reendotelialisering (højre, enkelt pil).
Discussion
For at reducere risikoen for i-stent trombose og restenose og understøtte udviklingen af nye belægninger til narkotika-stents, en let, enkel og tilgængelig metode stent implantation i en dyremodel er nødvendig. Mus leverer det ideelle system til at studere de komplekse mekanismer i arteriel remodeling efter stent implantation og effektiviteten af sådanne lægemidler. Eksisterende modeller for in-stent restenose i mus er svært, kræver høje kirurgiske færdigheder og indebærer store risici for komplikationer som blødning eller lammelse 17-19. For eksempel, i modellen af stenten-implantation i thorakalaorta af en donor mus efter ballon-dilatation af fartøjet, og derefter transplantation af den stentbehandlede segment i halspulsåren for en modtager mus 17 studiet af pato-mekanismer er ikke påvirkes kun af modtageren reaktion til donor materiale, men også af den massive beskadigelse af vasa vasorum og adventitia. Implantation af en rustfrit sl stent direkte ind i abdominale aorta efter ballon-dilatation 19 efterfølges af en høj dødelighed (35%) på grund af bagben lammelse efter trombose eller blødning fra abdominale aorta på stedet af arteriotomi. Implantation af en spiralformet selvekspanderende nitinol-stent ind abdominal aorta via femoral arterie 18 behov høje kirurgiske færdigheder, hovedsagelig på grund blindt lede stenten langs afgrening fra lårarterien til aorta for at placere stenten i den rigtige position. Denne procedure følges af en høj risiko for at beskadige den femorale nerve, derfor lammelse af bagbenet. Sammenlignet med disse procedurer, er vores model for stent implantation i mus ikke har brug for høj kirurgiske færdigheder.
Vores model tilbyder en enkel, nem og effektiv metode til at analysere virkningerne af forskellige narkotika belægninger på arteriel ombygninger, er markedsføringen af stenten i henhold syn, og der er ingen risiko for skadelige nerver eller andre strukturer. Den comkomplekse molekylære mekanismer kan undersøges lettere i vores model af muse halspulsåren stent, ikke blot ved direkte adgang til fartøjet, men også på grund af eksistensen af forskellige knock-out mus stammer.
Som en begrænsning, sammenligner med den kliniske procedure vores model bruger sunde mus / arterier og ikke udfører stent på eksisterende plaques (ikke in-stent restenose, men in-stent stenose). Vi har heller ikke udføre ballon-dilatation før stent-implantation. Men på grund af den massive beskadigelse af karvæggen i begge modeller, de reparatory processer er ens. Desværre, på grund af metal-afledte artefakter, en in vivo overvågning af neointimal vækst er ikke muligt ved eksisterende billeddannende metoder som ultralyd eller computer-tomografi. En anden begrænsende faktor er den tynde sektionering af metal-baserede stenter, som kræver en vis ekspertise i metal forarbejdning.
Med denne metode, var vii stand til at vise, at neutrofil-instruere biofunctionalized miniature nitinol-stents belagt med LL-37 reducerer in-stent restenose, giver et nyt koncept til at fremme vaskulær heling efter interventionel terapi 21..
På trods af disse begrænsninger, synes denne model at være, indtil nu mest egnede systemet, og dermed penge-og tidsbesparende, at undersøge nye lægemiddelkandidater-belægninger til stents og deres effekt på de molekylære begivenheder i løbet arteriel remodeling. Desuden kan denne model let tilpasses hamster, som er mere ligner det menneskelige, så hver terapeutiske hypotese kan verificeres før påføring til større dyr eller menneske for at undgå ubehagelige og uventede virkninger.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker fru Angela Freund for den fremragende teknisk bistand sektionering plast indlejrede stents. Vi takker også fru Roya Soltan and Mrs Angela Freund for professionel hjælp med immunhistokemi farvning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nitinol-stents (self-made from nitinol-struts) | Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 μm | custom-made product | Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering |
| silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500 μm, section thickness 100 μm, polytetrafluorethylene catheter |
| stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | |
| forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0.17 mm |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | ||
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | ||
| Bepanthene | Bayer, Germany | ||
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | |
| 5/0 Silk | Seraflex | IC 108000 | |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
| guide-wire | Abbott Vascular | 1001782-HC | 0.014-inch angioplastie guide-wire |
| Michel suture clips | Aesculap, Germany | BN507R | 7.5 x 1.75 mm |
| Michel Forcep | Aesculap, Germany | BN730R |
References
- Ross, R., et al. Response to injury and atherogenesis. Am. J. Pathol. 86, 675-684 (1977).
- Virmani, R., et al.
- Farb, A., et al. Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans. Circulation. 99, 44-52 (1999).
- Weber, C., Noels, H. Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic options. Nat. Med. 17, 1410-1422 (2011).
- Lenzen, M. J., et al. Management and outcome of patients with established coronary artery disease: the Euro Heart Survey on coronary revascularization. Eur. Heart J. 26, 1169-1179 (2005).
- Babapulle, M. N., et al. A hierarchical Bayesian meta-analysis of randomised clinical trials of drug-eluting stents. Lancet. 364, 583-591 (2004).
- Wiviott, S. D., et al. Intensive oral antiplatelet therapy for reduction of ischaemic events including stent thrombosis in patients with acute coronary syndromes treated with percutaneous coronary intervention and stenting in the TRITON-TIMI 38 trial: a subanalysis of a randomised trial. Lancet. 371, 1353-1363 (2008).
- van Werkum, J. W., et al. Predictors of coronary stent thrombosis: the Dutch Stent Thrombosis Registry. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 1399-1409 (2009).
- Finn, A. V., et al. Vascular responses to drug eluting stents: importance of delayed healing. Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 27, 1500-1510 (2007).
- Joner, M., et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk. J. Am. Coll. Cardiol. 48, 193-202 (2006).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Hristov, M., Weber, C. Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J. Cell Mol. Med. 8, 498-508 (2004).
- Rabelink, T. J., et al. Endothelial progenitor cells: more than an inflammatory response? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 834-838 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110, 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Differential neointimal response to coronary artery injury in pigs and dogs. Implications for restenosis models. Arterioscler. Thromb. 14, 395-400 (1994).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J. Am. Coll. Cardiol. 19, 267-274 (1992).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc. Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209, 359-366 (2010).
- Costa, F., et al. Covalent immobilization of antimicrobial peptides (AMPs) onto biomaterial surfaces. Acta Biomaterialia. 7, 1431-1440 (2011).
- Soehnlein, O., et al. Neutrophil-derived cathelicidin protects from neointimal hyperplasia. Science Translational Medicine. 3, 103ra198 (2011).
