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Biology

उच्च throughput के आकार का उपयोग करते हुए शाही सेना माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी

Published: May 31, 2013 doi: 10.3791/50243
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1RT Biochemistry Section, HIV Drug Resistance Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research
* These authors contributed equally

Summary

प्राइमर एक्सटेंशन (आकार) द्वारा विश्लेषण उच्च throughput चयनात्मक 2 'हाइड्रॉक्सिल acylation एकल nucleotide प्रस्ताव पर कई हजार न्यूक्लियोटाइड करने के लिए कई सौ से RNAs के संरचनाओं निर्धारित करने के लिए एक प्रौद्योगिकी की जांच उपन्यास रासायनिक, रिवर्स प्रतिलेखन, केशिका वैद्युतकणसंचलन और माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करता है.

Abstract

जैविक प्रक्रियाओं में शामिल शाही सेना के समारोह को समझना शाही सेना संरचना का एक संपूर्ण ज्ञान की आवश्यकता है. यह अंत की ओर है, करार दिया पद्धति, या आकार "प्राइमर विस्तार से विश्लेषण उच्च throughput चयनात्मक 2 'हाइड्रॉक्सिल acylation", एकल nucleotide संकल्प के साथ शाही सेना माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी की अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण को प्राथमिकता जलीय घोल में शाही सेना के एकल असहाय या लचीला क्षेत्रों acylate कि रासायनिक जांच कर रही एजेंटों का इस्तेमाल करता है. रासायनिक संशोधन की साइटें संशोधित शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन ने पता लगाया है, और इस प्रतिक्रिया के उत्पादों स्वचालित केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) द्वारा fractionated हैं. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आकार अभिकर्मकों द्वारा संशोधित उन आरएनए न्यूक्लियोटाइड पर विराम देता है के बाद से, जिसके परिणामस्वरूप सीडीएनए पुस्तकालय परोक्ष रूप से ही जोड़ शाही सेना के संदर्भ में फंसे हैं कि उन ribonucleotides नक्शे. ShapeFinder सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, स्वचालित CE द्वारा उत्पादित electropherograms संसाधित और परमाणु में तब्दील कर रहे हैंcleotide जेट तालिकाओं कि खुद को RNAStructure (v5.3) भविष्यवाणी एल्गोरिथ्म में इस्तेमाल छद्म ऊर्जा की कमी में परिवर्तित कर रहे हैं. सिलिको शाही सेना माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी में साथ जांच कर रही आकार के संयोजन से प्राप्त दो आयामी शाही सेना संरचनाओं अकेले भी विधि का उपयोग कर प्राप्त संरचनाओं की तुलना में कहीं अधिक सटीक होना पाया गया है.

Introduction

Splicing है, अनुवाद, वायरस प्रतिकृति है और कैंसर के नियमन में शामिल उत्प्रेरक और गैर कोडन RNAs के कार्यों को समझने के लिए, शाही सेना संरचना का विस्तृत ज्ञान 1,2 आवश्यक है. दुर्भाग्य से, आरएनए तह की सटीक भविष्यवाणी एक दुर्जेय चुनौती प्रस्तुत करता है. शास्त्रीय जांच कर रही एजेंटों पीड़ित ऐसे विषाक्तता, अधूरा न्यूक्लियोटाइड कवरेज और / या प्रयोग के प्रति 100-150 न्यूक्लियोटाइड तक सीमित throughput के रूप में कई नुकसान से. बेबस माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी एल्गोरिदम इसी तरह, हानिकर प्रभावी रूप से उर्जा की समान संरचना के बीच अंतर करने में अपनी असमर्थता से उत्पन्न अशुद्धियों के कारण कर रहे हैं. विशेष रूप से बड़े RNAs भी इस तरह के एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी और उनके गठनात्मक लचीलापन और इन तकनीकों के लिए आवश्यक अत्यधिक शुद्ध नमूनों की बड़ी मात्रा के कारण, स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) अनुनाद परमाणु चुंबकीय के रूप में 3 डी संरचना निर्धारण के तरीकों को अक्सर आग रोक रहे हैं.

एचigh थ्रूपुट आकार एकल nucleotide संकल्प में बड़ी RNAs के ढांचों की जांच के लिए एक प्रभावी, सरल दृष्टिकोण प्रदान करके इन समस्याओं के कई हल करती है. इसके अलावा, आकार के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों संभालने के लिए सुरक्षित, आसान कर रहे हैं और, अभिकर्मकों की जांच सबसे अन्य रसायन के विपरीत, सभी चार ribonucleotides के साथ प्रतिक्रिया. इन अभिकर्मकों भी यह संभव विवो संदर्भ (ओं) 3 में अपने में RNAs की जांच के लिए बना रही है, सेलुलर झिल्ली घुसना कर सकते हैं. मूलतः सप्ताह प्रयोगशाला 4 में विकसित, आकार RNAs के एक विस्तृत विविधता, ~ 9 केबी एचआईवी -1 आरएनए जीनोम 5 की पूरी माध्यमिक संरचना के निर्धारण किया जा रहा है सबसे उल्लेखनीय उदाहरण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आकार का उपयोग करते हुए अन्य उल्लेखनीय उपलब्धियों संक्रामक viroids 6, मानव लंबे गैर कोडन RNAs 7, खमीर राइबोसोम 8, और riboswitches 9 के साथ ही पहचान के लिए विरिअन जुड़े एचआईवी -1 आरएनए 3 में प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के ढांचे की व्याख्या शामिल हैं. कआकार प्रोटोकॉल के इले मूल और उच्च throughput विविधताओं कहीं 10-12 प्रकाशित किया गया है, वर्तमान कार्य फ्लोरोसेंट oligonucleotides, Beckman कल्टर CEQ 8000 जेनेटिक विश्लेषक का उपयोग उच्च throughput आकार से शाही सेना माध्यमिक संरचना निर्धारण का विस्तृत विवरण प्रदान करता है, और SHAPEfinder और RNAStructure (v5.3) सॉफ्टवेयर. पहले अप्रकाशित तकनीकी जानकारी और समस्या निवारण सलाह भी शामिल किए गए हैं.

आकार के बदलाव

आकार और अपनी विविधताओं का सार चुनिंदा संशोधन के स्थलों पर भारी adducts उत्पादन, 2'-हाइड्रॉक्सिल (2'-OH) राइबोज़ समूहों acylate कि इलेक्ट्रोफिलिक anhydrides को जलीय घोल में शाही सेना के संपर्क में है. आधार बनती या वास्तुकला कंस्ट्रक्शन जबकि इस रासायनिक प्रतिक्रिया, एकल असहाय न्यूक्लियोटाइड इन अभिकर्मकों द्वारा इलेक्ट्रोफिलिक हमले के लिए अनुकूल रचना को अपनाने की संभावना है, के रूप में स्थानीय आरएनए संरचनात्मक गतिशीलता पूछताछ के साधन के रूप में कार्य करता हैained न्यूक्लियोटाइड कम या 10 unreactive हैं. अभिवर्तन गठन की साइटें संशोधित आरएनए ("()" प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया) पर एक विशिष्ट साइट के लिए संकरित fluorescently या radiolabeled प्राइमरों से की शुरुआत रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा पता चला रहे हैं. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) acylated ribonucleotides पार करने में विफल रहता है, सीडीएनए उत्पादों की एक पूल जिनकी लंबाई संशोधन की साइटों के साथ मेल खाना उत्पादन किया जाता है. एक नियंत्रण, "(-)" प्राइमर विस्तार अभिकर्मक को उजागर नहीं किया गया है कि शाही सेना के उपयोग की प्रतिक्रिया भी इसलिए किया जाता है कि संरचना, अविशिष्ट शाही सेना किनारा टूटना, आदि, मई आरएनए के कारण डीएनए संश्लेषण (यानी "बंद हो जाता है ') के समय से पहले समाप्त. रासायनिक संशोधन द्वारा उत्पादित pausing से प्रतिष्ठित किया. अंत में, एक ही प्राइमरों से की शुरुआत दो dideoxy अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं आरएनए प्राथमिक अनुक्रम वैद्युतकणसंचलन निम्नलिखित के साथ प्रतिक्रियाशील न्यूक्लियोटाइड सहसंबंधी मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है.

Shap के मूल आवेदन में(-), और दो ​​अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं ई, वही 32 पी अंत लेबल प्राइमर (+) के लिए उपयोग किया जाता है. इन प्रतिक्रियाओं के उत्पाद एक 5-8% polyacrylamide स्लैब जेल में आसन्न कुओं में भरी हुई है, और जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ, चित्रा 1) denaturing द्वारा fractionated रहे हैं. पारंपरिक आकार द्वारा उत्पादित जेल छवियों के मात्रात्मक विश्लेषण साफा, एक अर्द्ध स्वचालित footprinting विश्लेषण सॉफ्टवेयर 13 का उपयोग किया जा सकता है.

इसके विपरीत, उच्च throughput आकार fluorescently लेबल प्राइमरों और स्वचालित केशिका वैद्युतकणसंचलन कार्यरत हैं. विशेष रूप से, जांच के तहत शाही सेना, एक आम दृश्य है, लेकिन विभिन्न 5 'फ्लोरोसेंट लेबल संश्लेषित या खरीदा जाना चाहिए होने के चार डीएनए प्राइमर का एक सेट के प्रत्येक क्षेत्र के लिए. ये अलग लेबल oligonucleotides के प्रधानमंत्री दो आकार प्रतिक्रियाओं और दो अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं, जमा और fractionated / स्वचालित केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) से पता चला रहे हैं जो उत्पादों के लिए काम करते हैं. Wherईएएस शाही सेना के 100-150 NT के जेट प्रोफाइल मूल दृष्टिकोण का उपयोग कर चार प्रतिक्रियाओं का एक सेट से प्राप्त किया जा सकता है, उच्च throughput आकार एक भी जमा नमूना 3 300-600 NT के संकल्प की अनुमति देता है. के रूप में कई 96 के रूप में नमूने लगातार 12 सीई रन (चित्रा 2) के पाठ्यक्रम पर विभाजन के लिए तैयार कर सकते हैं, जबकि एक साथ fractionated हो सकता है ऊपर प्रतिक्रियाओं के 8 सेट करने के लिए. इसके अलावा, CEQ और अन्य आनुवंशिक analyzers से उभरते डेटा की प्रक्रिया और विश्लेषण करने के लिए विकसित SHAPEfinder सॉफ्टवेयर,, अधिक स्वचालित है और साफा 13 या अन्य जेल विश्लेषण संकुल की तुलना में बहुत कम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है.

अधिक उन्नत उच्च throughput के तरीके में हाल ही में इस तरह की प्राप्त करने के लिए तकनीक अनुक्रमण अगली पीढ़ी के साथ संयोजन के रूप में संरचना विशेष एंजाइमों के बजाय alkylation अभिकर्मकों का उपयोग करें जो PARS (आरएनए संरचना के समानांतर विश्लेषण) 14 और frag-Seq (टुकड़ा अनुक्रमण) 15, के रूप में उभरा है informatioशाही सेना संरचना के बारे में पता. इन तकनीकों के आकर्षण के बावजूद, जांच nuclease लिए निहित कई सीमाएं अभी भी 16 में रहते हैं. इन समस्याओं के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पारंपरिक आकार में प्रदर्शन किया है कि एक समान तरीके से रासायनिक संशोधन और RNAs के रिवर्स प्रतिलेखन से पहले है जहां आकार अनुक्रमण (आकार Seq) 17 प्रोटोकॉल में circumvented किया जा सकता है. इन तरीकों में शाही सेना संरचना निर्धारण के भविष्य का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, यह अगली पीढ़ी के अनुक्रमण बहुत महंगा है, और कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं रहता है कि यह याद रखना महत्वपूर्ण है.

आकार डेटा विश्लेषण

आनुवंशिक विश्लेषक में उत्पादित डेटा स्थानांतरण समय के एक सूचकांक के खिलाफ साजिश रची है केशिका डिटेक्टर के माध्यम से बह नमूना के प्रतिदीप्ति तीव्रता (ओं), जिसमें एक electropherogram के रूप में प्रस्तुत किया है. इस साजिश के चार प्रतिदीप्ति चैनल को इसी अतिव्यापी निशान के रूप लेता हैअलग fluorophores का पता लगाने के लिए किया जाता है, और प्रत्येक का पता लगाने व्यक्ति सीडीएनए या अनुक्रमण उत्पादों के लिए इसी चोटियों के शामिल है, जहां. Electropherogram डेटा एक टैब सीमांकित पाठ फ़ाइल के रूप में आनुवंशिक विश्लेषक से निर्यात और ShapeFinder परिवर्तन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर 18 में आयात किया जाता है.

ShapeFinder शुरू में प्रवास बार और शिखर मात्रा में सही क्रमशः प्रतिक्रिया उत्पादों की पहचान और मात्रा को प्रतिबिंबित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए डेटा पर गणितीय परिवर्तनों की एक श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चोटियों तो गठबंधन और एकीकृत, और परिणाम प्राथमिक आरएनए अनुक्रम के साथ एक साथ सारणीबद्ध रहे हैं. शाही सेना के उचित खंड के लिए एक "जेट प्रोफ़ाइल" (+) न्यूक्लियोटाइड प्रत्येक शाही सेना के साथ जुड़े मूल्यों से नियंत्रण मूल्यों घटाकर, और नीचे वर्णित के रूप में डेटा सामान्य से प्राप्त किया जाता है. इस प्रोफाइल सामान्यीकृत जेट वैल धर्मान्तरित (v5.3) सॉफ्टवेयर 19,20, RNAstructure में आयात किया जाता हैशाही सेना माध्यमिक संरचना तह एल्गोरिथ्म में शामिल कर रहे हैं कि छद्म ऊर्जा की कमी में ues. इस तरह से एल्गोरिदम जांच और तह रासायनिक संयोजन काफी अकेले 12,21 या तो विधि की तुलना संरचना भविष्यवाणी की सटीकता में सुधार. RNAstructure का उत्पादन (v5.3) सबसे कम ऊर्जा की छवियों शामिल शाही सेना माध्यमिक संरचनाओं शाब्दिक डॉट ब्रैकेट अंकन में आकार जेट प्रोफाइल (एस), और साथ ही एक ही संरचना के साथ रंग कोडित. बाद के बाद इस तरह वर्ना 22 और PseudoViewer 23 के रूप में शाही सेना माध्यमिक संरचना की चित्रमय प्रदर्शन करने के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर को निर्यात किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. आकार 4,10 के माध्यम से शाही सेना संरचना निर्धारण के फ़्लोचार्ट. (ए) शाही सेना मीटरप्र जैविक नमूने से या इन विट्रो प्रतिलेखन में द्वारा प्राप्त किया. (बी) के स्रोत पर निर्भर करता है, शाही सेना मुड़ा हुआ या अन्यथा संसाधित और आकार अभिकर्मक के साथ संशोधित किया गया है. (सी) रिवर्स प्रतिलेखन fluorescently या radioactively लेबल प्राइमरों का उपयोग. (डी) सीडीएनए उत्पादों रहे हैं या तो केशिका या स्लैब जेल आधारित वैद्युतकणसंचलन माध्यम fractionated. (ई) टुकड़ा विश्लेषण. (एफ) आरएनए संरचना भविष्यवाणी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. CE-आधारित आकार के उच्च throughput चरित्र तेजी से कई RNAs के विश्लेषण, और / या एक ही शाही सेना के कई क्षेत्रों की अनुमति देता है. (ए) कोडित) (बी) शाही सेना की धारा फ्लोरोसेंट प्राइमरों के विभिन्न सेट (काला तीर) का उपयोग कर स्वतंत्र रूप से जांच कर रहे हैं (सी) के समूह में विभाजित किया जा सकता है कि कैसे का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिक्रियाओं ~ 3 केबी RNA1 लिए पूर्ण कवरेज प्रदान करने, क्रमशः कुओं ए 1, बी 1, सी 1, आदि में जमा और लोड कर रहे हैं. RNAs के 2, 3, 4, आदि से रिएक्शन उत्पादों इसी तरह लगातार electrophoretic रन में विभाजन के लिए तैयार किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Protocol

आरएनए 3 'टर्मिनस के प्रथम डिजाइन और विस्तार

उच्च throughput आकार द्वारा लंबे RNAs के विश्लेषण के लिए, प्राइमर संकरण साइटों की एक श्रृंखला है कि वे (मैं) (ख) (ग) कि शाही सेना / लंबाई में 20-30 NT के हैं, और, ~ 300 NT के द्वारा अलग कर रहे हैं कि इस तरह का चयन किया जाना चाहिए इन साइटों के लिए डीएनए annealing द्वारा उत्पादित डीएनए संकर> 50 डिग्री सेल्सियस के एक आशा पिघलने तापमान है इस तरह के एक दृढ़ संकल्प अक्सर अनुपलब्ध है जो शाही सेना संरचना के कुछ पूर्वज्ञान, आवश्यकता बनाने हालांकि इसके अलावा, अत्यधिक संरचित होने की भविष्यवाणी कर रहे हैं कि शाही सेना के क्षेत्रों से बचा जाना चाहिए. इन साइटों के लिए संकरण कि डीएनए प्राइमरों तो वे स्थिर dimers या intrastrand माध्यमिक संरचनाओं फार्म की उम्मीद नहीं की होगी कि यह सुनिश्चित करने के लिए, देखभाल करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए.

एक बार बनाया गया, प्राइमर सेट या तो खरीदा (एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज, एम्स, आयोवा से जैसे) या 24,25 संश्लेषित किया जाना चाहिए. प्राइमर, Cy5, Cy5.5 साथ 5'लेबलWellRedD2 (Beckman कल्टर) और IRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (Beckman कल्टर) अच्छी crosstalk को जबकि कम से कम अच्छा संकेत तीव्रता प्रदान करने, Beckman कल्टर 8000 CEQ के लिए उपयुक्त हैं. लेबल oligonucleotides के -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे, 10 माइक्रोन aliquots में अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है, दोहराया फ्रीज / पिघलना चक्र से बचें.

इस तरीके से बनाया गया प्राइमरों का उपयोग करके, यह किसी भी लम्बाई के लगभग एक पूरे शाही सेना के लिए आकार डेटा प्राप्त करने के लिए संभव है. (उदाहरण के लिए एक "संरचना कैसेट") जो करने के लिए एक किताब 4 संकरित किया जा सकता टर्मिनल विस्तार हालांकि, 3 पर या निकट अनुक्रम 'शाही सेना के एक 3 शामिल करने के लिए इंजीनियर है जब तक एक शाही सेना की टर्मिनस, आकार को हमेशा दुर्गम है'.

केशिका वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से तैयारी शाही सेना

जैविक नमूने से RNAs के उच्च throughput आकार के लिए उपयोग किया जा सकता है, यहाँ दी प्रोटोकॉल इन विट्रो प्रतिलेखन में द्वारा निर्मित शाही सेना के लिए अनुकूलित है. वाणिज्यिक टीआरएऐसे MegaClear आरएनए शुद्धि कॉलम (Ambion) के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया MegaShortScript (Ambion) के रूप में nscription किट अच्छी तरह से शुद्ध शाही सेना की बड़ी मात्रा में पैदा करने के लिए अनुकूल हैं. RNAs -20 डिग्री सेल्सियस और -80 डिग्री सेल्सियस के बीच ते बफर में संग्रहित किया जाना चाहिए सर्वोत्तम परिणामों के लिए, RNAs के दोनों denaturing और गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सजातीय प्रकट करना चाहिए.

1. शाही सेना तह

  1. एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, पानी के साथ 18 μl को शाही सेना के 12 pmol पतला और 10X renaturation बफर के 2 μl जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं.
  2. 85 से हीट डिग्री सेल्सियस 4 को तो शांत 1 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 0.1 की दर से डिग्री सेल्सियस / सेक.
  3. पानी के 100 μl और 5X तह बफर के 30 μl जोड़ें.
  4. मुड़ा हुआ जा रहा आरएनए के आधार पर 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. सामान्य में, 2 मिलीग्राम रह गया है, और अधिक संरचित RNAs के + निर्भर तह अब ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है.
  5. दो 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए एक 72 μl विभाज्य स्थानांतरण: modifiएड (+) और नियंत्रण (-).

2. शाही सेना की रासायनिक संशोधन

खैर विशेषता, इलेक्ट्रोफिलिक आकार अभिकर्मकों isatoic एनहाइड्राइड (आइए), एन methylisatoic एनहाइड्राइड (NMIA), 1 मिथाइल-7-नाइट्रो-isatoic एनहाइड्राइड (1M7) 26, और benzoyl साइनाइड (BzCN) 27 में शामिल हैं. इनमें से सबसे अधिक उच्च throughput आकार के लिए इस्तेमाल किया 1M7 और NMIA हैं, और केवल बाद (जीवन टेक्नोलॉजीज) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. अभिकर्मक को संशोधित करने की अंतिम एकाग्रता, "एकल हिट" संशोधन कैनेटीक्स प्राप्त समाधान में सबसे RNAs के 11 विश्लेषण किया जा रहा शाही सेना के क्षेत्र में एक बार संशोधित कर रहे हैं जिसमें हालत अर्थात् प्रत्येक शाही सेना के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस इष्टतम एकाग्रता अभिकर्मक की एकाग्रता नीचे 2.1 धारा में तालिका में संकेत दिया सीमा (ओं) भर में विविध है जिसमें कई प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन से निर्धारित किया जा सकता है. एक आसानी से detectable संकेत है कि उत्पादन अभिकर्मक की एकाग्रता का उपयोग करते समय मिनटलंबी और छोटी डीएनए संश्लेषण उत्पादों (जैसे चित्रा 3) के बीच संकेत तीव्रता में अंतर imizing.

चित्रा 3
चित्रा 3. (ए) 0 (बी) 2.5 मिमी या (सी) 10 मिमी 1M7 साथ इलाज एक ~ 360 NT के शाही सेना से उत्पादित आकार electropherograms. सभी electropherograms एक ही पैमाने पर प्रदर्शित कर रहे हैं. नीले, हरे, लाल और काले रंग के निशान (+) प्रतिक्रिया उत्पादों (Cy5) के अनुरूप (-) प्रतिक्रिया उत्पादों (Cy5.5), और दो अनुक्रमण सीढ़ी (WellRed डी 2 और IRDye800), क्रमशः. छवि (बी) का उत्पादन किया जाता आरएनए का पता लगाने (बाएं) भर में कम से कम संकेत क्षय के साथ, अच्छा शिखर संकल्प और तीव्रता का प्रदर्शन, 1M7 की अधिकतम राशि के साथ इलाज किया गया है. लंबाई इन शर्तों के तहत अधिक से अधिक है पढ़ें. इसके विपरीत, मध्यम पूर्णांक का अभावensity, (ए) में अच्छी तरह से हल चोटियों 1M7 की एक उप इष्टतम एकाग्रता का पता चलता है. इसके विपरीत, (सी) में स्पष्ट संकेत क्षय कि एकल हिट कैनेटीक्स इंगित करता नहीं मनाया जाता है, और शाही सेना से अधिक संशोधित है. ऐसे मामलों में, आरटी शाही सेना टेम्पलेट के 5 'टर्मिनस मुठभेड़ की उम्मीद नहीं होगा, खासकर जब लंबाई उपअनुकूलित होगा पढ़ा.

  1. आकार अभिकर्मक (NMIA या 1M7) की 10X स्टॉक तैयार. यह सबसे अच्छा तो वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने DMSO जोड़ने, एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब अभिकर्मक की एक छोटी राशि जोड़कर हासिल की है ध्यान:. शाही सेना के साथ मिश्रित जब तक आकार अभिकर्मक समाधान निर्जल रहना चाहिए. स्टोर कमरे के तापमान पर एक desiccator में DMSO के, और शेयर समाधान तैयार तुरंत पहले परिवेश जल वाष्प के लिए जोखिम कम करने के लिए उपयोग करने के लिए.
    अभिकर्मक इष्टतम 10X एकाग्रता (DMSO में) करने के लिए समयअभिकर्मक 27 की पूरी गिरावट
    NMIA 10-100 मिमी ~ 20 मिनट
    1M7 10-50 मिमी 70 सेकंड

    तालिका 1. इलेक्ट्रोफिलिक अभिकर्मकों आरएनए संशोधन के लिए इस्तेमाल किया.
  2. . (-) संशोधित (+) और नियंत्रण करने के लिए 8 μl NMIA/1M7 10X या निर्जल DMSO जोड़ें क्रमशः, घोला जा सकता है ध्यान दें: 2.5 मिमी की परवाह किए बिना शाही सेना का विश्लेषण किया जा रहा है, NMIA और 1M7 दोनों के लिए एक प्रभावी शुरू एकाग्रता साबित हो गया है.
  3. 50 मिनट (NMIA) या के रूप में उपयुक्त 5 मिनट (1M7), के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  4. 3 एम NaOAc (5.2 पीएच), 8 μl 100 मिमी EDTA, ठंड इथेनॉल और 1 μl 10 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन के 240 μl (3 खंड) के 8 μl (0.1 खंड) जोड़कर वेग आरएनए. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र तो 2 घंटे के लिए ठण्डा और ठंड 70% इथेनॉल के साथ दो बार गोली धो ध्यान दें:. यह करने के लिए महत्वपूर्ण हैइस पर प्रतिकूल वैद्युतकणसंचलन दौरान शिखर संकल्प को प्रभावित कर सकते हैं, के रूप में नमक के सह वर्षा कम करने के लिए प्रशीतन समय, centrifugation समय और गति को कम.
  5. एक micropipette के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, और शुष्क हवा गोली कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए.
  6. 10 μl ते बफर में उपजी शाही सेना को भंग करने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं. यह पर्याप्त दो रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं के लिए शाही सेना को भंग कर दिया है. -20 डिग्री सेल्सियस ध्यान में अप्रयुक्त भाग स्टोर: गोली के मैकेनिकल मेजबान आमतौर पर आवश्यक नहीं है, और शाही सेना को नुकसान पहुंचा सकता है.

3. ट्रांसक्रिप्शन रिवर्स

यह कदम परोक्ष रूप से जो शाही सेना न्यूक्लियोटाइड एक आकार अभिकर्मक द्वारा संशोधित किया गया है के लिए डिग्री की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है कि fluorescently लेबल सीडीएनए उत्पादों उत्पन्न करता है. आकार के लिए, सुपरस्क्रिप्ट तृतीय (Invitrogen) के आर टी का प्रदर्शन अन्य सभी RTS परीक्षण के लिए बेहतर था, और इस के साथ प्रयोग के लिए चुना एंजाइम हैप्रोटोकॉल. क्रमशः, प्रतिक्रियाओं (-) Cy5 और Cy5.5 साथ लेबल oligonucleotides प्रधानमंत्री (+) और करने के लिए उपयोग किया जाता है. छोटे RNAs के लिए, प्राइमरों टर्मिनस 4 '3 के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए देशी शाही सेना के टर्मिनल एक्सटेंशन (उदाहरण के लिए एक "संरचना कैसेट")' एक 3 से संकरित हैं ध्यान:. इस बिंदु से सीई के माध्यम से, नमूने से संरक्षित किया जाना चाहिए प्रकाश.

  1. तैयार (+) और (-) 0.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में रिवर्स प्रतिलेखन के लिए नमूने. () आरटी प्रतिक्रिया के लिए, संशोधित आरएनए (+) के 5 μl, 6 μl पानी और 1 μl Cy5 लेबल प्राइमर (10 माइक्रोन) मिश्रण, के लिए (-) (-), आरटी प्रतिक्रिया, 5 μl नियंत्रण आरएनए मिश्रण . 6 μl पानी, और 1 μl Cy5 लेबल प्राइमर (10 माइक्रोन) ध्यान: Sarstedt पीसीआर ट्यूब (रेफरी 72.735.002) इस आवेदन के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
  2. जगह एक थर्मल cycler में ट्यूबों, और निम्न कार्यक्रम को लागू करने से शाही सेना और रिवर्स प्रतिलेखन के लिए तैयार करने के लिए प्राइमर पानी रखना: 85 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट, 60 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट;35 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट, 50 डिग्री सेल्सियस, पकड़.
  3. Annealing कदम के दौरान प्रदर्शन किया जाएगा, प्रतिक्रियाओं की संख्या, प्लस 50% (-) प्रतिक्रियाओं, पैमाने पर 4.5 गुना दो (+) और दो ​​(के लिए उदाहरण के लिए) के लिए पर्याप्त 2.5X आरटी मिश्रण तैयार करते हैं. 4 μl 5x आरटी बफर, 1 μl 100 मिमी डीटीटी, 1.5 μl पानी, 1 μl 10 मिमी dNTPs, 0.5 μl सुपरस्क्रिप्ट III आरटी इस प्रकार है: एक प्रतिक्रिया, 8 μl की आवश्यकता है. बर्फ पर रखें ध्यान:. 5X आरटी बफर और 100 मिमी डीटीटी सुपरस्क्रिप्ट III आर टी के साथ प्रदान की जाती हैं.
  4. (-) Annealing घोला जा सकता का तापमान 50 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, (+) और करने के लिए 2.5X आरटी मिश्रण की 8 μl जोड़ने प्रतिक्रियाओं सिफारिश:. गर्म आरटी मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं में जोड़ने से पहले .
  5. . 50 मिनट से अधिक समय के लिए RT प्रतिक्रियाओं के ऊष्मायन न्यायपालिका सीडीएनए उत्पादों में हो सकता है: 50 पर 50 मिनट डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और / या जगह बर्फ पर नोट को तो शांत के लिए सेते हैं.
  6. 95-1 μl 4 एम NaOH और हीटिंग जोड़कर आरएनए Hydrolyze डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए. बर्फ और फिर शांत प्रतिक्रियाओं 2 एम एचसीएल के 2 μl जोड़कर उन्हें बेअसर ध्यान दें:. सीडीएनए उत्पादों की खराब गुणवत्ता जुदाई में इस कदम के परिणाम की चूक.
  7. कम्बाइन (+) और (-) प्रतिक्रियाओं और 3 एम NaOAc के 0.1 खंड, 100 मिमी EDTA के 0.1 खंड, ठंड इथेनॉल के 1.5 खंड और 10 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन की 1 μl जोड़कर सीडीएनए वेग. 2 घंटे के लिए ठण्डा, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र ठंड 70% इथेनॉल के साथ दो बार गोली धो ध्यान दें:. केन्द्रापसारण उच्च दरों पर या गोली (ओं) resuspending कठिनाइयों में एक लंबी अवधि के परिणामों के लिए.
  8. अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए जोरदार vortexing द्वारा पीछा किया 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से विआयनीकृत formamide के 40 μl में pelleted सीडीएनए Resuspend ध्यान दें:. हिमपात अदृश्य हो सकता है. संकेत या कमजोर संकेत निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन की कमी पर्याप्त रूप से इस स्तर पर गोली भंग करने के लिए विफलता का परिणाम हो सकता है.
सीढ़ी अनुक्रमण का ई "> 4. तैयारी

अनुक्रमण सीढ़ी डाटा प्रोसेसिंग के दौरान न्यूक्लियोटाइड स्थिति का निर्धारण करने के लिए मार्कर के रूप में सेवा करते हैं. ये WellRed डी 2 या D1/Lycor 800 के साथ लेबल एक यूएसबी साइकिल अनुक्रमण आरएनए का अध्ययन किया जा रहा है के रूप में उसी क्रम होने किट (# 78500), डीएनए, और प्राइमरों का उपयोग करते हुए उत्पन्न कर रहे हैं. आमतौर पर, इस प्रतिक्रिया में कार्यरत डीएनए सवाल में शाही सेना के लिए एक प्रतिलेखन टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया है कि हो जाएगा. प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत हालांकि बारीकी किट निर्माता से सिफारिश की, प्रतिक्रिया कई गुना तक बढ़ाया जाता है कि जैसा दिखता है. डीडीए और डीडीटी नीचे वर्णित प्रतिक्रियाओं में श्रृंखला terminators के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, terminators के किसी भी जोड़ी अनुक्रमण सीढ़ी उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. डीडीए समाप्ति मिश्रण के 40 μl, डीएनए टेम्पलेट के 5 pmol, 10X Sequenase बफर, WellRed डी 2 लेबल प्राइमर, 82 μl के लिए कुल मात्रा लाने के लिए Sequenase और पानी के 4.6 μl के 10 μl के 4.6 μl मिलाएं. Sequenase पिछले जोड़ें. Prepaबजाय डीडीटी और Licor IR800 लेबल प्राइमर का उपयोग एक ही तरीके से एक दूसरे अनुक्रमण प्रतिक्रिया, फिर से.
  2. यूएसबी सिफारिश की शर्तों का उपयोग पीसीआर प्रवर्धन के लिए आगे ध्यान दें:. खनिज तेल के अलावा आवश्यक न ही प्रोटोकॉल / एक गर्म ढक्कन का उपयोग कि थर्मल cyclers के लिए अनुशंसित नहीं है.
  3. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब (~ 164 μl सम्पूर्ण) में प्रतिक्रियाओं अनुक्रमण डीडीए और डीडीटी का मिश्रण.
  4. निम्नानुसार वेग डीएनए: 16 μl 3 एम NaOAc (5.2 पीएच), 16 μl 100 मिमी EDTA, 1 μl 10 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन, और 480 μl 95% इथेनॉल जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स, 4 पर सेते ° सी 30 मिनट और अपकेंद्रित्र के लिए 30 मिनट के लिए 14,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर
  5. कम से कम 30 मिनट के लिए जोरदार vortexing द्वारा पीछा किया 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से विआयनीकृत formamide के 100 μl में pelleted सीडीएनए Resuspend.

5. केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा रिएक्शन उत्पाद की fractionation

केशिका वैद्युतकणसंचलन एक साथ की अनुमति देता हैएक भी नमूने में जमा चार प्रतिक्रियाओं से सीडीएनए संश्लेषण उत्पादों की जुदाई. के रूप में कई 96 के रूप में नमूने एक रन (चित्रा 2) के दौरान fractionated हो सकता है जबकि आठ नमूने, एक साथ fractionated हो सकता है.

  1. 10 जमा अनुक्रमण सीढ़ी के μl, और 96 अच्छी तरह से नमूना प्लेटों के स्थानांतरण के साथ जमा आकार के नमूने के 40 μl मिक्स ध्यान दें:. यह जरूरी है कि Beckman कल्टर अभिकर्मकों और प्लेट (दीर्घावधि औसत-मैं जेल सहित बफर, खनिज तेल, नमूना चल लोड हो रहा है समाधान और नमूना और बफर प्लेट) के Beckman-कल्टर CEQ 8000 जेनेटिक विश्लेषक के साथ इस्तेमाल किया जा.
  2. कार्यक्रम और केशिका वैद्युतकणसंचलन साधन तैयार करने और निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार चलाने नोट आरंभ:. नमूने का सबसे अच्छा समाधान के लिए, पहले प्रकाशित Cafà विधि मापदंडों 28 का उपयोग करें.

आदर्श रूप में, किताब और मजबूत बंद चोटियों, संकेतों के बाहर सभी चार electropherogram टी में प्रत्येक चोटी के लिएदौड़ रैखिक सीमा में होना चाहिए, संकेत में ड्रॉप बंद एक क्रमिक स्वीकार्य है. कभी कभी, तथापि, बड़े चोटियों (बंद हो जाता है) भी नियंत्रण प्रतिक्रिया में स्पष्ट कर रहे हैं, और ये बाद में डाटा प्रोसेसिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इन चोटियों को जन्म दे कि छोटा कर दिया cDNAs रिवर्स प्रतिलेखन (जैसे शाही सेना माध्यमिक संरचना), या आरएनए गिरावट के दौरान एक प्राकृतिक बाधा का परिणाम हो सकता है. पूर्व मामले में, इस तरह के betaine जैसे additives आरटी processivity में सुधार और / समयपूर्व समाप्ति रोक आरटी कम हो सकता है.

डेटा संसाधन

ShapeFinder सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता कल्पना और बदलना CE के निशान और आकार जेट प्रोफाइल के 18 में परिवर्तित करने की अनुमति देता है. जेट मूल्यों सारणीबद्ध रहे हैं, वे सामान्यीकृत और माध्यमिक संरचनात्मक मॉडल उत्पन्न और परिष्कृत करने के लिए RNAStructure (v5.3) में आयात किया जाता है.

6. ShapeFinder सॉफ्टवेयर

BaseFinder ट्रेस प्रसंस्करण बेनी का एक विस्तारफार्म 29, ShapeFinder के प्रकाशित संस्करण गैर वाणिज्यिक उपयोग के 18 के लिए आसानी से उपलब्ध है. ShapeFinder में से निपटने के डेटा के लिए विस्तृत निर्देश सॉफ्टवेयर प्रलेखन के साथ प्रदान की जाती हैं.

  1. Electropherograms वे (मैं) फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि के लिए सही करने के लिए समायोजित कर रहे हैं जहां ShapeFinder, में CEQ से आयात कर रहे हैं (दो) के पुष्पन तीव्रता में फ्लोरोसेंट चैनलों के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप, (ग) गतिशीलता अलग ढंग से टैग किया प्राइमरों द्वारा दिया पाली, (iv) में मतभेद आम उत्पादों विभिन्न fluorophores के साथ लेबल, और (v) संकेत क्षय रिवर्स प्रतिलेखन की समयपूर्व समाप्ति से उत्पन्न.
  2. ShapeFinder में "संरेखित और एकीकृत" की मदद से "व्यवस्था" समारोह स्वतः व्यक्ति चोटियों को पहचान प्रदान करती है और उपयोगकर्ता इनपुट और दो अनुक्रमण सीढ़ी द्वारा परिभाषित के रूप में शाही सेना के अनुक्रम को इस संबद्ध करता है. प्रारंभिक कार्य आम तौर पर अपूर्ण हैं, त्रुटियों के "शब्द" समारोह का उपयोग करते हुए मैन्युअल रूप से सही किया जा सकता हैएक ही उपकरण. प्रतिक्रिया चोटियों, और एक टैब सीमांकित पाठ फ़ाइल में इसी न्यूक्लियोटाइड संख्या के साथ साथ इन जेट मूल्यों tabulates (-) अंत में, "फ़िट" समारोह गठबंधन (+) और अधीन क्षेत्रों की गणना करता है.

नोट: डेटा का विश्लेषण आकार की शुद्धता के लिए महत्वपूर्ण है, और कुछ विचार सहित, इस विश्लेषण के दौरान बहुत महत्वपूर्ण हैं:

  • सिग्नल के लिए शोर संकेत करने वाली शोर अनुपात व्यक्ति चोटियों कम जेट के साथ पदों के लिए भी आसानी से पहचान योग्य होना चाहिए कि इस तरह हो गया है. ShapeFinder एक डेटा चौरसाई विकल्प प्रदान करता है, हालांकि, इस विकल्प यह तिरछा बाद के विश्लेषण कर सकते हैं, बेहद सावधानी से किया जाना चाहिए.
  • विश्लेषण के क्षेत्र: आमतौर पर, विश्वसनीय डेटा पृष्ठभूमि शोर से भेद करना मुश्किल स्तरों के लिए संकेत decays के रूप में प्राइमर 3 'टर्मिनस से हटा क्षेत्र 40-80 NT के से शुरू होने और समाप्त होने cDNAs 300-600 NT के लंबे समय से प्राप्त किया जा सकता है. बहु का प्रयोग करेंमिसाल प्राइमर सेट शाही सेना की लंबी हिस्सों का विश्लेषण करने की आवश्यकता होगी. इस मामले में, यह प्राइमर सेट के बीच विश्वसनीय संकेत में ओवरलैप 30-50 NT के रेंज में है की सिफारिश की है. छोटे RNAs पर, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अक्सर शाही सेना टेम्पलेट के अंत तक पहुँच जाता है, जहां देखभाल जिसका संकेत शोर अनुपात करने के लिए डीएनए संश्लेषण मजबूत रोक से प्रभावित है, उन चोटियों बाहर करने के लिए लिया जाना चाहिए.
  • सिग्नल क्षय: संकेत क्षय प्रयोग के साथ ही आरटी के अपूर्ण processivity दौरान शाही सेना संशोधन की हद से संबंधित है. आदर्श रूप में, विश्लेषण किया जा रहा शाही सेना के क्षेत्र के सापेक्ष एकल हिट कैनेटीक्स लंबाई पढ़ने को अधिकतम करने के क्रम में हासिल किया जाना चाहिए. Shapefinder संकेत क्षय के लिए सही करने में प्रभावी है कि एक उपकरण शामिल हैं, इस विश्लेषण में त्रुटि को पेश करने के लिए जाता है क्योंकि तथापि, - एकल हिट कैनेटीक्स नहीं मनाया जाता है, खासकर जब संकेत क्षय न्यूनतम है, जब यह सबसे अच्छा है (यानी, प्रयोग किया जाता है जब का वितरण चोटियों हिट एकल kine के अनुरूप हैtics). हाल ही में, संकेत संकेत क्षय को बदलने के लिए सुधार एल्गोरिदम 30 प्रकाशित किया गया है और संकेत क्षय एक विशेष रूप से प्रयोग में विशेष चिंता का विषय है अगर जांच की जानी चाहिए.
  • स्केलिंग सिग्नल. (-) निशान बराबर हैं यकीनन, नियंत्रण प्रोफाइल न्यूनतम प्रतिक्रियाशील (+) और के बीच शिखर तीव्रता इतनी है कि आकार डाटा प्रोसेसिंग में सबसे मनमाना कदम बढ़ाया जाना चाहिए. महान भी एक हद तक नियंत्रण ट्रेस स्केलिंग (नीचे डाटा सामान्य देखें) पहले चतुर्थक में नकारात्मक जेट मूल्यों का एक बहुतायत में परिणाम होगा. इस घटना में, पैमाने कारक के हिसाब से कम है और डेटा reintegrated किया जाना चाहिए.
  • चोटियों असाइनमेंट. सामान्य में, शिखर असाइनमेंट के स्वचालित संस्करण अच्छी तरह से काम करता है. प्रक्रिया विफल रहता है, तथापि, यह उपयोगकर्ता संकेत करने वाली शोर अनुपात कम है, खासकर जब सभी चोटियों सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता दी गई है कि यह सुनिश्चित करें कि आवश्यक है. कंधे चोटियों, उदाहरण के लिए, हमेशा जी अमीर से पता लगाया है, और नहीं कर रहे हैंquences अक्सर संकुचित कर रहे हैं.

7. डाटा सामान्य

RNAStructure (v5.3) सॉफ्टवेयर द्वारा इस्तेमाल किया माध्यमिक संरचना एल्गोरिथ्म में न्यूक्लियोटाइड जेट प्रोफाइल को शामिल करने, और / या निकट से संबंधित RNAs के प्रोफाइल की तुलना करने के लिए, आकार डेटा एक मानकीकृत फैशन 12 में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. यह शामिल है (मैं) की सभी जेट मूल्यों को विभाजित करके "प्रभावी अधिकतम" जेट (यानी, जेट मूल्य की उच्चतम 8% की औसत, outliers को छोड़कर) का निर्धारण करने के बाद की गणना से outliers, (ii) और (iii) सामान्य बनाने को छोड़कर "प्रभावी अधिकतम", इस प्रकार है:

  1. संरेखण और एकीकरण के बाद उत्पन्न टैब सीमांकित पाठ फ़ाइल को खोलने और एक एक्सेल स्प्रेडशीट में अपनी सामग्री की नकल. इस फाइल के दाएँ स्तंभ (RX.area-BG.area) शाही सेना के प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के लिए गणना पूर्ण आकार जेट मान हैं. सबसे बाएँ स्तंभ आरएनए sequ इस जेट संबंधितखिलाडि़यों.
  2. पहली और तिहाई चतुर्थक (यानी, 25 वीं और 75 वीं प्रतिशतक) के लिए मूल्यों (RX.area-BG.area) "= चतुर्थक (सरणी, गेलन)" एक्सेल समारोह का उपयोग कर की गणना करें और दुकान
  3. गणना और अन्तःचतुर्थक अंतर स्टोर "= चतुर्थक (सरणी, 3) चतुर्थक (सरणी, 1)"
  4. सूत्र "= (चतुर्थक, सरणी, 3) 1.5 * ((चतुर्थक (सरणी, 3) चतुर्थक (सरणी, 1))" का उपयोग "ग़ैर कटऑफ मूल्य" की गणना करें और दुकान. सभी जेट इस मूल्य से अधिक कर रहे हैं मूल्यों बाद में गणना से बाहर रखा जाए.
  5. से जेट मूल्यों (RX.area-BG.area) कॉपी और एक आसन्न, खाली कॉलम में पेस्ट, तो सबसे बड़ा स्तंभ के शीर्ष पर हैं कि इस तरह से इन मूल्यों को सॉर्ट.
  6. नव निर्मित "हल मूल्यों स्तंभ" में, ग़ैर कटऑफ मूल्य से अधिक मूल्यों को नष्ट.
  7. "क्रमबद्ध मूल्यों Colu में शेष जेट मूल्यों की सबसे बड़ी 8% की औसत की गणना और स्टोरकरोड़ ". यह मान है" प्रभावी अधिकतम "जेट.
  8. "सामान्यीकृत जेट मूल्यों" प्राप्त करने के लिए "प्रभावी अधिकतम" जेट मूल्य से (outliers सहित) प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की (RX.area-BG.area) unsorted फूट डालो. बाईं ओर एक खाली कॉलम छोड़ रहा है, एक खाली कॉलम में इन स्टोर. फिर, तालिका के बाईं पर न्यूक्लियोटाइड संख्या कॉपी और सीधे "सामान्यीकृत जेट मूल्यों 'के बाईं ओर खाली कॉलम में पेस्ट.
  9. कॉपी और एक पाठ संपादक में न्यूक्लियोटाइड स्थिति सामान्यीकृत जेट मूल्य जोड़े पेस्ट.
  10. इन संभावना आरटी टेम्पलेट के रासायनिक संशोधन के अलावा अन्य कारणों के लिए सीडीएनए संश्लेषण के दौरान रोक का परिणाम है, के रूप में -0.09 (यानी, रिक्त स्थान को खाली छोड़ दें) नीचे मूल्यों को हटा दें. इसके अलावा, रोक मजबूत असंशोधित टेम्पलेट (के रूप में "संरेखित और एकीकृत" ShapeFinder प्रोफ़ाइल के दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित) पर मनाया जाता है, जिस पर न्यूक्लियोटाइड के लिए किसी भी जेट मूल्यों, बाहर रखा जाना चाहिए.
  11. साRNAstructure (v5.3) सॉफ्टवेयर के साथ संरचनात्मक विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए एक. आकार एक्सटेंशन के साथ फ़ाइल ve.

8. आँकड़ा प्रतिरूपण

RNAstructure (v5.3) सॉफ्टवेयर आकार विश्लेषण 19 से निकाली गई छद्म मुक्त ऊर्जा की कमी का उपयोग कर प्रयोगात्मक समर्थित शाही सेना माध्यमिक संरचना (ओं) की भविष्यवाणी करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सॉफ्टवेयर सबसे कम ऊर्जा 2D शाही सेना संरचनाओं की चित्रमय अभ्यावेदन के साथ ही डॉट ब्रैकेट अंकन में इन संरचनाओं का शाब्दिक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है. बाद के प्रकाशन गुणवत्ता छवियों का उत्पादन करने के लिए उपयोगकर्ता की वरीयता, जैसे Pseudoviewer 23 या वर्ना 22, के एक शाही सेना संरचना दर्शक में आयात किया जा सकता है.

नोट: RNAstructure (v5.3) सॉफ्टवेयर द्वारा निर्मित संरचनाओं पर विचार करते समय ध्यान रखा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, सॉफ्टवेयर ऐसे pseudoknots और चुंबन छोरों के रूप में तृतीयक बातचीत को हल नहीं कर सकते हैं, और न ही इसके बारे में क्या कमी भेद कर सकते हैंएक निश्चित क्षेत्र में जेट बाध्य प्रोटीन से basepairing या steric संरक्षण की वजह से है. एक निश्चित संरचनात्मक मॉडल पेश जब एक परिणाम के रूप में, इन कारकों, व्यक्तिगत संरचनाओं के लिए रिपोर्ट ऊर्जा के साथ साथ विचार किया जाना चाहिए.

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Representative Results

शाही सेना उपस्थिति में एचआईवी -1 राजस्व प्रतिक्रिया तत्व (आरआरई) और एक 3 'टर्मिनल संरचना कैसेट 4 यह 37 पर हीटिंग, ठंडा, और ऊष्मायन से मुड़ा हुआ था, जिसके बाद इन विट्रो प्रतिलेखन में से एक linearized प्लाज्मिड से तैयार किया गया था डिग्री सेल्सियस से युक्त 2 MgCl की. शाही सेना NMIA के संपर्क में था और फिर 3 'टर्मिनल संरचना कैसेट संकरित एक 5'-अंत लेबल डीएनए प्राइमर से लिखित रिवर्स. परिणामस्वरूप आकार सीडीएनए पुस्तकालय, एक साथ नियंत्रण और अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के साथ, तो चित्रा 4 में दिखाया गया electropherogram निर्माण करने के Beckman कल्टर CEQ 8000 स्वचालित केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग fractionated था. निम्नानुसार चार अतिव्यापी, रंग कोडित निशान, केशिका के माध्यम से प्रतिक्रिया उत्पादों के चार सेट के प्रवास के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं: ब्लू (NMIA संशोधित RNAs के रिवर्स प्रतिलेखन से उत्पन्न Cy5 लेबल आरटी उत्पादों), हरे (Cy5.5 लेबल से आर टी उत्पादों मुड़ा, लेकिन अन्यथा unmodifiएड आरएनए), काली (डीडीजी का उपयोग कर उत्पन्न WellRed डी 2 लेबल डीएनए अनुक्रमण सीढ़ी) और लाल (Lycor800 लेबल अनुक्रमण सीढ़ी, डीडीटी).

कच्चे सीई निशान संसाधित गठबंधन और ShapeFinder सॉफ्टवेयर 18 का उपयोग कर एकीकृत, अलग हो गए थे. आरआरई SLII क्षेत्र के लिए इसी का पता लगाने (एस) के क्षेत्र चित्रा 5 में दिखाया गया है, डेटा शिखर एकीकरण करने के तुरंत पहले बिंदु (पृष्ठभूमि घटाव के अधीन यानी, निशान गठबंधन किया गया है, संकेत क्षय के लिए सुधार करने के लिए संसाधित किया गया होने , आदि.). (-) प्रतिक्रिया (क्रमशः नीले और हरे निशान में), और पूर्व से बाद घटाकर प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के लिए जेट मूल्यों NMIA (+) और NMIA में इसी चोटियों को एकीकृत करके गणना कर रहे हैं. ये जेट मूल्यों आरटी जो करने के लिए प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड NMIA द्वारा संशोधित किया गया डिग्री का एक प्रतिबिंब है जो रिवर्स प्रतिलेखन के दौरान प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड पर समाप्त हो जाता है जिसमें सीमा का संकेतऔर इसलिए अपनी प्रवृत्ति ही समाधान में फंसे होने की.

ShapeFinder में उत्पन्न एचआईवी -1 आरआरई आकार जेट प्रोफाइल सामान्यीकृत और RNAStructure (v5.3) 19 में आयात के लिए उपयुक्त एक पाठ दस्तावेज़ में परिवर्तित कर दिया गया. बाद के सॉफ्टवेयर में, जेट मूल्यों जिससे संरचनाओं सबसे कम मुक्त ऊर्जा के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं जो प्रभावित करने, छद्म ऊर्जा की कमी के रूप में माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी एल्गोरिथ्म में शामिल थे. कार्यक्रम उत्पादन डॉट ब्रैकेट अंकन में व्यक्त इन संरचनाओं युक्त एल्गोरिथ्म के साथ ही पाठ फ़ाइलों से उत्पन्न सबसे कम ऊर्जा संरचनाओं का चित्रण दो आयामी शाही सेना माध्यमिक संरचना नक्शे के शामिल है. इन outputs के उत्तरार्द्ध ऐसे वर्ना 22 के रूप में शाही सेना दृश्य सॉफ्टवेयर में निर्यात किया जा सकता है. चित्रा 6 आकार व्युत्पन्न जेट प्रोफाइल उपयोग RNAStructure में उत्पन्न एचआईवी आरआरई SLII क्षेत्र (v5.3) के 2 डी संरचना से पता चलता है और वर्ना उपयोग करते हुए कल्पना. रंग कोडित आकार जेट मूल्यों आरोपित कर रहे हैं.

चित्रा 4
4 चित्रा. . (-) अभिकर्मक प्रयोगों, ब्लू और ग्रीन चैनल (+) अभिकर्मक और प्रतिनिधित्व: CEQ 8000 जेनेटिक विश्लेषण प्रणाली (बैकमैन) में देखी एक शाही सेना नमूना के प्रतिनिधि electropherogram सॉफ्टवेयर हर चैनल एक रंग की रेखा के रूप में दिखाया गया है जहां एक ट्रेस प्रदर्शित करता है और काले और लाल अनुक्रमण सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक्स और वाई कुल्हाड़ियों क्रमशः संकल्प समय और प्रतिदीप्ति तीव्रता निरूपित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 5. ShapeFinder उपकरण 18 का उपयोग करते हुए विश्लेषण electropherogram. डेटा दृश्य विंडो (बीच में) प्रत्येक डाटा प्रोसेसिंग कदम पर चित्रमय प्रतिक्रिया देता है. उपकरण निरीक्षक खिड़की (बाएं नीचे) स्क्रिप्टिंग निरीक्षक में चयनित उपकरण के लिए मापदंडों को दर्शाता है. स्क्रिप्टिंग निरीक्षक (ऊपरी दाएँ) डेटा के लिए लागू किया गया है कि उन उपकरणों को प्रदर्शित करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
6 चित्रा. दो आयामी शाही सेना संरचना रंग वर्ना दृश्य एप्लेट 22 का उपयोग कर उत्पन्न आकार जेट के लिए कोडित. न्यूक्लियोटाइड आकार जेट की डिग्री (ओं) को इंगित करने के लिए रंग कोडित रहे हैं. मेंस्पेक्ट्रम दिखाया, नीले और लाल हलकों क्रमश: निम्न और उच्च जेट होने न्यूक्लियोटाइड संकेत मिलता है.

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Discussion

हम यहाँ उच्च throughput आकार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, किसी भी आकार के RNAs के लिए एकल nucleotide संकल्प माध्यमिक संरचना निर्धारण की अनुमति देता है कि एक तकनीक मौजूद है. इसके अलावा, माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी एल्गोरिदम के साथ प्रयोगात्मक आकार डेटा युग्मन अकेले या तो विधि के साथ हो सकता है की तुलना में सटीकता की एक उच्च डिग्री के साथ शाही सेना के 2 डी मॉडल की पीढ़ी की सुविधा. fluorescently लेबल प्राइमरों और स्वचालित CE के संयोजन एक ही प्रयोग में लंबे दृश्यों शाही सेना के संकल्प की सुविधा परंपरागत जेल आधारित आकार से अधिक महत्वपूर्ण लाभ, साथ ही साथ कई प्रयोगों के लिए काफी अधिक गति और throughput प्रदान करता है. उपयुक्त डेटा विश्लेषण उपकरणों की इस पद्धति और उपलब्धता की अवसरवादिता संरचनात्मक पहले असभ्य वायरल, अक्षत दूत का विश्लेषण, और noncoding RNAs के लिए आदर्श रूप से अनुकूल आकार बनाते हैं. इन पेचीदा RNAs के 2 डी संरचनाओं साफ हो जाते हैं, हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी के उपयोग के माध्यम से, स्पा, जांचCE के दरार के तरीके और आणविक मॉडलिंग जटिल तृतीयक बातचीत को स्पष्ट करने में मदद और अंततः शोधकर्ताओं ने तीन आयामों में इन RNAs के ढांचे का निर्धारण करने के लिए अनुमति चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

एस Lusvarghi, जे Sztuba-Solinska, के.जे. Purzycka, जेडब्ल्यू रॉश और SFJ ले Grice राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, संयुक्त राज्य अमेरिका के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
N-methylisatoic anhydride (NMIA) Life technologies M25 Dissolve in anhydrous DMSO
1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7) see ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase Life technologies 18080044 10,000 units
Thermo sequenase cycle sequencing kit Affymetrix 78500
Materials provided by the user
RNA of interest 6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)
Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800) Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.
DNA template DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.
Buffers
10x RNA renaturation buffer 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X RNA folding buffer 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)
2.5X RT mix 4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1.5 μl water,1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).
GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter) Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles
EQUIPMENT
Capillary electrophoresis Beckman CEQ8000
Thermocycler varies

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References

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Lusvarghi, S., Sztuba-Solinska, J., Purzycka, K. J., Rausch, J. W., Le Grice, S. F. J. RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE. J. Vis. Exp. (75), e50243, doi:10.3791/50243 (2013).

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