En murine modell av stent i halspulsåren for studier av Restenosis

Summary

En modell av stentimplantering i mus halspulsåren blir beskrevet. Sammenlignet med andre lignende metoder, er denne prosedyren svært rask, enkel og tilgjengelig, og tilbyr muligheten til å studere i en praktisk måte vaskulære veggen reaksjon på ulike narkotika stenter og de molekylære mekanismer av restenose.

Abstract

Til tross for den betydelige fremgangen som er gjort i stenten utvikling de siste tiårene, hjerte-og karsykdommer er fortsatt den viktigste dødsårsaken i vestlige land. Foruten fordelene som tilbys av utviklingen av ulike narkotika stenter, bærer koronar revaskularisering også livstruende risiko for in-stent trombose og restenose. Forskning på nye terapeutiske strategier er svekket av mangel på egnede metoder for å studere stentimplantering og restenose prosesser. Her beskriver vi en rask og tilgjengelig prosedyre av stent i mus carotisar, som gir mulighet til å studere på en enkel måte de molekylære mekanismene for fartøy ombygging og effekten av ulike narkotika belegg.

Introduction

Hjerte-og karsykdommer forårsaket av progresjon av aterosklerose er den ledende dødsårsaken i de industrialiserte landene. Aterosklerose er en fokal-fibro inflammatorisk-proliferativ respons av den vaskulære vegg for å endotelskade ^1, noe som resulterer i dannelsen av en utvidet plakk inn i lumen av fartøyet, som påvirker blodstrømmen gjennom koronararteriene. Over 75% av hjerteinfarkt infarkt resultat fra bruddet i tynn fibrøs cap av den betente plakk ^to. Siden denne komplikasjonen kan være dødelig, ble en perkutan transluminal (koronar) angioplastikk (PTCA) med stentimplantering første-valg terapi i gjeldende medisinsk praksis. Fremgangsmåten tillater utvidelse av snevret koronararterie og således gjenopprettelse av blodstrøm. Samtidig fører det til en viss grad skade på endotel og beholderveggen ^3.. Imidlertid er langvarig effekt av denne behandlingen er begrenset av en overdreven arteriell remodeling og restenose ^fire.

Ved anvendelse av stenter, ble PTCA mer effektive ved behandling av kompliserte lesjoner, slik revaskularisering etter et akutt fartøy lukking ^5.. Denne metode reduserer forekomsten av in-stent restenosis til mindre enn 10% ^6. Foruten disse fordelene, bærer denne første-valget terapi for koronar revaskularisering også livstruende risiko for in-stent trombose og restenose.

I stenttromboser er forårsaket av en de-endothelialization av fartøyet, fulgt av en massiv adhesjon av blodplater og fibrin til det skadde området. 26% av pasientene lider av in-stent trombose og 63% dør av hjerteinfarkt ^7. Restenosis refererer til prosessen med sårheling etter mekanisk skade på karveggen, som involverer neointimal hyperplasi (migrering og proliferasjon av vaskulære glatte muskelceller (VSMC), avsetning av ekstracellulær matriks (ECM) og remodelleringav fartøyet. Ofte blir en invasiv re-intervensjon er nødvendig for å dilatate alvorlig smalere aterosklerotiske fartøy som følge av in-stent trombose og restenose.

For å unngå in-stent trombose, er en langsiktig behandling med anti-trombotiske narkotika nødvendig ^åtte. For å hindre restenose, ny generasjon av narkotika stenter Eluer anti-proliferativ agenter som immundempende medisiner (f.eks sirolimus, everolimus, Zotarolimus) og anti-kreft stoffer (for eksempel paclitaxel) fra en polymer belegg i flere måneder ^9,10. Selv om disse stoffene redusere neointima dannelse og restenose, opprettholder de en høy risiko for å in-stent trombose ved å inhibere re-endothelialization.

Etter arteriell skade, er opprettholdelsen av det endoteliale kupé viktig for å forebygge trombotiske komplikasjoner. Under fysiologiske forhold, viser den menneskelige endotelet en liten omløpshastighet ^11. Under Pathological betingelser, er imidlertid den endotelial integritet svekket, slik at en rask bedring ved å omgi modne endoteliale celler og sirkulerende endotel progenitor celler (PP) er nødvendig ^12,13.

Studiet av disse komplekse molekylære mekanismer i større dyr ^14-16 eller i mus aortaveggen er en svært vanskelig prosedyre, som tilbyr begrensede data ^17-19. For å teste effektiviteten av nye stent-belegg for å redusere i-stent trombose og restenose nye modellene er avgjørende.

Nitinol representerer en ideell plattform for stenter på grunn av sin "høy elastisitet, form-minne effekt og god toleranse hos pasienter, med hell brukes som bare-metal stenter i klinisk bruk. Denne legering har gjort det mulig å skape en miniatyrisert stent med en ytre diameter på 500 um, som kan være belagt ²⁰ og implantert i halspulsåren hos mus. Utviklingen av en miniatyrisert nitinol stent for mus carotid arterie, kan studiet av presise molekylære mekanismer indusert av stent implantasjon og tilbyr muligheten til å teste raskt og effektivt effekten av ulike stoff-belegg for å hindre restenose. Dessuten representerer eksistensen av ulike knock-out mus stammer en stor fordel i å avklare hvilken rolle ulike molekyler involvert i neointima vekst og in-stent trombose.

Protocol

En. Stent Forberede og Implantasjon

1. Stent-struts (Fort Wayne Metaller, Castlebar, Irland) var flettet og deretter klippe til ønsket størrelse ved Institutt for Textile Technology and Mechanical Engineering, RWTH Aachen universitetet i Tyskland (figur 1A).
2. Før implantering, må de stenter overføres til en 2 cm silisium-rør, ved å anvende pinsett, og plassert 2 mm ved en terminal ende, referert fremre ende (figur 1 A).
3. Frontdelen skal være skråskåret, for å sikre en skarp spiss for implantasjon.
4. Før implantering bør være rikelig vannes stenten, for å sikre glidning.

2. Stentimplantering

1. 10-12 uker gamle hann C57BL / 6 villtype mus, 25-27 g bedøves ved hjelp av intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin. Riktig anesthetization bekreftes før operasjonen av mangelen på reflekserskjegg bevegelse. For å hindre tørrhet mens under anestesi, blir mus øyne dekket av en film av bepanthene krem.
2. Etter barbering og korrekt desinfisering av ventrale nakken, er en liten median snitt på 1 cm utført under et stereomikroskop, bruke saks. Etter separasjon av to fettsyrer legemer med kurvede sterile pinsetter, kan den venstre felles halsarterie sees pulsere sammen med luftrøret.
3. 1 cm på venstre felles carotisar og bifurkasjonen bør være gratis forberedt. 1 knop ved hjelp av en 5/0 silketråd vil være bundet rundt venstre felles carotisar, vil to knop med 7/0 silke tråder være bundet rundt venstre eksterne carotisar, og en knute med en 7/0 silketråd vil være bundet rundt den interne carotisar (figur 1B).
4. Blodstrømmen blir deretter avbrutt ved binding av knuter på arteria carotis interna og den proksimale eksterne karotidarterie fast, så vel som ved å trekke i knute surrounding felles carotisar. Fartøyet skal være løst på en måte som den vanlige og eksterne karotidarterie i en rett linje.
5. Et lite snitt på den ytre halsarterie utføres, nær den nærmeste knute, ved hjelp av en Vannas sakse. Den silisium-rør som inneholder stenten, innføres i den eksterne karotidarterie, med spissen foran, ved hjelp av en retnings-tråd. Etter at stenten har nådd ønsket posisjon, blir silisium-røret trekkes tilbake over føringen-ledning og gjør det mulig for formhukommelse utvidelse av stenten (figur 1B).
6. Den distale knute på den eksterne karotidarterie blir binde fast i lukke incisjonsstedet og knutene ved de interne og felles karotidarterie ble fjernet, og dermed gjenopprette blodstrømmen.
7. Huden snittet lukkes med 3-4 Michel sutur klipp og Michel forcep. Musen er plassert under det røde lyset før full gjenoppretting. En analgetisk behandling er ikke nødvendig.
8. Denplakk kan analyseres etter 1-3 uker. For å studere re-endothelialization, er en tidligere end-tidspunkt nødvendig (3-4 dager). Vi har observert i vår modell av stentimplantering at 4 uker etter den kirurgiske inngrep, spesielt ved bruk av spesifikke belegg for å biofunctionalize miniatyrisert stenter, oppstår neoangiogenese hos omtrent 30% av prøven. Dette er en hind for ombygging og regenererende prosesser, med ulike mekanismer og representerer en annen patologisk problem. Å konsentrere seg om neointima formasjon, in-stent stenose og / eller analyse av mekanismene bak disse bivirkninger etter stentimplantering en slutt-tidspunkt for tre uker ville være gunstig ikke å blande seg med de regenerative effekten indusert av utbruddet av neoangiogenese.

3. Analyse av plakk dannelse

1. Ved slutten-tidspunkt, dyrene ble bedøvet ved hjelp av intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin.Riktig anesthetization bekreftes før operasjonen av mangel på reflekser og skjegg bevegelse.
2. Dyrene blir drept av intracardial exsanguination. Serumet blod ble oppsamlet for videre analyse.
3. Etter å ha åpnet brysthula og PBS vask via intracardial punction, en body-perfusjon med 4% paraformaldehyde (PFA) løsning er utført i 5 min. Den venstre halsarterie inneholdende stenten dissekeres, direkte plassert i en 4% PFA-løsning og minst 16 timer senere embbeded i plast.
4. 50 mikrometer tykke seksjoner utføres fra plast-embedded prøver ved hjelp av en diamant båndsag.
5. For å måle plakk størrelse, er Giemsa fargingen utføres.
6. For å analysere graden av re-endothelialization innenfor stentet område av fartøyet, er immunhistokjemi for von Willebrand-faktor (vWF) utført.

Representative Results

1. Implantering av en stent miniatyrisert nitinol inn i venstre halspulsåre hos mus tar 25-30 minutter, og viser en dødelighet på 10% for det meste på grunn av skaden av fartøyet under intervensjonen. En bedre overlevelse er observert i mus med en vekt på over 25 g ved tidspunktet for stentimplantering (dødelighet på 5%). Derfor valgte vi for implantasjon mus med en vekt mellom 25-27 g. Etter operasjonen, musene gjenopprette fra anestesi innen 2-5 min og ingen fysiske funksjonsnedsettelser, som for eksempel lammelser, er observert. Micro-Computer tomografi (Micro-CT) avbildning utføres en uke etter stentimplantering viste at stenter ikke forstuet av blodstrøm (figur 1C). Dessverre er analyse av neointima formasjonen i disse bildene ikke mulig på grunn av metall-deriverte artefakter (figur 1D, 1E).
2. Vi observerte ikke noe fartøy eller endotelceller skader av unstented område av fartøyet, rett under stent, Som påvises ved histologisk (Figur 2A) og ved spesifikk farging for endotelet (figur 2B, anti-mus CD31 antistoff). For bedre oversikt, ble den delen skannet ved hjelp av en to-foton laser scanning mikroskopi (figur 2B, 2C).
3. I stentet skip blir en varig utvidelse på 15% detektert (forhold stent: arterie, 1,15:1) ved mus med en vekt på mellom 25-27 g. Neointima dannelse og trombe-formasjon kan bli analysert av klassiske histologiske stainings (f.eks hematoksylin-eosin, Giemsa, Movat, Toluidin Blå, Masson-Trichrom-Goldner, figur 3A, 3B). Siden lamina externa og interna er ikke synlig lenger, ble plakett størrelse beregnes som differansen av det ytre og luminal områder (betyr plakk område: 234 566 ± 3315 mikrometer ^2, mener luminal område: 12036 ± 2662 mikrometer ^2). Ekstern omkrets ble også målt (betyr: 1799 ± 14 mikrometer). For analyse avcellulære sammensetning, seksjonene må deplastified og farget med spesifikke markører. For re-endothelialization, benyttet vi en Cy3-konjugert anti-CD31-antistoff og for glattmuskelcelleproliferasjon et FITC-konjugert anti-SMA-antistoff (figur 3C). Re-endothelialization ble beregnet i prosent av CD-31 positive farget til den totale luminal overflaten (gjennomsnitt: 23.07 ± 3.14%) en uke etter stent implantasjon.

Selvfølgelig er et ubegrenset antall spesifikk farging er mulig, avhengig av hvert laboratorier 'erfaring. Analyse av myosin tung kjede, for en bedre karakterisering av SMCS, men også analyse av infiltrert celler (monocytter, lymfocytter), eller stainings for forskjellige inflammatoriske cytokiner kan også bli utført, avhengig av Målet med studien.

c = "/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg" />
Figur 1.. Skjematisk oversikt over den kirurgiske prosedyre (A). Den blodstrømmen er avbrutt av binding av knuter på arteria carotis interna og den proksimale eksterne karotidarterie fast, så vel som ved å trekke knuten rundt den felles halspulsåre. Den silisium-rør som inneholder stenten, innføres i den eksterne karotidarterien gjennom et lite snitt i den eksterne karotidarterie. Etter at stenten har nådd ønsket posisjon, blir silisium-røret trekkes tilbake over føringen-ledning og gjør det mulig for formhukommelse utvidelse av stenten. Mikro-CT-bilder som viser stenten posisjon en uke etter kirurgisk implantasjon (b). På grunn av de materielle-deriverte gjenstander, er en analyse av neointima vekst ikke er mulig (C, D).

3fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg "/>
Figur 2. Unstented område av fartøyet er ikke påvirket av den kirurgiske prosedyre, som vist ved Toluidin blå (B) og endotel-spesifikk CD31 farging (B, C).

Figur 3. Analyse av plakk kan utføres ved klassiske histologiske stainings (f.eks Masson-Trichrom-Goldner) (a). Den organiserte trombe kan påvises ved sort-fargede fibrin-avsetninger inne i neointima, i noen tilfeller et fullstendig okklusjon av karet er observert (B). Re-endothelialization (Cy3, rød) eller glattmuskelcelleproliferasjon (FITC, grønt) ble oppdaget av dobbel immunfluorescens farging bruke spesifikke markører.Kontrafarging ble gjennomført med 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå) (C). Vi la merke til en gjennomført forsknings-endothelialization av stent struts (venstre, dobbel pil) sammenlignet med en Avbrutt luminal re-endothelialization (høyre, én pil).

Discussion

For å redusere risikoen for in-stent trombose og restenose og for å opprettholde utviklingen av nye belegg for narkotika stenter, en lett, enkel og tilgjengelig metode for stentimplantering i en dyremodell er nødvendig. Mus levere den ideelt system for å studere de komplekse mekanismer for arteriell remodellering etter stent og effektiviteten av slike stoffer. Eksisterende modeller for in-stent restenose i mus er vanskelig, krever høy kirurgiske ferdigheter og innebærer høy risiko for komplikasjoner som blødninger eller lammelser ^17-19. For eksempel, i modellen av stenten-implantering i toraks aorta fra en donor mus etter ballong-dilatasjon av beholderen og vil transplantering av stentet segment inn i halspulsåren av en mottaker ¹⁷ mus, er studiet av de patho-mekanismer som ikke er påvirkes bare av mottaker reaksjon på donor materiale, men også av den massive ødeleggende for vasa vasorum og adventitia. Implantasjon av rustfritt ståll stent direkte inn abdominal aorta etter ballong-dilatasjon ¹⁹ er etterfulgt av en høy dødelighet (35%) på grunn av bakben lammelse etter trombose eller blødning fra abdominal aorta på stedet av arteriotomy. Implantasjon av en spiralformet selv-ekspanderende nitinol-stent i abdominal aorta via lårarterien ¹⁸ trenger høye kirurgiske ferdigheter, mest på grunn blindt dirigere stent langs forgrening fra lårarterien til aorta å plassere stent i rett posisjon. Denne prosedyren er fulgt av en høy risiko for å skade den femorale nerve derfor paralyse av bakbenet. Sammenlignet med disse prosedyrene, ikke vår modell av stent i mus ikke trenger høy kirurgiske ferdigheter.

Vår modell har en enkel, lett og effektiv metode for å analysere effekten av ulike stoff-belegg på arteriell remodellering, er plassering av stent gjøres under syne, og det er ingen risiko for skadelige nerver eller andre strukturer. Den complex molekylære mekanismer kan undersøkes lettere i vår modell av mus halspulsåren stenting, ikke bare ved direkte adkomst til det fartøy, men også på grunn av at det eksisterer forskjellige knock-out mus stammer.

Som en begrensning, sammenlignet med den kliniske prosedyren, bruker vår modell friske mus / arterier og utfører ikke stenting på pre-eksisterende plakk (ikke in-stent restenose, men in-stent stenose). Vi har heller ikke utføre ballong-dilatasjon før stent-implantasjon. Imidlertid, på grunn av den massive skade av karveggen i begge modellene, de reparatory prosesser er like. Dessverre, på grunn av metall-avledet gjenstander, er et in vivo overvåkning av neointimal vekst ikke mulig ved eksisterende avbildningsmetoder som ultralyd eller computer-tomografi. En annen begrensende faktor er tynn seksjonering av metall-baserte stenter, som krever noe kompetanse i metall.

Ved hjelp av denne metoden, var vistand til å vise, at nøytrofilmedierte instruere biofunctionalized miniatyrisert nitinol-stenter belagt med LL-37 redusere i-stent restenose, og gir en roman konsept for å fremme vaskulær healing etter intervensjonsradiologi terapi ^21.

Til tross for disse begrensningene, synes denne modellen å være, før nå, den mest passende system, og dermed penger-og tidsbesparende, å undersøke nye stoff-belegg for stenter og deres virkninger på de molekylære hendelser under arteriell ombygging. Videre kan denne modellen enkelt tilpasses til hamster, som er mer lik den menneskelige, slik at hver terapeutisk hypotesen kan verifiseres før søknad til større dyr eller menneske å unngå ubehagelige og uventede effekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
nitinol-stents (self-made from nitinol-struts)	Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 μm	custom-made product	Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering
silicon tube	IFK Isofluor, Germany	custom-made product	diameter 500 μm, section thickness 100 μm, polytetrafluorethylene catheter
stereomicroscope	Olympus	SZ/X9
forceps	FST, Germany	91197-00	standard tip curved 0.17 mm
Ketamine 10%	CEVA, Germany
Xylazine 2%	Medistar, Germany
Bepanthene	Bayer, Germany
Scissors	FST, Germany	91460-11	Straight
Vannas scissor	Aesculap, Germany	OC 498 R
5/0 Silk	Seraflex	IC 108000
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z
guide-wire	Abbott Vascular	1001782-HC	0.014-inch angioplastie guide-wire
Michel suture clips	Aesculap, Germany	BN507R	7.5 x 1.75 mm
Michel Forcep	Aesculap, Germany	BN730R