Summary
프라이머 확장 (SHAPE)에 의해 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는 단일 염기 해상도에서 수천 개의 뉴클레오티드로 수백에서의 RNA 구조를 결정하는 기술을 프로빙 소설 화학, 역전사, 모세관 전기 영동 및 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용합니다.
Abstract
생물 학적 과정에 관여 RNA의 기능을 이해하는 것은 RNA 구조의 철저한 지식이 필요합니다. 이를 위해, 불리는 방법은, 또는 모양 "프라이머 확장하여 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는"단일 염기 해상도를 가진 RNA 이차 구조 예측을 할 수 있습니다. 이 방법은 우선적으로 수용액 RNA의 단일 좌초 또는 유연한 지역 acylate 화학 프로빙 에이전트를 사용합니다. 화학적 변형의 사이트는 수정 된 RNA의 역전사에 의해 감지하고,이 반응의 제품은 자동화 된 모세관 전기 영동 (CE)에 의해 분별입니다 수 있습니다. 역전사 효소는 SHAPE 시약에 의해 수정하는 RNA의 뉴클레오티드에서 일시 정지하기 때문에, 결과의 cDNA 라이브러리는 간접적으로 하나의 접힌 RNA의 맥락에서 좌초하는 리보 뉴클레오타이드를 매핑합니다. ShapeFinder 소프트웨어를 사용하여 자동화 CE에 의해 생성 된 electropherograms가 처리되고 뉴로 변환cleotide 반응성 테이블은 그 자체가 RNAStructure (V5.3) 예측 알고리즘에 사용 된 의사 에너지 제약 조건으로 변환됩니다. 실리코 RNA 이차 구조 예측에서와 프로브 형상을 결합하여 얻은 두 가지 차원 RNA 구조는 혼자 두 방법을 사용하여 얻은 구조보다 훨씬 더 정확한 것으로 판명되었다.
Introduction
접합, 번역, 바이러스 복제 및 암의 조절에 관여 촉매 및 비 코딩 RNA를의 기능을 이해하기 위해, RNA 구조의 상세한 지식은 1,2 필요합니다. 불행하게도, RNA 접이식의 정확한 예측은 강력한 도전을 선물한다. 고전 프로빙 에이전트는 고통과 같은 독성, 불완전 염기 범위 및 / 또는 실험 당 100 ~ 150 뉴클레오티드 제한 처리 등 많은 단점에서. 남의 차 구조 예측 알고리즘은 유사하게 불리한 효율적으로 정력적으로 유사한 구조를 구별하기 위해 무능력으로 인한 부정확성으로 인해 수 있습니다. 특히 큰 RNA를 또한 X-선 결정학과 구조적 유연성과 이러한 기술에 필요한 고순도 샘플을 대량으로 인해 분광법 (NMR) 공명 핵 자기와 같은 3D 구조를 결정하는 방법을 자주 내화물입니다.
H고등학교의 처리량 모양의 단일 염기 해상도로 대형의 RNA 구조를 프로빙에 효과적인 간단한 방법을 제공함으로써 많은 문제를 해결합니다. 또한, 모양에 사용되는 시약 처리 안전, 쉽고, 시약 프로브 대부분의 다른 화학 대조적으로, 네 개의 리보 뉴클레오티드로 반응합니다. 이 시약은 또한 가능한 생체 컨텍스트 (들) 3 자신의 RNA를을 조사하기 위해 만들어 세포막을 통과 할 수 있습니다. 원래 주 실험실 4에서 개발, 모양의 RNA 다양한 ~ 9킬로바이트 HIV-1 RNA 게놈 5의 전체 차 구조 결정되는 가장 주목할만한 예제를 분석하는 데 사용되었습니다. SHAPE를 사용하여 다른 주목할만한 업적은 전염성 로이드 6, 인간의 긴 비 코딩 RNAs를 7, 효모 리보솜 8 및 리보 스위치 9뿐만 아니라 식별 할 수 virion의 관련되는 HIV-1 RNA 3 단백질 결합 부위의 구조의 해명이 (가) 있습니다. WHSHAPE 프로토콜의 일 원본과 높은 처리량 변화는 다른 10-12 게시 된, 본 연구는 형광 올리고 뉴클레오타이드를, 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 CEQ 8000 유전자 분석기를 사용하여 높은 처리량의 형상에 의해 RNA 이차 구조 결정에 대한 자세한 설명을 제공하고, SHAPEfinder 및 RNAStructure (V5.3) 소프트웨어입니다. 이전에 발표되지 않은 기술적 인 세부 사항 및 문제 해결 조언도 포함되어 있습니다.
모양의 변형
SHAPE와 그 변화의 본질은 선택적으로 변형 사이트에서 부피 부가 물을 생산, 2'-히드 록시 (2'-OH) 리보오스 그룹을 acylate 전자 성 무수물로 수용액 RNA의 노출이다. 베이스 쌍 또는 구조적 생성자하는 동안이 화학 반응은 단일 가닥 핵산이 시약에 의한 전자 성 공격에 도움이되는 conformations에 채택하는 경향이기 때문에, 지역의 RNA 구조 역학을 심문하는 수단으로 역할을ained 뉴클레오티드가 작거나 10 반응성이다. 부가 생성물 형성의 사이트는 수정 된 RNA ( "(+)"프라이머 연장 반응)에 특정 사이트에 하이브리드 형광이나 방사성 동위 원소 프라이머에서 시작 역전사에 의해 감지됩니다. 역전사 효소 (RT)는 실화 리보 뉴클레오타이드를 통과하는 데 실패하면, cDNA를 제품의 풀은 그 길이 수정의 사이트와 일치 생산됩니다. 컨트롤은 "(-)"프라이머 확장 시약에 노출되지 않은 RNA를 활용 반응은 그렇게 수행되는 구조 특이 RNA 가닥 파손 등, 5 월을 RNA에 의한 DNA 합성 (예 : "중지")의 조기 종료. 화학적 변형에 의해 생성 일시 중지 구분할 수. 마지막으로, 같은 프라이머에서 시작 두 dideoxy 시퀀싱 반응은 RNA 기본 순서가 전기를 다음과 같이 반응 뉴클레오티드의 상관 관계를 마커로 사용됩니다.
SHAP의 원래 응용 프로그램에서(-), 두 개의 연속 반응 E, 같은 32 P-끝 레이블 프라이머 (+)를 위해 사용됩니다. 이러한 반응의 제품은 5-8 %의 폴리 아크릴 아미드 슬래브 겔에 인접 우물에로드 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE, 그림 1) 변성에 의해 분별하고 있습니다. 기존의 모양에 의해 생성 된 겔 이미지의 정량 분석은 사파, 반자동 배출량 측정 분석 소프트웨어 13를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
반면, 높은 처리량 모양 찬란 프라이머 및 자동화 모세관 전기 영동을 사용합니다. 특히, 조사 대상 RNA, 일반적인 순서 만 다른 5 '형광 라벨을 합성하거나 구입해야하는 데 네 가지 DNA 프라이머 세트의 각 지역. 이러한 다르게 표지 된 올리고 뉴클레오티드는 주요 두 가지 모양의 반응과 두 개의 연속 반응, 풀링 그리고 분별 / 자동 모세관 전기 영동 (CE)에 의해 감지되는의 제품을 제공합니다. 실어EAS는 RNA의 100 ~ 150 NT의 반응 프로파일은 원래의 방법을 사용하여 네 가지 반응의 집합에서 얻을 수있는, 높은 처리량 SHAPE는 단일 풀링 된 샘플 3 300-600 NT의 해상도를 할 수 있습니다. 많은 96 샘플 12 연속 CE가 실행 (그림 2)의 과정을 통해 분별을 준비 할 수있는 동안, 동시에 분별 할 수 있습니다 최대 반응의 8 세트까지. 또한, CEQ와 다른 유전자 분석기에서 나오는 데이터를 처리하고 분석하기 위해 개발 SHAPEfinder 소프트웨어는 더 자동화 및 SAFA 13이나 젤 분석 패키지보다 훨씬 적은 사용자 개입이 필요합니다.
고급 높은 처리량 방법은 최근에 이러한 얻기 위해 기술을 시퀀싱 다음 세대와 함께 구조 특정 효소보다는 알킬화 시약을 사용 PARS (RNA 구조의 병렬 분석) 14 수류탄 - 시퀀서 (조각 시퀀싱) 15로 등장 정 보RNA 구조에 대한 N. 이러한 기술의 매력에도 불구하고, 프로브 핵산에 내재 많은 제한은 여전히 16 남아있다. 이러한 문제는 차세대 시퀀싱은 기존의 모양에서 수행하는 것과 유사한 방식으로 화학적 변형과의 RNA 역전사 앞에는 SHAPE 시퀀싱 (SHAPE-시퀀서) 17 프로토콜에서 회피 할 수있다. 이러한 방법은 RNA 구조 결정의 미래를 나타낼 수 있지만, 그것은 차세대 시퀀싱은 매우 고가이며, 많은 실험실에 사용할 수없는 상태 것을 기억하는 것이 중요합니다.
셰이프 데이터 분석
유전자 분석기에서 생산 데이터를 마이그레이션 시간의 인덱스에 그려지는 모세관 검출기를 통과하는 시료의 형광 강도 (들)을 상기, electropherogram의 형태로 제공됩니다. 이 그래프는 네 개의 형광 채널에 해당하는 중복 흔적의 형태를 취s는 서로 다른 형광 물질을 감지하는 데 사용되며, 각 추적은 개별 cDNA를 또는 시퀀싱 제품에 해당하는 봉우리 구성입니다. Electropherogram 데이터는 탭으로 구분 된 텍스트 파일로 유전자 분석기에서 보낸 ShapeFinder 변환 및 분석 소프트웨어를 18로 가져옵니다.
ShapeFinder는 처음 마이그레이션 시간과 최대 볼륨이 정확하게 각각 반응 생성물의 ID 및 수량을 반영하도록 데이터를 수학적 일련의 변환을 수행하는 데 사용됩니다. 피크는 다음 정렬 및 통합, 결과는 기본 RNA 시퀀스와 함께 표로 있습니다. RNA의 관련 세그먼트에 대한 "반응 프로파일은"(+) 염기 각 RNA와 관련된 값과 제어 값을 빼서, 아래 설명 된대로 데이터를 정규화하여 얻을 수 있습니다. 이 프로필은 정규화 된 반응성 발을 변환 (V5.3) 소프트웨어 19,20에게, RNAstructure로 가져RNA 이차 구조의 접이식 알고리즘에 통합 의사 에너지 제약에 단말. 이 방법으로 알고리즘을 프로빙 및 접는 화학 물질을 결합하여 현저하게 혼자 12,21 두 방법에 비해 구조 예측의 정확성을 향상시킵니다. RNAstructure의 출력 (V5.3)은 낮은 에너지의 이미지가 포함되어 RNA 이차 구조의 텍스트 점 괄호 표기법 SHAPE 반응성 프로파일 (들)뿐만 아니라 동일한 구조를 색으로 구분. 후자는 이후 같은 바르나 22 PseudoViewer 23와 같은 RNA 이차 구조의 그래픽 디스플레이 전용 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다.
그림 1. SHAPE 4,10를 통해 RNA의 구조 결정의 흐름도. (A) RNA M바깥은 생물 학적 샘플이나 시험 관내 전사하여 얻을 수. (B) 소스에 따라, RNA는 접하거나 처리 SHAPE 시약으로 변경됩니다. (C) 역 전사 형광이나 방사성 표시 프라이머를 사용하여. (D)의 cDNA 제품은 하나 모세관 또는 슬래브 겔 기반의 전기를 통해 분별. (E) 조각 분석. (F) RNA 구조 예측. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. CE 기반 SHAPE의 높은 처리량 문자 신속한 여러 RNA를 분석, 및 / 또는 동일한 RNA의 여러 세그먼트를 할 수 있습니다. (A) (B) RNA의 섹션은 형광 프라이머의 집합을 (검은 색 화살표)를 사용하여 독립적으로 조사됩니다 (C)의 집합으로 나눌 수 있습니다 방법을 나타냅니다 반응은 ~ 3킬로바이트 RNA1에 대한 완전한 범위를 제공, 각각 우물 A1, B1, C1, 등으로 풀링 및로드됩니다. RNA를 2, 3, 4 등의 반응 제품은 유사하게 연속 전기 영동 실행의 분별을 준비 할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
RNA 3 '말단의 프라이머 설계 및 확장
높은 처리량 모양으로 긴 RNA를 분석하기 위해 프라이머 하이브리드 사이트의 시리즈는 그들이 (I) (II) (III)는 RNA / 길이 20 ~ 30 NT를, 그리고 ~ 300 NT에서 분리되는 등 선택해야합니다 이 사이트에 DNA를 열처리에 의해 만들어진 DNA의 하이브리드> 50 ° C.의 예상 용융 온도가 이러한 결정은 종종 사용할 수 없습니다 RNA 구조의 일부 예지를 필요로하고 있지만, 또한 고도로 구조화 될 것으로 예상되는 RNA의 세그먼트는 피해야한다. 이 사이트에 잡종 DNA 프라이머는 다음 그들은 안정적인 이합체 또는 intrastrand 차 구조를 형성 할 것으로 예상되지 않을 수 있도록주의하여 설계되어야한다.
일단 설계, 프라이머 세트는 하나 구입 (통합 DNA 기술, 에임스, 아이오와의 예) 또는 24.25을 합성해야합니다. 프라이머, Cy5에, Cy5.5와 5'는 - 라벨WellRedD2 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날)와 IRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날)이 가장 혼선을 최소화하면서 좋은 신호 강도를 제공 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 8000 CEQ에 적합합니다. 레이블이있는 올리고 뉴클레오티드는 -20 ° C에서 작은, 10 μM의 분주에 무기한 저장 될 수 있으며, 반복 동결 / 해동 사이클을 피한다.
이러한 방식으로 설계된 프라이머를 사용하여, 어떤 길이의 거의 전체 RNA에 대한 형상 데이터를 얻을 수있다. (예를 들어, "구조 카세트")하는에 프라이머 4 하이브리드 할 수 있습니다 터미널 확장하지만, 3시 인근의 순서 'RNA가 3 포함하도록 설계되지 않는 RNA의 종착역은 모양에 항상 액세스 할 수 없습니다'입니다.
모세관 전기 영동을 통해 준비 RNA
생물학적 샘플에서 RNA를가 높은 처리량 모양에 활용 될 수 있지만, 여기에 주어진 프로토콜은 시험 관내 전사에 의해 RNA에 최적화되어 있습니다. 상업 TRA이러한 MegaClear RNA 정화 열 (Ambion)와 함께 사용 MegaShortScript (Ambion)로 nscription 키트는 잘 순수한 RNA의 많은 양의를 생성하기 위해 적합합니다. RNA를 -20 ° C 및 -80 ° C. 사이의 TE 버퍼에 저장한다 최상의 결과를 위해, RNA를 모두 변성 및 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 균일 나타납니다.
1. RNA 접는
- 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 물을 18 μL로 RNA의 12 pmol의 희석 및 10X renaturation 버퍼 2 μl를 추가합니다. 잘 섞는다.
- 85 열 ° C 4 냉각 후 1 분에 대한 ° C 0.1의 속도 ° C / 초.
- 물 100 μL와 배 폴딩 버퍼 30 μl를 추가합니다.
- 접혀되는 RNA에 따라 30-60 분을 위해 37 ° C에서 알을 품다. 일반적으로, 마그네슘 2 이상, 그리고 구조의 RNA + 의존 접이식 이상 배양 시간이 필요합니다.
- 두 개의 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 각각 72 μL 나누어지는을 전송 : 개조 하ED (+) 및 제어 (-).
2. RNA의 화학적 변형
잘 특징, 전자 성 모양의 시약 isatoic 무수물 (IA), N-methylisatoic 무수물 (NMIA), 1 - 메틸 -7 - 니트로-isatoic 무수물 (1M7) 26 벤조일 시안 (BzCN) 27이 (가) 있습니다. 이 중, 가장 일반적으로 높은 처리량 SHAPE 사용은 1M7 및 NMIA이며, 후자 만이 (생명 기술) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 시약 수정의 최종 농도는, "단일 히트"수정 속도론을 얻기 솔루션에있는 대부분의 RNA를이 11 분석되는 RNA의 영역에 한 번 수정 된 상태 즉, 각 RNA에 최적화해야합니다. 이 최적 농도는 시약의 농도는 아래의 2.1 절에있는 테이블에 표시된 범위 (들)에 걸쳐 변화하는 여러 반응을 수행하여 확인할 수 있습니다. 쉽게 감지 신호를 생성 시약의 농도를 사용하는 동안 분길고 짧은 DNA 합성 제품 (예 : 그림 3) 사이의 신호 강도의 차이를 imizing.
그림 3. (A) 0 (B) 2.5 mm 또는 (C) 10 MM 1M7 치료 ~ 360 NT RNA에서 생산 SHAPE의 electropherograms. 모든 electropherograms은 같은 규모에 표시됩니다. 파란색, 녹색, 빨간색과 검은 흔적 (+) 반응 생성물 (Cy5에)에 해당 (-) 반응 생성물 (Cy5.5), 두 연속 사다리 (WellRed D2와 IRDye800)는 각각. 이미지 (B)를 생산하는 데 사용되는 RNA가 추적 (왼쪽)에 걸쳐 최소한의 신호 감퇴, 좋은 피크 해상도와 강도를 보여 1M7 최적의 금액으로 처리하고 있습니다. 길이가 이러한 조건에서 최대 읽기는. 반면, 중간 INT의 부재ensity은, (A)에서 잘 해결 피크 1M7의 하위 최적 농도를 제안한다. 반대로, (C)에서 분명 신호 붕괴는 하나의 히트 반응 속도를 나타냅니다 관찰되지 않으며, RNA는 과잉 수정됩니다. 이러한 경우, RT는 RNA 템플릿의 5 '말단가 발생할 것으로 예상되지 않습니다 특히, 길이가 차선이 될 것입니다 참조하십시오.
- SHAPE 시약 (NMIA 또는 1M7)의 10X 재고를 준비합니다. 이것은 가장하여 원하는 농도를 달성하기 위해 DMSO를 추가, 1.5 ML의의 microfuge 튜브에 시약의 작은 금액을 추가하여 얻을 수 있습니다주의 :. RNA와 혼합 될 때까지 SHAPE 시약 솔루션은 무수 있어야합니다. 매장 상온에서 데시 케이 터에서 DMSO, 주식 솔루션을 준비는 직전에 주변 수증기에 노출을 최소화하기 위해 사용합니다.
시약 최적의 10 배 농도 (DMSO)에 로 시간시약 27 완전 분해 NMIA 10-100 밀리미터 ~ 20 분 1M7 10-50 밀리미터 70 초
표 1. 전자 성 시약 RNA 수정에 사용됩니다. - . (-) 수정 (+) 및 제어가 8 μL NMIA/1M7 10X 또는 무수 DMSO를 추가, 각각 혼합 참고 : 2.5 MM은 상관없이 RNA의 분석되고, NMIA과 1M7 모두에 대한 효과적인 시작 농도 것으로 입증되었습니다.
- 50 분 (NMIA) 또는 적절한 5 분 (1M7)에 대해 37 ° C에서 알을 품다.
- 3 M NaOAc (산도 5.2), 8 μL 100 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 차가운 에탄올 1 μL 10 ㎎ / ㎖ 글리코겐의 240 μL (3 권)의 8 μl를 (0.1 권)을 추가하여 침전 RNA. 4 ℃에서 30 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리 한 후 2 시간 동안 냉장 차가운 70 % 에탄올로 두 번 펠렛을 씻으주의 :. 그것은 중요합니다이 나쁜 전기 영동시 최대 해상도에 영향을 미칠 수 있으므로, 소금의 공동 침전을 최소화하기 위해 냉각 시간 원심 분리 시간과 속도를 최소화 할 수 있습니다.
- 마이크로 피펫으로 뜨는을 제거하고 건조한 공기 펠렛 실온에서 5 분.
- 10 μL TE 버퍼에 침전 된 RNA를 용해하고 상온에서 5 분 알을 품다. 이 정도로 두 역전사 반응에 대한 RNA를 용해된다. -20 ° C.주의에서 사용되지 않는 부분을 저장 : 펠렛의 기계적 재 부상은 일반적으로 필요하지 않습니다, 그리고 RNA에 손상을 줄 수 있습니다.
3. 전사 역방향
이 단계는 간접적으로 RNA 뉴클레오티드는 SHAPE 시약에 의해 수정 된 정도를 식별하는 데 사용되는 형광 표지 된 cDNA의 제품을 생성합니다. SHAPE를 들어, 첨자 III (Invitrogen 사) RT의 성능은 다른 모든 RT를 테스트 우수했고,이 사용하기 위해 선택한 효소프로토콜입니다. 각각 반응 (-) Cy5에와 Cy5.5으로 표시 올리고 뉴클레오티드는 소수 (+)와 데 사용됩니다. 짧은 RNA를 들어, 프라이머 말단 4 '3에 대한 정보를 얻기 위해 네이티브 RNA의 터미널 확장 (예를 들어, "구조 카세트")'를 3 하이브리드 (hybrid)주의 :.이 시점에서 CE를 통해 샘플로부터 보호되어야한다 빛.
- 준비 (+)와 (-) 0.5 ML의의 microfuge 튜브 역전사에 대한 샘플입니다. (+) RT 반응에 대한 수정 RNA (+)의 5 μL, 10 μL 물과 1 μL Cy5에 - 라벨 프라이머 (10 μM)를 혼합, 대한 (-) (-) RT 반응, 5 μL 제어 RNA를 혼합 6. μL 물 1 μL Cy5에 - 라벨 프라이머 (10 μM)주의 : 사르 쉬 테드 PCR 튜브 (REF 72.735.002)가이 응용 프로그램을 권장합니다.
- 장소는 열 자전거 타는 사람에 튜브, 다음과 같은 프로그램을 적용하여 RNA와 역전사을 준비하기 위해 프라이머 어닐링 : 85 ° C, 1 분, 60 ° C, 5 분;35 ° C, 5 분, 50 ° C가 유지.
- 어닐링 단계에서 수행 할 반응의 수, 플러스 50 %의 (-) 반응, 규모 4.5 배 두 개의 (+)와 두 개의 (예 :)에 충분한 2.5X RT 믹스를 준비합니다. 4 μL 배 RT 버퍼, 1 μL 100 mM의 DTT, 1.5 ㎕의 물, 1 μL 10 MM의 dNTPs, 0.5 μL 첨자 III RT를 다음과 같이 하나의 반응은 8 μL를 필요로합니다. 얼음에 계속주의 :. 배 RT 버퍼, 100 MM의 DTT는 윗 첨자 III RT와 함께 제공됩니다.
- (-) 열처리 혼합물의 온도가 50 ° C에 도달하면, (+)와 2.5 배 RT 믹스의 8 μl를 추가 반응 권고 :. 따뜻한 RT 믹스 ° C 37-5 분 동안 반응에 추가하기 전에 .
- . 50 분 이상이 소요 RT 반응의 부화가 탈선의 cDNA 제품에 발생할 수 있습니다 : 50시 50 분 ° C, 11 ° C 및 / 또는 장소 얼음에 참고 냉각 후 알을 품다.
- 95-1 μL 4 M NaOH를하고 열을 추가하여 RNA를 가수 분해 ° C 3 분. 얼음과 다음에 차가운 반응은 2 M 염산 2 μl를 추가하여 중화주의 :.의 cDNA 제품의 나쁜 품질의 분리에서이 단계 결과의 생략.
- 결합 (+)와 (-) 반응과 3 M NaOAc 0.1 권, 100 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1 권, 차가운 에탄올 1.5 권 및 10 ㎎ / ㎖ 글리코겐 1 μL를 추가하여 cDNA를 침전. 2 시간 냉장 후, 4 ℃에서 30 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 차가운 70 % 에탄올로 두 번 펠렛을 씻으주의 :. 원심 분리 높은 속도에서 또는 펠릿 (들)을 현탁 어려움 긴 기간 결과.
- 이상 30 분 동안 격렬한 소용돌이로 교반 한 다음 10 분을 위해 65 ° C로 가열하여 탈 아미드의 40 μL에 펠렛의 cDNA를 resuspend을주의 :. 펠렛 보이지 않을 수 있습니다. 신호 또는 약한 신호 다음 전기의 부족은 적절한이 단계에서 펠렛을 해산 실패의 결과 일 수 있습니다.
연속 사다리 데이터 처리 중에 염기 위치를 결정하기위한 마커 역할을합니다. 이들은 WellRed D2 또는 D1/Lycor 800 표시 USB 사이클 시퀀싱 RNA가 연구되고 같은 순서를 가지는 세트 (# 78500), DNA, 프라이머를 사용하여 생성됩니다. 일반적으로,이 반응에 고용 DNA는 문제의 RNA에 대한 전사 템플릿으로 사용되는 것입니다. 반응 프로토콜이 여기에 제시했지만 밀접 장비 제조업체에서 권장하는, 반응이 몇 배까지 확장되는 유사합니다. DDA와 DDT는 아래에 설명 된 반응에 체인 터미네이터로 사용되는 동안, 터미네이터의 쌍은 순서 사다리를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
- DDA 종료 믹스 40 μL, DNA 템플릿의 5 pmol의, 10X Sequenase 버퍼 WellRed D2 표시 프라이머, 82 μL의 총 부피를 가지고 Sequenase과 물 4.6 μL의 10 μL의 4.6 μl를 섞는다. Sequenase 마지막으로 추가합니다. Prepa대신 DDT와 Licor IR800 표시 프라이머를 이용하여 같은 방법으로 두 번째 시퀀싱 반응을, 다시.
- USB 권장 조건을 사용하여 PCR 증폭을 진행합니다주의 :. 미네랄 오일의 추가가 필요하거나 프로토콜 / 온수 뚜껑을 활용 열 cyclers하지 않는 것이 좋습니다.
- 하나의 1.5 ML의 microfuge 튜브 (~ 164 μL 총)에 반응을 시퀀싱 DDA와 DDT를 결합합니다.
- 다음과 같이 침전 DNA : 16 μL 3 M NaOAc (산도 5.2) 16 μL 100 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 μl를 10 ㎎ / ㎖ 글리코겐, 480 ㎕의 95 % 에탄올을 추가합니다. 잘 섞는다 4 품어 ° C를 30 분간 원심 분리 30 분 동안 14,000 XG에서 4 ℃에서
- 적어도 30 분 동안 격렬한 소용돌이로 교반 한 다음 10 분을 위해 65 ° C로 가열하여 탈 아미드 100 μL에 펠렛의 cDNA를 resuspend을.
5. 모세관 전기 영동에 의한 반응 생성물의 분별
모세관 전기 영동을 동시에 할 수 있습니다하나의 샘플로 풀링 개의 반응에서 cDNA를 합성 제품의 분리. 많은 96 샘플 단일 실행 (그림 2) 중에 분별 될 수 있지만 팔 샘플을 동시에 분별 할 수 있습니다.
- 10 풀 시퀀싱 사다리 μL, 96 - 웰 샘플 플레이트로 전송과 풀 SHAPE 샘플의 40 μl를 혼합주의 :. 그것은 필수적입니다 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 시약 및 플레이트 (LPA-I 젤 등 버퍼, 미네랄 오일, 샘플을 실행 로드 솔루션 샘플 및 버퍼 플레이트) 베크 - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 CEQ 8000 유전자 분석기와 함께 사용.
- 프로그램 및 모세관 전기 영동 기기를 준비하고 제조 업체의 지시에 따라 실행 주를 시작합니다 :. 샘플 최상의 해상도를 들어, 이전에 게시 된 CAFA 메서드 매개 변수에게 28을 사용합니다.
이상적으로, 프라이머 강한 정지 피크 신호를 외부의 모든 개의 electropherogram t의 각 피크경주 선형 범위에 있어야한다 신호 드롭 오프 점진적이 허용됩니다. 그러나 때때로 큰 피크 (정지)는도 제어 반응 분명,이 이후의 데이터 처리를 방해 할 수 있습니다. 이러한 피크를 야기 절단 cDNA를 역방향 전사 (예를 들면 RNA 이차 구조) 또는 RNA 분해하는 동안 자연 장애물의 결과가 될 수 있습니다. 전자의 경우, 이러한 베타 등의 첨가물 RT의 processivity을 개선 및 / 조기 종료를 일시 중지 RT를 줄일 수 있습니다.
자료 처리
ShapeFinder 소프트웨어는 사용자가 시각화하고 변형 CE 흔적을 SHAPE 반응성 프로파일 18로 변환 할 수 있습니다. 반응 값이 표로되면, 그들은 정규화 차 구조 모델을 생성하고 수정하는 RNAStructure (V5.3)로 가져옵니다.
6. ShapeFinder 소프트웨어
BaseFinder 추적 처리 플랫폼의 확장양식 29 ShapeFinder의 게시 된 버전은 비상업적 18 자유롭게 사용할 수 있습니다. ShapeFinder에서 처리하는 데이터에 대한 자세한 지침은 소프트웨어 설명서와 함께 제공됩니다.
- Electropherograms는 그들이 (I) 형광 배경에 대해 해결하기 위해 조정 ShapeFinder,,에 CEQ에서 수입되는 (II)의 형광 강도의 형광 채널 사이의 스펙트럼 중복, (ⅲ) 이동성이 다른 태그 프라이머로 나누어 교대, (IV)의 차이 일반적인 제품은 서로 다른 형광 물질로 표지하고, (V) 신호 붕괴 역전사의 조기 종료로 인한.
- ShapeFinder에서 "정렬과 통합"도구 "설정"기능은 자동으로 각 피크에 ID를 할당하고 사용자의 입력과 두 개의 연속 사다리에 의해 정의 된 RNA 서열이 상관 관계를. 초기 할당은 일반적으로 불완전하지만 오류의 "수정"기능을 사용하여 수동으로 보정 할 수 있습니다같은 도구입니다. 반응 봉우리, 그리고 탭으로 구분 된 텍스트 파일에서 해당하는 염기 번호와 함께 이러한 반응 값을 표로 - () 마지막으로, "맞춤"기능은 정렬 된 (+) 및 아래의 영역을 계산합니다.
참고 : 데이터의 분석 SHAPE의 정확성에 대해 중요이며, 몇 가지 고려를 포함하여,이 분석에서 매우 중요하다 :
- 신호 대 잡음 : 신호 대 잡음 비율이 각각의 피크가 낮은 반응성 위치에서도 쉽게 식별 할 수 있어야 것이어야합니다. ShapeFinder는 데이터 스무딩 옵션을 제공하지만,이 대안이 왜곡 후속 분석 할 수있는 것처럼 매우 조심스럽게 사용되어야한다.
- 분석 지역 : 일반적으로 신뢰할 수있는 데이터는 배경 잡음과 구별하기 어려운 수준으로 신호 붕괴로 프라이머 3 '말단에서 제거 지역 40-80 NT에서 시작 및 종료, cDNA를 300 ~ 600 NT 긴에서 얻을 수 있습니다. 다중 사용PLE 프라이머 세트는 RNA의 긴 뻗기를 분석해야합니다. 이 경우, 그것은 프라이머 세트 사이에서 믿을 수있는 신호의 중복이 30-50 NT의 범위에있는 것이 좋습니다. 짧은 RNA를에, 역전사 효소가 자주 RNA 템플릿의 끝에 도달 한 곳,주의가 그 신호 잡음 비율 DNA 합성 강한 정지 의해 영향을받는 사람들 피크를 제외주의해야합니다.
- 신호 감쇠 : 신호 감쇠가 실험뿐만 아니라, RT의 불완전 processivity 동안 RNA 변형의 정도와 관련이 있습니다. 이상적으로, 분석 된 RNA의 영역에 상대적으로 싱글 히트 속도론의 길이를 읽을 극대화하기 위해 달성해야한다. Shapefinder 신호 붕괴을 보정 효과가있는 도구를 포함,이 분석에 오류를 소개하는 경향이 있기 때문에 - 싱글 히트 속도론을 준수하지 특히 경우 신호 감쇠를 최소화 할 때, 그것은 가장 (즉, 사용하는 경우의 분포 봉우리 하나의 히트 kine를과 일치틱). 최근 신호 신호 감쇠를 변환하기위한 개선 된 알고리즘은 30 출판되었고, 신호 감쇠가 특정 실험에서 특별한 관심의 경우 조사해야한다.
- 스케일링 신호. (-) 흔적 동일 틀림없이, 제어 프로파일은 최소한의 반응 (+)와 사이에 피크 강도가 너무 SHAPE 데이터 처리에서 가장 임의의 단계를 조정해야합니다. 너무 정도 제어 추적을 확장하면 (아래의 데이터 정규화를 참조) 첫 번째 분위에 부정적인 반응 값의 풍부가 발생합니다. 이 경우, 스케일 계수가 그에 따라 감소하고 데이터를 다시 통합해야합니다.
- 봉우리 할당. 일반적으로, 최대 할당의 자동 버전은 잘 작동합니다. 프로세스가 실패하면, 그러나, 그것은 사용자가 신호 대 잡음 비율이 낮은 특히, 모든 피크는 소프트웨어에 의해 인식되었는지 확인하는 것이 필수적이다. 어깨 봉우리 예를 들어, 항상 G 풍부한 SE에게 감지되고 있지 않습니다quences은 종종 압축됩니다.
7. 데이터 정규화
RNAStructure (V5.3) 소프트웨어에 의해 사용되는 이차 구조 알고리즘에 염기 반응 프로파일을 통합 및 / 또는 밀접하게 관련된 RNA를의 프로파일을 비교하려면 SHAPE 데이터는 표준화 된 패션 12 정규화해야합니다. 이 포함은 (i)의 모든 반응 값을 분할하여 "유효 최대"반응 (즉, 반응 값의 가장 높은 8 %의 평균 이상치 제외) 결정 이후의 계산에서 특이점, (ⅱ) 및 (ⅲ) 정상화를 제외 "효과적인 최대"다음과 같이
- 정렬과 통합 한 후 생성 된 탭으로 구분 된 텍스트 파일을 열고 Excel 스프레드 시트에 내용을 복사합니다. 이 파일의 오른쪽 열 (RX.area-BG.area)는 RNA의 각 염기에 대한 계산 된 절대 SHAPE 반응성 값을 포함합니다. 왼쪽 열은 RNA sequ이 반응을 관련레퍼런스.
- 첫 번째와 분의 분위수 (즉, 25 및 75 백분위 수)의 값 (RX.area-BG.area) "= QUARTILE (배열, 쿼트)"엑셀 함수를 사용하여 계산하고 저장
- 계산 분위 차이를 저장 "= QUARTILE (배열, 3) QUARTILE (배열, 1)"
- 수식을 "= (QUARTILE, 배열, 3) +1.5 *를 ((QUARTILE (배열, 3) QUARTILE (배열, 1))"를 사용하여 "국외자 컷오프 값을"계산하고 저장합니다. 모든 반응이 값보다 큰 값 다음 계산에서 제외 될 수 있습니다.
- 에서 반응 값 (RX.area-BG.area)를 복사하여 인접한 빈 컬럼에 붙여, 그 가장이 칼럼의 맨 위에 있도록이 값을 정렬합니다.
- 새로 만든 "정렬 된 값 열"에서 국외자 컷오프 값보다 큰 값을 삭제합니다.
- "정렬 된 값 Colu의에 남아있는 반응 값의 최대 8 %의 평균을 계산하고 저장MN ".이 값은은"유효 최대 "반응.
- "표준화 된 반응 값"을 얻기 위해 "효과적인 최대"반응성 값 (이상치 포함) 각 염기의 (RX.area-BG.area) 정렬되지 않은 나눈다. 왼쪽에 빈 열을 떠나는 빈 열에서 다음을 저장합니다. 그런 다음 테이블의 왼쪽에있는 염기 번호를 복사하고 직접 "정규화 된 반응 값 '의 왼쪽에있는 빈 열에 붙여 넣습니다.
- 복사 텍스트 편집기에 염기 위치 정규화 반응 값 쌍을 붙여 넣습니다.
- 이러한 가능성이 RT는 템플릿의 화학적 변형이 아닌 다른 이유로 cDNA를 합성하는 동안 일시 중지의 결과로, -0.09 (즉, 공간을 비워 두십시오) 아래의 값을 제거합니다. 또한, 일시 정지 강한이 수정되지 않은 템플릿 (로 "정렬과 통합"ShapeFinder 프로필의 육안 검사에 의해 결정)에서 관찰되는 세포핵에 대한 반응 값은 제외되어야한다.
- 사RNAstructure (V5.3) 소프트웨어와 구조 분석에 사용. 모양의 확장명을 가진 파일을 VE.
8. 데이터 모델링
RNAstructure (V5.3) 소프트웨어는 SHAPE 분석 19에서 파생 된 의사 자유 에너지 제약 조건을 사용하여 실험적으로 지원하는 RNA 이차 구조 (들)을 예측하는 데 사용됩니다. 소프트웨어는 가장 낮은 에너지 2D RNA 구조의 그래픽 표현뿐만 아니라 점 대괄호 표기법에서 이러한 구조의 텍스트 표현을 제공합니다. 후자는 출판 품질의 이미지를 생성하는 사용자의 설정, 예를 들어 Pseudoviewer 23 바르나 22 일의 RNA 구조 뷰어에서 가져올 수 있습니다.
참고 : RNAstructure (V5.3) 소프트웨어에 의해 생성 된 구조를 고려할 때주의를 기울여야합니다. 예를 들어, 소프트웨어는 pseudoknots와 키스 루프로 차 상호 작용을 해석 할 수 없으며, 그 여부에 부족을 구별 할 수 있습니다특정 지역의 반응성이 바인딩 단백질에 의해 basepairing 또는 입체적 보호하기 때문입니다. 최종 구조 모델을 제시 할 때 결과적으로 이러한 요소는 각각의 구조에 대해보고 된 에너지와 함께 고려되어야한다.
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Representative Results
RNA가 존재 HIV-1 회전 반응 요소 (RRE)과는 3 '말단 구조 카세트 4가 37 난방, 냉각, 및 배양 접힌 된 후, 관내 전사에 의해 선형화 된 플라스미드의 제조 하였다 ° C를 포함 MgCl 2. RNA는 NMIA에 노출 된 후 3 '말단 구조 카세트에 하이브리드 말단 표지 된 DNA 프라이머로부터 역전사. 결과 모양의 cDNA 라이브러리를 함께 제어 및 시퀀싱 반응으로, 다음 그림 4에 나와 electropherogram을 생산하기 위해 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 CEQ 8000 자동화 된 모세관 전기 영동 시스템을 사용하여 분획 하였다. 다음과 같은 네 가지 중복, 컬러 코딩 된 흔적은 모세관을 통해 반응 생성물의 네 가지 세트의 이주에 의해 생성됩니다 : 블루 (NMIA - 수정의 RNA 역전사에서 생성 Cy5에 레테르를 붙인 RT 제품), 녹색 (Cy5.5-표지 에서 RT 제품은 접혀 있지만, 그렇지 unmodifi에드 RNA를), 블랙 (DDG를 사용하여 생성 WellRed D2 - 라벨 DNA 시퀀싱 사다리)과 빨간색 (Lycor800 - 라벨 연속 사다리, DDT).
원시 CE 흔적이 처리 정렬 및 ShapeFinder 소프트웨어 18를 사용하여 통합, 분리되었다. RRE SLII 지역에 해당하는 트레이스 (들)의 영역은 그림 5에 묘사되어, 데이터가 피크 통합 직전 시점 (배경 감산을 실시 즉, 트레이스가 정렬되고, 신호 감쇠에 대한 정정을 처리 한 , 등.). (-) 반응 (각각 파란색과 녹색 흔적에서), 그리고 전자에서 후자를 뺀 각각의 염기에 대한 반응 값은 NMIA (+)와 NMIA에 해당하는 피크를 통합하여 계산됩니다. 이러한 반응 값은 RT가되는 각 뉴클레오티드가 NMIA에 의해 수정 된 정도를 반영 역전사, 동안 각 염기에서 종료되는 정도를 나타냅니다따라서 그 성향은 단일 솔루션에서 좌초 수 있습니다.
ShapeFinder에서 생성 된 HIV-1 RRE 모양 반응 프로파일은 정규화 RNAStructure (V5.3) 19에 가져 오기에 적합한 텍스트 문서로 변환되었다. 후자의 소프트웨어에서 반응 값이 있으므로 구조가 가장 낮은 자유 에너지를 가지고 예상되는 영향, 의사 에너지 제약 조건 이차 구조 예측 알고리즘에 통합되었다. 프로그램 출력 점 대괄호 표기법으로 표현이 구조를 포함하는 알고리즘뿐만 아니라 텍스트 파일에 의해 생성 된 낮은 에너지 구조를 묘사하는 두 개의 차원 RNA 이차 구조의 맵으로 구성되어 있습니다. 이러한 출력 후자는 같은 바르나 22와 같은 RNA 시각화 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다. 그림 6 SHAPE 파생 반응 프로파일을 사용하여 RNAStructure에서 생성 된 HIV RRE SLII 지역 (V5.3)의 2D 구조를 보여주고 바르나을 사용하여 시각. 색상 코드 SHAPE 반응성 값은 중첩됩니다.
그림 4. . (-) 시약 실험, 파란색과 녹색 채널 (+) 시약 및 표시 : CEQ 8000 유전자 분석 시스템 (베크)에서 볼 RNA 샘플의 대표 electropherogram이 소프트웨어는 각각의 채널이 색 선으로 표시됩니다 트레이스를 표시 그리고 검은 색과 빨간색이 순서 사다리를 나타냅니다. X 및 Y 축 각각 해결 시간 및 형광 강도를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
files/ftp_upload/50243/50243fig5.jpg "/>
그림 5. ShapeFinder 도구에게 18를 사용하여 분석을 Electropherogram. 데이터보기 창 (가운데)가 각 데이터 처리 단계에서 그래픽 피드백을 제공합니다. 도구 속성 창 (왼쪽 아래)는 스크립팅 속성에서 선택 도구의 매개 변수를 보여줍니다. 스크립트 검사기 (오른쪽 상단) 데이터에 적용되어 이러한 도구를 표시합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 두 개의 차원 RNA 구조 색깔은 바르나 시각화 애플릿 22를 사용하여 생성 SHAPE 반응성에 대한 코딩. 뉴클레오티드는 SHAPE 반응성의 정도 (들)을 나타내는 색상으로되어 있습니다. 에스펙트럼 표시, 파란색과 빨간색 동그라미는 각각 낮은 높은 반응성을 갖는 뉴클레오티드를 나타냅니다.
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Discussion
우리는 여기서 높은 처리량 SHAPE에 대한 자세한 프로토콜, 어떤 크기의 RNA를위한 단일 염기 해상도로 차 구조 결정을 할 수있는 기법을 제시한다. 또한, 이차 구조 예측 알고리즘을 실험 SHAPE 데이터를 결합하는 것은 혼자 두 방법으로 가능한 것보다 높은 정확도와 RNA 차원 모델의 생성을 촉진한다. 찬란 - 라벨 프라이머 및 자동 CE의 조합은 하나의 실험에서 긴 RNA 시퀀스의 해상도를 촉진 기존의 젤 기반의 모양에 비해 상당한 장점뿐만 아니라, 여러 실험 상당히 높은 속도와 처리량을 제공합니다. 적합한 데이터 분석 도구의이 방법과 가용성의 편의 구조적 이전에 어려운 바이러스, 손상 메신저의 분석 및 비 암호화 RNA를 위해 이상적으로 적합한 모양을 만든다. 이 흥미로운 RNA를의 2D 구조는 명확 해짐에 따라, 하이드 록실 라디칼의 사용을 통해 - 스파, 프로빙세륨 절단 방법과 분자 모델링은 복잡한 차 상호 작용을 명료하게하는 데 도움이 결국 연구진은 세 가지 차원에서 이들의 RNA 구조를 결정할 수 있도록해야한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch의 및 SFJ 르 Grice는 국립 암 연구소, 건강의 국립 연구소, 미국의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| N-methylisatoic anhydride (NMIA) | Life technologies | M25 | Dissolve in anhydrous DMSO |
| 1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7) | see ref. 22 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Life technologies | 18080044 | 10,000 units |
| Thermo sequenase cycle sequencing kit | Affymetrix | 78500 | |
| Materials provided by the user | |||
| RNA of interest | 6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument) | ||
| Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800) | Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house. | ||
| DNA template | DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template. | ||
| Buffers | |||
| 10x RNA renaturation buffer | 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA | ||
| 5X RNA folding buffer | 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor) | ||
| 2.5X RT mix | 4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1.5 μl water,1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen). | ||
| GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter) | Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles | ||
| EQUIPMENT | |||
| Capillary electrophoresis | Beckman | CEQ8000 | |
| Thermocycler | varies | ||
References
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