דגם Murine של השתלת תומכן בעורק הראשי לחקר restenosis

Summary

מודל של השתלת תומכן בעורק התרדמה עכבר מתואר. בהשוואה לשיטות אחרות דומות, הליך זה הוא מהיר מאוד, פשוט ונגיש, ומציע את האפשרות ללמוד בדרך נוחה תגובת קיר כלי דם לסטנטים משחררי תרופות שונים והמנגנונים המולקולריים של restenosis.

Abstract

למרות ההתקדמות הניכרת שנעשתה בפיתוח סטנט בעשורים האחרונים, מחלות לב וכלי דם יישארו הגורם העיקרי למוות במדינות מערב. לצד היתרונות שמציעים פיתוח של סטנטים משחררי תרופות שונות, revascularization כלילית נושא גם את הסיכונים מסכני חיים של פקקת וrestenosis בסטנט. מחקר על אסטרטגיות טיפוליות חדשות נפגעת על ידי חוסר השיטות המתאימות ללימוד תהליכים והשתלת תומכן restenosis. כאן, אנו מתארים הליך מהיר ונגיש של השתלת תומכן בעורק התרדמה עכבר, אשר מציע את האפשרות ללמוד בדרך נוחה את המנגנונים המולקולריים של שיפוץ כלי שיט ואת ההשפעות של סמים ציפויים שונים.

Introduction

מחלות לב וכלי דם שנגרמו על ידי את ההתקדמות של טרשת עורקים הן הגורם המוביל למוות במדינות המתועשות. טרשת עורקים היא תגובת מוקד, דלקתי fibro שגשוג של קיר כלי הדם לפציעת האנדותל ^1, וכתוצאה מכך היווצרות של פלאק מורחב לתוך לומן של הכלי, המשפיעה על זרימת הדם דרך עורקים הכליליים. מעל 75% מתוצאת אוטם שריר הלב מהקרע של סיבי כובע הדק של ² פלאק הדלקתי. מאז סיבוך זה עלול להיות קטלני, transluminal אנגיופלסטיקה מלעורית (כלילי) (PTCA) עם השתלת תומכן הפכה ראשונה בטיפול הבחירה בפרקטיקה הרפואית הנוכחית. השיטה מאפשרת התרחבות של העורקים הכליליים ובכך צמצמו את השיקום של זרימת דם. במקביל, היא גורמת לפגיעה במידה שהאנדותל וכלי הקיר ^3. עם זאת, ההשפעה ארוכת הטווח של טיפול זה היא מוגבלת על ידי remode עורקים מוגזםלינג וrestenosis ^4.

על ידי העסקתו של סטנטים, PTCA הפך ליעיל יותר בטיפול בנגעים מורכבים, המאפשר revascularization לאחר סגירת כלי חריפה ^5. שיטה זו מקטינה את השכיחות של restenosis בסטנט פחות מ 10% ^6. לצד היתרונות הללו, ראשון בטיפול בחירה זו עבור revascularization כלילית נושא גם את הסיכונים מסכני חיים של פקקת וrestenosis בסטנט.

פקקת בתומכן-נגרמת על ידי דה endothelialization של כלי השיט, ואחרי הידבקות מסיבית של טסיות והפיברין לאתר נפגע. 26% מהחולים סובלים מפקקת בסטנט ולמות 63% מאוטם שריר הלב ^7. Restenosis מתייחס לתהליך של ריפוי פצע לאחר פגיעה מכאנית לדפנות כלי הדם, הכולל היפרפלזיה neointimal (הגירה והתפשטות של תאי שריר חלק בכלי דם (VSMC), תצהיר של מטריקס (ECM), ושיפוץשל כלי השיט. לעתים קרובות, מחדש התערבות פולשנית הופכת להיות נחוצה כדי dilatate כלי טרשת עורקים הצטמצמו קשה בשל פקקת וrestenosis בסטנט.

כדי למנוע פקקת בתומכן, טיפול ארוך טווח בתרופות אנטי טרומבוטיים יש צורך ^8. כדי למנוע restenosis, דור החדש של סטנטים משחררי תרופות elute סוכנים אנטי שגשוג כגון תרופות מדכאות חיסון (למשל סירולימוס, everolimus, zotarolimus) ותרופות אנטי סרטניים (למשל פקליטקסל) מציפוי פולימר במשך כמה חודשים ^9,10. למרות שתרופות אלו מפחיתות את היווצרות וrestenosis neointima, הם שומרים על סיכון גבוה של פקקת בתומכן על ידי עיכוב מחדש endothelialization.

לאחר פציעה העורק, התחזוקה של התא האנדותל היא חיונית כדי למנוע סיבוכים טרומבוטיים. בתנאים פיסיולוגיים, האנדותל האנושי מציג תחלופה קטנה ^11. תחת Patholתנאי ogical, לעומת זאת, יושרת אנדותל לקויה, כך שהתאוששות מהירה בסביבת תאי אנדותל בוגרים ותאי האנדותל (EPCs) נדרש ^12,13.

המחקר של מנגנונים אלה מורכבים מולקולריים בבעלי חיים גדולים יותר ^14-16 או בעורק אב העורקים עכבר הוא הליך קשה מאוד, המציע מידע מוגבל ^17-19. כדי לבדוק את היעילות של סטנט-ציפוי חדשני להפחתה פקקת בתומכן ודגמים חדשים restenosis הם הכרחיים.

Nitinol מייצג את הפלטפורמה האידיאלית עבור סטנטים בגלל "גמישותו הגבוהה, השפעת צורת זיכרון טובה וסובלנות בחולים, בשימוש בהצלחה בסטנטים ממתכת חשופות בשימוש קליני. סגסוגת זו אפשרה ליצור סטנט מיניאטורי עם קוטר חיצוני של 500 מיקרומטר, שיכול להיות מצופה ²⁰ ומושתל לתוך העורק הראשי של עכברים. הפיתוח של מיניאטורי Nitinol סטנט לעכבר געורק arotid, מאפשר הלימוד של מנגנונים מולקולריים מדויקים הנגרם על ידי השתלת תומכן, ומציע את האפשרות לבחון במהירות וביעילות את ההשפעות של סמים ציפויים שונים כדי למנוע restenosis. יתר על כן, קיומו של זני עכברים עקום החוצה שונים מהווה יתרון עצום בהבהרת התפקיד של מולקולות שונות המעורבים בצמיחת neointima ופקק בתומכן.

Protocol

1. הכנה והשתלת תומכן

1. סטנט-התמוכות (פורט וויין מתכות, Castlebar, אירלנד) היו קלועות ולאחר מכן לחתוך לגודל הרצוי במכון לטכנולוגית טקסטיל והנדסת מכונות, אוניברסיטת RWTH אאכן בגרמניה (איור 1 א).
2. לפני ההשתלה, סטנטים חייבים להיות מועברים לתוך צינור סיליקון 2 ס"מ, באמצעות מלקחיים, והניחו 2 מ"מ בסוף מסוף אחד, המכונה קצה קדמי (איור 1 א).
3. הקצה הקדמי יש לחתוך באלכסון, כדי להבטיח קצה חד להשתלה.
4. לפני ההשתלה, סטנט צריך להיות להשקות בשפע, על מנת להבטיח גלישה.

2. השתלת תומכן

1. 10-12 שבועות עכברי סוג בר C57BL / 6 גברים ישנים, 25-27 גרם מורדמים באמצעות זריקת intraperitoneal של קטמין מ"ג / ק"ג 100 ו10 xylazine מ"ג / ק"ג. הרדמה תקינה היא אושר לפני הניתוח על ידי היעדר רפלקסים ותנועת זקן. כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה, עיני העכבר מכוסות על ידי סרט של bepanthene שמנת.
2. לאחר גילוח וחיטוי נכון של אזור צוואר הגחון, חתך החציוני קטן של 1 ס"מ מתבצע תחת stereomicroscope, באמצעות מספריים. לאחר שהפריד את 2 גופי שומן עם מלקחיים מעוקלים סטריליים, ניתן לראות את עורק התרדמה המשותף השמאל פועם יחד עם קנה הנשימה.
3. 1 ס"מ של עורק התרדמה המשותף שמאל וההסתעפות צריך להיות מוכנים ללא תשלום. קשר 1 באמצעות חוט 5/0 משי יהיה מחויב סביב עורק התרדמה המשותף השמאל, 2 קשרים באמצעות 7/0 חוטי משי יהיו מחויבים סביב העורק הראשי החיצוני השמאלי, וקשר 1 באמצעות חוט משי 7/0 יהיה מחויב מסביב לעורק התרדמה הפנימי (איור 1).
4. זרימת הדם ואז נקטעה על ידי קשירת הקשרים בעורק התרדמה הפנימי ועורק התרדמה החיצוני הפרוקסימלי בתקיפות, כמו גם על ידי משיכת הקשר סראונדing עורק התרדמה המשותף. הכלי צריך להיות קבוע באופן שבו עורק התרדמה המשותף וחיצוני נמצאים בקו ישר.
5. חתך קטן בעורק התרדמה החיצוני מתבצע, ליד את הקשר הפרוקסימלי, באמצעות מספריים Vannas. צינור סיליקון המכיל סטנט מוחדר לעורק התרדמה החיצוני, עם הקצה החד בחזית, באמצעות מדריך תיל. לאחר סטנט מגיע למיקום הרצוי, צינור סיליקון הוא משך לאחור על מדריך התיל ומאפשר את הרחבת הזיכרון של צורה (איור 1) סטנט.
6. הקשר הדיסטלי בעורק התרדמה החיצוני להיקשר בחוזקה כדי לסגור את האתר של חתך ואת קשרים בעורק התרדמה הפנימי ונפוץ יוסרו, ובכך להחזיר את זרימת הדם.
7. החתך בעור נסגר באמצעות תפרי קליפים מישל 3-4 ומלקחי מישל. העכבר ממוקם תחת האור האדום עד להחלמה מלאה. טיפול משכך כאבים הוא לא הכרחי.
8. שלט יכול להיות מנותח לאחר 1-3 שבועות. ללמוד מחדש endothelialization, נקודת סיום בזמן מוקדם יותר יש צורך (3-4 ימים). אנחנו נצפו במודל שלנו, כי השתלת תומכן 4 שבועות לאחר התערבות כירורגית זו, במיוחד על ידי השימוש בציפויים ייחודיים לbiofunctionalize סטנטים מיניאטורי, neoangiogenesis מתרחש בכ -30% מדגימה. זוהי אחורית לתהליכי שיפוץ והתחדשות, עם מנגנונים שונים ומייצג בעיה פתולוגית אחרת. להתרכז ביצירה, היצרות neointima בסטנט ו / או ניתוח של מנגנונים אלה תופעות לוואי לאחר השתלת סטנט נקודת סיום בזמן של 3 שבועות תהיה מועילה לא לערבב עם השפעות משובי הנגרמות על ידי ההתפרצות של neoangiogenesis.

3. ניתוח של היווצרות הפלאק

1. בנקודת סיום בזמן, בעלי החיים הם מורדמים באמצעות זריקת intraperitoneal של קטמין מ"ג / ק"ג 100 ו10 xylazine מ"ג / ק"ג.הרדמה תקינה היא אושר לפני הניתוח על ידי היעדר רפלקסים ותנועת זקן.
2. בעלי החיים נהרגים על ידי exsanguination intracardial. סרום הדם שנאסף לצורך ניתוח נוסף.
3. לאחר פתיחת חלל בית החזה וPBS כביסה דרך intracardial punction, גוף זלוף עם 4% paraformaldehyde פתרון (PFA) מתבצע במשך 5 דקות. עורק הצוואר השמאלי שמכיל סטנט הוא גזור, ממוקם ישירות בפתרון PFA 4% ולפחות 16 שעות מאוחר יותר embbeded בפלסטיק.
4. 50 חלקים עבים מיקרומטר מבוצעים מדגימות באמצעות להקת יהלומים ראו פלסטיק משובץ.
5. כדי למדוד את גודל השלט, מכתים Giemsa מבוצע.
6. כדי לנתח את שיעור מחדש endothelialization בתוך שטח stented של כלי השיט, אימונוהיסטוכימיה לפון Willebrand גורם (vWF) מתבצעת.

Representative Results

1. ההשתלה של סטנט מיניאטורי Nitinol לתוך עורק הצוואר השמאלי של עכברים לוקחת 25-30 דקות ומציגה את שיעור תמותה של 10% בעיקר כתוצאה מהניזק של כלי השיט בהתערבות. שיעור הישרדות טוב יותר נצפה בעכברים שיש משקל יותר מ 25 גרם בזמן השתלת תומכן (שיעור תמותה של 5%). לכן, בחרנו עבור עכברי השתלת משקל בין 25-27 גרם. לאחר ניתוח, העכברים להתאושש מהרדמה תוך 2-5 דקות ואין ליקויים פיסיים, כמו שיתוק למשל, הם נצפו. מיקרו מחשב טומוגרפיה (Micro-CT) הדמיה מבוצעת שבוע לאחר השתלת תומכן הראתה כי סטנטים לא נקעו על ידי זרימת דם (איור 1 ג). למרבה הצער, ניתוח של היווצרות neointima בתמונות האלה הוא לא אפשרי בשל ממצא מתכת שמקורם (איור 1D, 1E).
2. אנחנו לא צופים בכל כלי שיט או נזק האנדותל של אזור unstented של כלי השיט, מייד מתחת לסטנט, גילוי על ידי כהיסטולוגית (איור 2 א) ועל ידי צביעה ספציפית לאנדותל (איור 2, אנטי עכבר CD31 נוגדן). לסקירה כללית טובה יותר, הסעיף נסרק באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים (איור 2 ב, 2 ג).
3. בכלי stented, הרחבה קבועה של 15% מזוהה (סטנט יחס: העורק, 1,15:1) על ידי עכברים עם משקל בין 25-27 גרם. היווצרות Neointima ופקיק-היווצרות יכולות להיות מנותחת על ידי stainings היסטולוגית הקלסיים (למשל Hematoxilin-eosin, Giemsa, Movat, Toluidin הכחול, מייסון-Trichrom-גולדנר, איור 3 א, 3 ב). מאז lamina פנימית וחיצוני והבינלאומיים אינן גלויה יותר, גודל שלט היה מחושב כהפרש של חיצוני ואזורי luminal (כלומר אזור פלאק: 234,566 ± 3315 מיקרומטר ^2, כלומר אזור luminal: 12036 ± 2662 מיקרומטר ^2). גם היקף חיצוני נמדד (ממוצע: 1799 ± 14 מיקרומטר). באשר לניתוחהרכב תאי, הסעיפים צריכים להיות deplastified ומוכתם בסמנים ספציפיים. עבור מחדש endothelialization, השתמשנו בנוגדן אנטי CD31 Cy3 מצומדות ולהתפשטות של תאי שריר חלק נוגדן אנטי SMA FITC-מצומדת (איור 3 ג). Re-endothelialization מחושב כאחוז מCD-31 מוכתם חיובי על פני השטח luminal הכולל (ממוצע: 23.07 ± 3.14%) שבוע לאחר השתלת תומכן.

כמובן, מספר בלתי מוגבל של מכתים ספציפי אפשרי, בהתאם לניסיון של כל מעבדות. ניתן גם לבצע ניתוח של שרשרת שרירן כבדה, לאפיון טוב יותר של SMCs, אלא גם ניתוח של תאי הסתננות (מונוציטים, לימפוציטים), או stainings לציטוקינים דלקתיים שונים, בהתאם למטרת המחקר.

ג = "/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg" />
איור 1. סקירה סכמטי של ההליך כירורגי (). זרימת הדם מופרעת על ידי קשירת הקשרים בעורק התרדמה הפנימי ועורק התרדמה החיצוני הפרוקסימלי בתקיפות, כמו גם על ידי משיכת הקשר המקיף את עורק התרדמה המשותף. צינור סיליקון המכיל סטנט מוחדר לעורק הראשי החיצוני דרך חתך קטן בעורק התרדמה החיצוני. לאחר סטנט מגיע למיקום הרצוי, צינור סיליקון הוא משך לאחור על מדריך התיל ומאפשר את הרחבת כושר הזיכרון של סטנט. תמונות מיקרו-CT המראות את מיקום סטנט שבוע לאחר השתלה כירורגית (ב '). בשל הממצאים שמקורם בחומר, ניתוח של צמיחת neointima אינו אפשרי (C, D).

3fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg "/>
איור 2. אזור Unstented של הכלי אינו מושפע מההליך כירורגי, כפי שמוצג על ידי Toluidin הכחולה (א) ו CD31 מכתים האנדותל ספציפי (B, C).

ניתן לבצע איור 3. ניתוח של השלט על ידי stainings היסטולוגית הקלסיים (למשל מאסון-Trichrom-גולדנר) (א). ניתן לאתר את פקיק המאורגן על ידי תצהירי הפיברין שחור מוכתמים בתוך neointima, במקרים מסוימים חסימה של הכלי שלם הוא ציין (ב '). שגשוג תאי שריר החלק (FITC, ירוק) מחדש endothelialization (Cy3, אדום) או זוהה על ידי צביעת immunofluorescence כפולה באמצעות סמנים ספציפיים.Counterstaining בוצע עם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, כחול) (ג). הבחנו מחדש יושלם endothelialization של תמוכות סטנט (חץ שמאלה, כפול) בהשוואה למחדש endothelialization luminal incompleted (חץ ימני, יחיד).

Discussion

כדי להפחית את הסיכון של קרישי דם וrestenosis סטנט ובתמיכה בפיתוח של ציפויים חדשים לסטנטים משחררי תרופות, שיטה קלה, פשוטה ונגישה של השתלת תומכן במודל של בעלי חיים יש צורך. עכברים לספק מערכת האידיאלית ללמוד את המנגנונים המורכבים של שיפוץ העורק לאחר השתלת תומכן ואת היעילות של תרופות מסוג זה. מודלים קיימים לrestenosis בסטנט בעכבר הם קשים, דורש מיומנויות כירורגיות גבוהות ומרמזים סיכונים גבוהים של סיבוכים כמו דימום או שיתוק ^17-19. לדוגמה, במודל של סטנט-ההשתלה לתוך אב העורקים החזי של עכבר תורם לאחר בלון התרחבות של כלי הדם ולאחר מכן השתלה של מגזר stented לתוך העורק הראשי של עכבר נמען ^17, המחקר של מנגנוני פתיו, אינו השפיע רק על ידי תגובה של נמען לחומר תורם, אלא גם על ידי הפגיעה מסיבית של ושה וvasorum adventitia. השרשה של stee חלדסטנט l ישירות לאב העורקים בבטן אחרי בלון הרחבה ¹⁹ ואחריו שיעור תמותה גבוה (35%) בשל שיתוק רגלו אחורי לאחר פקקת או דימום מאב העורקים בבטן באתר של arteriotomy. השתלה בצורת ספירלה עצמית הרחבת Nitinol-סטנט לאב העורקים בבטן דרך עורק הירך ¹⁸ צריכה מיומנויות כירורגיות גבוהות, בעיקר בשל עיוורון בימוי סטנט לאורך ההסתעפות מעורק הירך לאב העורקים למקום סטנט במיקום הנכון. הליך זה מלווה בסיכון גבוה לפגיעה בעצב הירך, ולכן שיתוק של הרגל האחורית. בהשוואה להליכים אלה, המודל של השתלת תומכן בעכבר שלנו לא זקוקים למיומנויות כירורגיות גבוהות.

המודל שלנו מציע שיטה פשוטה, קלה ויעילה כדי לנתח את ההשפעות של סמים ציפויים שונים על שיפוץ העורק, הצבת סטנט נעשתה תחת עין, ואין סיכונים של עצבים מזיקים או מבנים אחרים. Comניתן לחקור מנגנונים מולקולריים Plex קלים יותר במודל של העורק הראשי סטנט בעכבר שלנו, לא רק על ידי נגישות ישירה של הכלי, אלא גם בשל קיומם של זני עכברים עקום החוצה שונים.

כמגבלה אחת, השוואה עם ההליך הקליני, המודל שלנו משתמש בעכברים / עורקים בריאים ואינו מבצע סטנט על לוחות קיימים מראש (לא restenosis בסטנט, אך היצרות בסטנט). כמו כן, אנו לא מבצעים בלון הרחבה לפני סטנט-השתלה. עם זאת, בשל נזק המסיבי של דפנות הכולים הדם בשני המודלים, תהליכי reparatory דומים. לצערנו, עקב ממצאי מתכת שמקורם, בניטור vivo של צמיחת neointimal אינו אפשרי בשיטות הדמיה קיימות כמו אולטרסאונד או מחשב טומוגרפיה. עוד גורם מגביל הוא חתך הדק של סטנטים המבוססים על המתכת, אשר דורש קצת מומחיות בעיבוד המתכת.

באמצעות שיטה זו, שהיינוהצליח להראות, כי נויטרופילים מורה-biofunctionalized מיניאטורי Nitinol-סטנטים מצופים LL-37-להפחית בסטנט restenosis, מתן מושג חדש כדי לקדם את הריפוי של כלי דם לאחר טיפול התערבותית ^21.

למרות מגבלות אלה, נראה כי מודל זה להיות, עד עכשיו, את המערכת המתאימה ביותר, ובכך כסף וחיסכון בזמן, כדי לחקור ציפויי תרופה חדשים לסטנטים וההשפעות שלהם על האירועים המולקולריים במהלך שיפוץ העורק. יתר על כן, מודל זה ניתן להתאים בקלות לאוגר, שהוא דומה יותר לאדם, כך שכל השערת therapeutical ניתן לאמת לפני היישום לבעלי חיים גדולים יותר או אנושיים כדי למנוע תופעות לא נעימות ובלתי צפויות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
nitinol-stents (self-made from nitinol-struts)	Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 μm	custom-made product	Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering
silicon tube	IFK Isofluor, Germany	custom-made product	diameter 500 μm, section thickness 100 μm, polytetrafluorethylene catheter
stereomicroscope	Olympus	SZ/X9
forceps	FST, Germany	91197-00	standard tip curved 0.17 mm
Ketamine 10%	CEVA, Germany
Xylazine 2%	Medistar, Germany
Bepanthene	Bayer, Germany
Scissors	FST, Germany	91460-11	Straight
Vannas scissor	Aesculap, Germany	OC 498 R
5/0 Silk	Seraflex	IC 108000
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z
guide-wire	Abbott Vascular	1001782-HC	0.014-inch angioplastie guide-wire
Michel suture clips	Aesculap, Germany	BN507R	7.5 x 1.75 mm
Michel Forcep	Aesculap, Germany	BN730R