Summary
نحن هنا وصف الإجراءات لاستخراج وتنقية ومرنا من الأيضات
Abstract
على مدى العقد الماضي، حاولنا أن نفهم الآليات الجزيئية والخلوية الضمور الخلايا العصبية باستخدام ذبابة الفاكهة كما كائن النموذج. على الرغم من ذباب الفاكهة توفر مزايا واضحة التجريبية، وقد اعتمد البحث على أمراض الاعصاب في الغالب على الأساليب التقليدية، بما في ذلك التفاعل الجيني، علم الأنسجة، المناعي، والكيمياء الحيوية البروتين. هذه التقنيات هي الآلية الفعالة لوالدراسات فرضية يحركها، والتي تؤدي إلى فهم مفصل لدور الجينات واحد في مشاكل واضحة المعالم البيولوجية. ومع ذلك، أمراض الاعصاب هي معقدة للغاية وتؤثر على العضيات الخلوية والعمليات متعددة على مر الزمن. ظهور التكنولوجيات الجديدة وعمر omics يوفر فرصة فريدة لفهم الاضطرابات العالمية الخلوية الكامنة وراء الأمراض المعقدة. نموذج الكائنات مرنة مثل ذبابة الفاكهة مثالية لتكييف هذه التكنولوجيات الجديدة بسبب ANNOT القويوأوجه معرفة منشأ عالية. أحد التحديات مع هذه الحيوانات الصغيرة، مع ذلك، هو عملية تنقية جزيئات إعلامية كافية (DNA، مرنا والبروتين والأيض) من الأنسجة ذات أهمية كبيرة مثل أدمغة ذبابة. تحديات أخرى تتكون من جمع أعداد كبيرة من الذباب ليعيد التجريبية (الحرجة لمتانة الإحصائية) ووضع إجراءات متسقة لتنقية عالية الجودة المواد البيولوجية. هنا، نحن تصف الإجراءات لجمع الآلاف من رؤساء الطيران واستخراج النصوص والأيضات لفهم كيفية التغيرات العالمية في التعبير الجيني والتمثيل الغذائي تساهم في أمراض الاعصاب. هذه الإجراءات هي قابلة للتطوير بسهولة ويمكن تطبيقها على دراسة المساهمات البروتين وepigenomic للإصابة بالأمراض.
Introduction
في القرن الماضي، وقد ثبت أن تكون ذبابة الفاكهة أداة لا تقدر بثمن لمختبر التحقيق الأسئلة العميقة البيولوجي، وعلى الأخص في مجال التنمية، بيولوجيا الخلية وعلم الوراثة، وعلم الأعصاب 1. أسباب هذا النجاح إلى أن ذباب الفاكهة من السهل التعامل معها، لديها الأدوات الآخذة في التوسع 18، 21، 31، وامتلاك الجينوم بسيطة نسبيا مع الشرح عالية الجودة 26. وقد أدت هذه المزايا التقنية، جنبا إلى جنب مع الإبداع والابتكار المستمر داخل المجتمع الطاير، إلى إسهامات علمية واسعة، كما يتضح من منح جوائز نوبل الثلاثة (1933، 1995، 2011). وفي الآونة الأخيرة، ظهرت ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة الأمراض ذات الصلة البشرية واضطرابات النمو في المقام الأول، والحصانة الفطرية، والسرطان، وتنكس عصبي 2. نحن مهتمون بشكل خاص في الكشف عن أساس الخلوية والجزيئية لأمراض الاعصاب. شارك هذه المعقدة والمتنوعةوترتبط nditions إلى الجمعيات، oligomers القابلة للذوبان ربما، من البروتينات مطوية بشكل غير طبيعي وأنها نتيجة لذلك، على غرار بسهولة في الذباب. تم غرار جميع الأمراض العصبية الرئيسية، بما في ذلك مرض الزهايمر والشلل الرعاش، ومرض هنتنغتون، التصلب الجانبي الضموري، الترنحات عدة، tauopathies، الأمراض البريونية، والاضطرابات النادرة الأخرى، والذباب في السنوات الخمس عشرة الماضية 23. وقد أسهمت مختبرات الطيران لفهم هذه الأمراض أساسا من خلال استغلال براعة علم الوراثة ذبابة الفاكهة لتحديد جينات جديدة متورطة في السمية العصبية من بروتينات المسببة للأمراض. وبمجرد تحديد جينات جديدة ذات صلة سلسلة أعصاب، وعادة ما يتم تحليل آثارها بواسطة الأساليب التقليدية، بما في ذلك الأنسجة لأنماط التأكد من الضمور، المناعي لتحديد توزيع البروتين وعلم الأمراض الخلوية، والتحليلات الكيميائية الحيوية لتقييم كمية ونوع من البروتين التشكل غير طبيعي . وأخيرا، سلوكياتتحليل ioral بمثابة قراءات وظيفية من نتائج المرض. وقد تم استغلال هذه التقنيات راسخة لدراسة مساهمة واحدة أو عدد قليل الجينات المرشحة لعملية المرض، بما في ذلك الاكسدة وضعف الميتوكوندريا 13، التقلبات النسخي 9، 27، 30، محور عصبي الشاذة النقل والنشاط متشابك 14، RNA غير طبيعي البيولوجيا 9، أعاقت dysregulated إشارة الخلية 29، ER dyshomeostasis 6، proteostasis الخلوية 33، وغيرها الكثير 23. ومع ذلك، فإنه ليس من الواضح كيف يمكن لهذه البروتينات السامة قد تتداخل في وقت واحد مع عدة مسارات مترابطة، ما هو تسلسل الزمني لهذه التعديلات، وما هي المساهمة النسبية لكل الطريق إلى المرضية. عقود من البحث يركز على جين واحد، أدت فرضية يحركها النهج في كل من البشر والنماذج الحيوانية إلى صورة أو ناقصة الحيرة من الآليات الخلوية التي تسببتنكس عصبي. الفهم الحالي الفقراء من الآليات الدقيقة التي البروتين السامة هذه الجمعيات تسبب أمراض الأعصاب وجود قيود المفتاح لتطوير علاجات للأمراض تعديل.
نحن الآن مهتمون في تطبيق مناهج جديدة لفهم كيف يمكن لهذه البروتينات المسببة للأمراض اضطرابات الخلوية لحث العالمية. ظهور عصر omics يسمح للتحقق من المشاكل العميقة البيولوجية المعقدة باستخدام متطورة تكنولوجيا عالية الإنتاجية، والتي يمكن أن تؤدي إلى علاجات الأمراض فعالية في المستقبل القريب. وأنشئت الجينات التعبير (transcriptomics) الدراسات بعد الانتهاء من تسلسل الجينوم متعددة منذ عالية الجودة الشرح يمكن أن يتنبأ معظم النصوص. قدمت مؤخرا تطبيق الجيل المقبل من التسلسل إلى تحليل النص (RNA-يليها) المزايا والفرص الجديدة مقارنة ميكروأرس، بما في ذلك اتباع نهج غير متحيز، ومجموعة الكمي تحسنت، وخفض تكلفة 32.نحن نريد لاستغلال مزايا RNA-يليها من أجل فهم أفضل الشكل الأكثر شيوعا من ترنح ورثت يغلب، رنح مخيخي شوكي نوع 3 (SCA3) أو مرض ماتشادو يوسف. SCA3 هو أحادي الجين والمرض المهيمنة مع انتفاذ كامل، والناجمة عن التوسع وثلاثي النوكليوتيد CAG في جين Ataxin3 (ATXN3) 16. هذا التحور يؤدي إلى إنتاج بروتين Atxn3 مع المسار الطويل (polyQ) polyglutamine الذي يجعل من عرضة للالكلي. منذ متحولة Atxn3 هي الوكيل أعصاب في SCA3 مسؤولة عن جميع الأمراض الاضطرابات ذات الصلة، وهذا هو المرض مثالية لتطبيق هذه المناهج الجديدة OMIC. بالإضافة إلى ذلك، كان واحدا من الأمراض SCA3 أقرب الاعصاب على غرار الذباب في 34.
في حين وضع في مكان إجراءات جمع أعداد كبيرة من رؤساء الطيران لRNA-يليها، أدركنا أننا يمكن استخدام نفس المادة لأداء الدراسات العالمية من الجزيئات الإعلامية الأخرى. من بين أمور أخرى discip الناشئةخطوط، البروتيوميات، epigenomics، والايض تسمح دراسة علم الأمراض الخلوية على عمق لم يتحقق من قبل، وإن لم يكن يخلو من التحديات. في مقابل مرنا، وفهرس للبروتينات وغير مكتملة إلى حد ما الأيضات في هذا الوقت نظرا لصعوبة في توقع زيادة الربط كافة المتغيرات المحتملة وأصل أكثر غموضا من جميع الأيضات العادية والمسببة للأمراض. جهود كبيرة تجري حاليا لفهرسة البروتينات في العديد من الكائنات الحية وفي ظروف المرض. لهذا، أردنا التركيز على مساهمة الأيضات تغييرها لSCA3 المرضية باستخدام كائن بسيط، مثل ذبابة الفاكهة. هذا هو حقل جديد نسبيا واعدة، خاصة مع الأخذ في الآونة الأخيرة من الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، التي تنص على إمكانية استنساخ عالية ولا تدمير العينات 5، 24. نقترح أن التنميط المستقلب يمكن أن تساهم في تحديد المؤشرات الحيوية وآليات المرض المتورطين في neurodegeneratiعلى.
أحد الاعتبارات المهمة في هذه المشاريع OMIC هي أنها تتطلب كبير، وعينات موحدة (رؤساء ذبابة 200) وكذلك تقنيات تنقية دقيقة لتقليل التباين التجريبية. بدأنا في جمع الذباب وفقا للإجراءات ونحن قد استخدمت في السابق لميكروأرس وتستخدم أيضا في الآونة الأخيرة لRNA-يليها 12. ولكن سرعان ما واجهنا عددا من المشاكل المتعلقة misexpressing بنيات SCA3. أولا، كان لدينا لتحديد برنامج تشغيل Gal4 لهذه التجارب 4، حيث النسيج المستهدف للتحليل والدماغ. فإن الخيار الواضح أن تشكل دافعا لعموم العصبية منذ SCA3 هو مرض في الدماغ. ومع ذلك، لأننا تنوي جمع مرنا والأيضات من رؤساء كله، فإن هذا الخيار انتاج مواد مختلطة من الأنسجة وغير التعبير عن التعبير عن بنيات-. لتوليد عينات متجانسة حيث كل الخلايا تعبر عن بنيات، قررنا استخدام خط سائق ضعيفة ولكن في كل مكان، daughterless (دا)-Gal4. ينتيريسالوخز، فإن العديد من الجينات متورطة في أمراض الاعصاب، بما في ذلك ATXN3 20، يكون توزيع واسعة، مما يجعل اختيار التعبير في كل مكان المناسب. ثم، واجهنا مشكلة ثانيا: التعبير في كل مكان من الإمراض Atxn3-78Q تسبب الفتك خلال التنمية. لتجاوز هذا الفتك، ونحن دمج Gal80 TS للسيطرة على تفعيل الزمني للGal4 19. هذا سمح لنا لجمع الذباب التجريبية، العمر لهم لمدة تصل إلى 20 يوما، وتجميد لهم، ومعالجة رؤوسهم مجفف بالتجميد من أجل إما RNA (TRIzol) أو المستقلب (الميثانول كلوروفورم) استخراج (الشكل 1). وقد استخدمنا بالفعل هذا البروتوكول للحصول على عينات لإجراء تحاليل وtranscriptomic metabolomic، ولكن هناك تطبيقات أخرى لواضحة هذه التقنية (مثل البروتين أو تحليلات للأعصاب peptidomic).
التجريبية لمحة عامة: والهدف العام من هذه البروتوكولات هو دعم جمع و consiالدعامة عينات من رؤساء الطيران لاستخراج النصوص والأيضات. الهدف من هذه الإجراءات المحددة هو الحصول على الذباب معربا عن Atxn3-27Q 78Q وAtxn3-(بنيات تجريبية غير المسببة للأمراض المسببة للأمراض و) وكذلك LacZ (مراقبة بناء)، حيث عينة واحدة تتكون من رؤساء الطيران 200. على الرغم من أن التكنولوجيا الحالية تسمح للتحليل عينات صغيرة جدا، بما في ذلك الخلايا واحدة 28، جمعنا 200 رأس للقضاء على التباين التجريبية والبيولوجية، والتقنية، مما يسمح لنا للتعرف على التغيرات الخلوية المرتبطة بعملية المرض بثقة عالية الإحصائية. تم تصميم هذا النهج للكشف عن تلك التغييرات فقط في التعبير الجيني التي تتفق في عدد السكان، وتوجيه لنا نحو مسارات أهم القيادة الضمور. منذ ونحن مهتمون في سن التغييرات في التي تعتمد على رؤساء هذه الذباب، تم الحصول على كل الوراثي بنسبة 10، 1، و 20 يوما من العمر.
ومن الجوانب الأساسية لهذهالتحليلات العالمية هو إنتاج البيولوجي والداعمة ليعيد تحليل دقيق الإحصائية. تجربتنا السابقة مع ميكروأرس وRNA-يشير إلى أن يليها تحليل العينات البيولوجية في ثلاث نسخ توفير دلالة إحصائية قوية من البيانات 11 و 12. وصفنا في القسم 1) كيفية إنشاء تكرار واحد البيولوجية (REP 1) لكل نقطة التركيب الوراثي والوقت. ويمكن تكرار هذه الإجراءات لتوليد مندوبي 2 و 3، أو القيام به في موازاة ذلك، طالما يتم التعرف بشكل صحيح كل معدل تقييم المستوى. رغم مضي ثلاثة مندوبي هو الهدف، ووضع ينصح بشدة الرابعة (أو ربما الخامسة) معدل تقييم لتغطية القضايا المتعلقة العائد المنخفض، وفقدان الذباب أثناء الشيخوخة، أو فقدانها من المواد (الذباب، ورؤساء، أو RNA) في واحد أو أكثر العينات.
وجدنا أن عشرة الصلبان (زجاجات التي حددتها رسائل AJ) تنتج ذرية بما فيه الكفاية للحصول على 200 رأس / راثى الوقت / نقطة. يجب أن تطبق بعناية فائقة لتجنب الارتباك، ومنذ أعداد كبيرة من زجاجات علىالمطلوب لإعادة الحصول على واحد معدل تقييم (10 × 3 زجاجات الأنماط الجينية X الوقت 3 نقاط = 90 زجاجات). لهذا، فإننا المعينة كل زجاجة باستخدام النمط الجيني، وأشر الوقت، والرسالة زجاجة. على سبيل المثال، SCA3-20E 27Q يشير إلى زجاجة الخامسة (عشرة) من الذباب معربا عن Atxn3-27Q الذين تتراوح أعمارهم بين لمدة 20 يوما. مرة واحدة في eclose ذرية، يتم الاحتفاظ الذباب في قنينات منفصلة المسمى مع المعرف الفريد.
حافظنا على الأرقام التي تم الحصول عليها من الذباب لكل عينة، وزجاجة، وجمع نقطة (الصباح والمساء) في جدول بيانات Excel. نحن تنقيح عدد من الذباب في القارورة قبل أن تأخذ في تجميد الحساب والفتك الهاربين. من تلك التهم النهائية، يمكن إضافة 200 قارورة الذباب يقع بسهولة قبل فتح الثلاجة، مما يسهم في الحفاظ على العينات. منذ لا يمكن إلا أن الذباب التي تم جمعها من زجاجة واحدة يمكن استخدامها في واحدة معدل تقييم، ونحن تعظيم مساهمتها في تكرار البيولوجية، على الرغم من جميع مندوبي الواردة من الذباب زجاجات متعددة. ونحن محفوظةالذباب من زجاجات لا تستخدم في موعدها المقرر لمعدل تقييم مندوبي الأخرى، واستبدال عينات، أو لإجراء التجارب الأخرى ذات الصلة (لطخة ويسترن، qPCR).
Protocol
1. توليد تكرار وتجميد الذباب (تنبيه والنيتروجين السائل)
الأهداف: جمع لا يقل عن 200 أنثى لكل الوراثي الوقت / نقطة، وفلاش التجميد.
- المورثات: Gal80 TS؛ DA-Gal4، سلالة من كل مكان للتعبير Gal4 تحت سيطرة المنطقة التنظيمية daughterless وحساسة للحرارة Gal80. كخط السيطرة، كنا UAS-LacZ، التي سبق أن أظهرت للحث على أي آثار ضارة. UAS-27Q-Atxn3 وUAS-78Q-Atxn3، غير المسببة للأمراض المسببة للأمراض ويبني التجريبية، على التوالي. (وقد استخدم، HS-Y اختبأ قبل البناء لمجموعة من الإناث أكثر كفاءة عذراء، ولكن قررنا ضدها بسبب الوقت الإضافي اللازم لإدخال Y، HS-TS اختبأ مع Gal80؛ دا Gal4 على الكروموسومات وII III).
- توسيع كافة الأسهم من خلال الجمع بين الإناث والذكور 10 5 في زجاجةق لمنع الازدحام. أجريت جميع التجارب في وسائل الإعلام ميكس جاز الطيران، والتي من السهل أن تعد ويعزز النمو وذبابة الفاكهة بسرعة منخفضة الإصابة مع العث.
- جمع 50 Gal80 TS؛ الذكور DA-Gal4، و 100 UAS-78Q-Atxn3 العذارى (فقط سيتم استخدام واحد UAS خط كمثال) لكل نقطة زمنية.
- إجراء عشر الصلبان في التركيب الوراثي الوقت / نقطة. تخدير الذكور والإناث على ثاني أكسيد الكربون (CO 2) نائمة / وسادة. 10 مكان UAS-78Q-Atxn3 عذراء الذباب (لا يزيد عمرها عن خمسة أيام) وخمسة ذكر Gal80 TS؛ DA-Gal4 في كل زجاجة كبيرة مع معجون ارتفعت الخميرة (خميرة جافة ميهت). تسمية زجاجات مع الأنماط الجينية، ونقاط الوقت، وزجاجة معرفات (رسائل AJ)، ووضعها في C. ° 25
- بعد 2 أيام، امسح البالغين من الزجاجات، إضافة الخميرة الجافة من رش وبخ الماء لتشجيع نمو اليرقات الأمثل، ووضع زجاجات في 18 ° C (Gal80 نشطة،المكبوت Gal4). لا تنسخ الصلبان، لأن هذا قد يعرض تقلب التجريبية في ذرية المستمدة من الإناث الملقحة مقابل عذراء. أيضا، على سلالة من كل زجاجة يمثل البيولوجية مستقلة مكررات (كل زجاجة تنتج ذرية فريدة من نوعها)، ولكن الصلبان نقل (نسخ) سيكون التقنية مكررات (ذرية إضافية مع الدستور الوراثية نفسها).
- عندما ذرية ecloses في 18 ° C، تخدير على النائم 2 CO / وسادة، جمع العذارى من التراكيب الوراثية المرغوبة، ووضعها في قارورة صغيرة مع (11:58 الذباب في القارورة). قارورة التسمية مع المعرف زجاجة. لا تجمع الذباب من زجاجات مختلفة. ضع قارورة إلى الوراء في C ° 18 لمدة 24 ساعة. لتعظيم ذرية، يواصل جمع صباح والمساء على التوالي.
- عندما يكمل كل قارورة 24 ساعة في C ° 18، تحول لهم 29 ° C (Gal80 غير نشط، Gal4 النشط). هذا هو يوم 0، نقطة البداية للتجربة، عندما رانه جينات منقولة بدء تعبيره.
- نقل الذباب لتنظيف قنينات كل يوم 2 حتى تصل إلى أيام 10 و 20.
- عندما تصل إلى سن الذباب المطلوب (1، 10، 20 يوم)، عد ونقلها من قوارير الطعام إلى ما قبل صفت cryovials باستخدام القمع الصغيرة. لا تخدير الذباب. عكس القوارير على مقاعد البدلاء.
- انتظر 30 دقيقة للسماح للذباب للتعافي من نقل (الإجهاد)، ثم فلاش تجميد قوارير عن طريق الغمر في النيتروجين السائل وتخزينها في مرحلة ما قبل المسمى، مربع الفريزر قبل المبردة تذكر:. تجميد الذباب في نفس الترتيب نقلوا إلى cryovial، مما يجعل الوقت الذي يقضيه في cryovial موحدة عبر العينات.
2. جمع وتجفيد لرؤساء فلاي (تنفيذ في غرفة باردة، قبل البرد معدات جميع، تنبيه، النتروجين السائل والثلج الجاف)
الهدف: فصل سريعة، وجمع، وتجميد تجفيف الأنسجة.
- عاصمبلي من منخل (أكبر شبكة في مجلس الشيوخ لجمع الجثث، ثاني أكبر سوق في مجلس النواب لجمع رؤوس، غطاء على الجزء السفلي لجمع أجزاء صغيرة) وقبل البرد في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- جمع 200 من الذباب cryovials من خلال تعظيم مساهمة الذباب نشأت من الزجاجة نفسها. للتعويض عن الاختلافات بين الذباب جمعت في الصباح أو في المساء، تأكد من أن كل عينة يستخدم متطابقة صباح / مساء نسبة (47٪ كنا صباح / مساء 53٪) ملاحظة: يمكن الجمع بين RNA الناتجة من عينات 100-2 الرأس في وقت لاحق لتوليد ما يعادل 200 الذباب في تكرار واحد.
- البرد قطعة من parafilm (~ 9 × 14 سم) على الثلج الجاف لمدة 5 دقائق.
- إفراغ cryovials مع الذباب كاملة على وparafilm، وعدد قليل في كل مرة؛ العد الذباب باستخدام فرشاة الرسام، وتخزينها في آخر cryovial على الثلج الجاف حتى تصل إلى 100 الذباب.
- تراجع غربال في النيتروجين السائل؛ إضافة الذباب 100 إلى chamb العلياإيه. يهز بقوة من أجل غربال 1 دقيقة. تراجع ذلك في النيتروجين السائل مرة أخرى، ويهز لمدة 1 دقيقة.
- فتح غربال، وجمع رؤساء من مجلس النواب في microtube، ومكان في -80 ° C.
- فتح microtubes، والتفاف قمم في parafilm، وجعل ثقوب صغيرة.
- وضع العينات في مجفاد مدة لا تقل عن 2 يوما.
3. مجموع تنقية استخراج مرنا والحمض النووي الريبي (علاج جميع الأسطح مع RNaseZap؛ قفازات كثيرا ما تتغير)
الهدف: تحقيق التجانس الأنسجة لتعظيم العائد، واستخراج الحمض النووي الريبي مجموع، وتنقية مرنا.
- إزالة عينات من مجفف للتجمد وإضافة ثلاثة، معقمة صغيرة، والصلب طحن كرات لكل microtube. في مكان جينو / مطحنة؛ تشغيلها في 1500 السكتات الدماغية / دقيقة لمدة 1 دقيقة.
- فتح الأنابيب، إضافة 1 مل TRIzol، وختم الأنابيب مع parafilm. طحن 1 دقيقة؛ الاستفادة من أنابيب رأسا على عقب لإزاحة كرات الصلب إذا لزم الأمر. طحن 1 دقيقة.
- لاأجهزة الطرد المركزي في أنبوب في هذه المرحلة (الأنبوب سيكون هش). نقل الخليط (باستثناء كرات الصلب) إلى microtube ريبونوكلياز جديدة خالية. بيليه الانقاض الخلوية في ميكروسنتريفوج الطاولة في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في ز X 12،000.
- نقل طاف إلى microtube جديدة. أضف 0.1 حجم 1-برومو chloropropane-3 (BCP)؛ يهز بقوة لمدة 15 ثانية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. تدور في ميكروسنتريفوج في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في 12000 ملاحظة ز س: العديد من البروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي استخدام الكلوروفورم في هذه المرحلة؛ ويهدف إلى تعظيم BCP العائد RNA من خلال زيادة كفاءة فصل المرحلة. والحفاظ على العينات عند C O 4 خلال خطوة الطرد المركزي أيضا زيادة كفاءة فصل المرحلة والحد من التلوث من البروتين والحمض النووي الجيني في المرحلة المائية.
- نقل الطبقة العليا المائية إلى microtube جديدة. ترسيب الحمض النووي الريبي من إضافة 0.5 حجم الجليد الباردة الأيزوبروبانول؛ عكس ست مرات لميلس. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تدور في ميكروسنتريفوج في 4 لمدة 10 دقيقة في درجة مئوية 12000 X ز.
ملاحظة: بالإضافة إلى استعادة RNA، ويمكن أيضا أن البروتينات المستخرجة من الطبقة العضوية والطور البيني من TRIzol، لذلك لا يمكن أن يؤديها كل من البروتيوميات والتحليلات على العينات transcriptomics نفسه. على الرغم من أننا لم تنفيذ هذه الخطوة في تحليلاتنا، واستخراج TRIzol تعطي تمثيل ممتاز للبروتينات قابلة للذوبان وزيادة تمثيل الغشاء النووي والبروتينات من الاستخراج معظم العازلة / المنظفات. ولي لو 17 وصف الإجراء لاستخراج البروتينات باستخدام TRIzol المناسبة لتحاليل البروتيوميات، بما في ذلك 2 D-جل وLC-MS/MS.
- إزالة طاف. غسل RNA بإضافة 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 70٪ (استخدام DEPC المعالجة المائية)، وتخلط مع دوامة قصيرة. تدور في ميكروسنتريفوج ب 4 ل 5 دقائق في ز X C ° 12000.
- إزالة طاف. الهواء الجاف في لبيليهر الأقل 15 دقيقة. إضافة 80 ميكرولتر من المياه DEPC إلى بيليه RNA ووضعه عند درجة حرارة 55 مئوية لمدة 10 دقيقة. ترك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام الطيف NanoDrop. ينبغي أن نسبة امتصاص نانومتر في nm/280 260 يكون بين 1.8 و 2.1، مع 2.1 يجري الأمثل.
- يستغرق 30 ميكروغرام RNA السائبة، إضافة الدناز I 4 U، 60 U RNasin، 10 ميكرولتر العازلة 10X رد فعل، والمياه المعالجة DEPC لتبرزي حجم إجمالي يصل إلى 100 ميكرولتر. احتضان في C ° 37 لمدة 20 دقيقة.
- تنقية RNA استخدام عدة RNeasy البسيطة. اتبع إرشادات الشركة المصنعة، باستثناء أداء جميع centrifugations لمدة 30 ثانية وتشمل جميع "اختياري" الخطوات.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام NanoDrop، وتقييم نوعية RNA باستخدام "بيكو الحمض النووي الريبي مجموع" الفحص على BioAnalyzer.
- لتنقية مرنا، ونقل 30 ميكرولتر Dynabeads إلى أنبوب microfuge ريبونوكلياز خالية.
- وضع أنبوب على المغناطيس لمدة 1-2 دقيقة وإزالة طاف. إعادة تعليق الخرز في15 ميكرولتر من العازلة ملزمة. تكرار.
- بدءا من 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، ضبط مستوى الصوت إلى 15 ميكرولتر باستخدام DEPC المياه. الحرارة 65 درجة مئوية في مدة 2 دقيقة، ومكان على الجليد.
- إضافة 15 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع الخرز إلى 15 قبل غسلها ميكرولتر. مزيج دقيق من قبل pipetting كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ليصلب RNA إلى الخرز. مكان على المغناطيس لمدة 1-2 دقيقة وإزالة كافة طاف.
- إضافة 35 ميكرولتر من العازلة غسل B. ميكس عن طريق pipetting حذرا. وضع المغناطيس على وإزالة بعناية طاف. تكرار غسل مرتين.
- أزل مرنا باضافة 15 ميكرولتر 10 ملي الباردة تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) والتدفئة إلى C ° 80 ل2 دقيقة. وضع أنبوب على الفور على المغناطيس، نقل إلى أنبوب طاف ريبونوكلياز خالية، وتجميد -80 ° C. في كما هو الحال في قياس 3.8). يجب أن يكون العائد ~ 1-5٪ من مجموع RNA.
لتحاليل metabolomic، نفذ البروتوكولات 1 و 2)، والمضي قدما 4) أدناه:
4. الميثانول كلوروفورم اضافيةction الأيضات
الهدف: فصل الأيضات القطبية وغير القطبية.
- إضافة مضادات الأكسدة الأنيسول hydroxytoluene (BHT) إلى الكلوروفورم بتركيز 0.1 ملغم / مل لمنع السيارات أكسدة الدهون أثناء الاستخراج. استخدام هذا BHT كلوروفورم لجميع الخطوات اللاحقة.
- بتحويل 200 إلى رؤساء المبردة، قبل زنه المخروطية أنابيب البولي بروبلين المسمار كأب، وتجميد -80 درجة مئوية في ويجفد. تحديد الوزن الجاف.
- وضع الخرز زركونيا 5-7 في الأنابيب والتجانس في حبة الخافق لمدة 20 ثانية من دورات كل في 800 هرتز.
- على أساس الوزن الجاف من أعنف عينة، إضافة الماء، والميثانول، وكلوروفورم في النسب التالية: 11،74 X الميثانول؛ 10،59 X المياه؛ 11،74 X كلوروفورم، حيث x هو وزن أثقل العينة في غرام والمنتج هو وحدة التخزين في مل. إضافة كافة الميثانول وفقا لحسابات و45٪ من إجمالي المياه إلى أنبوب الخافق حبة تحتوي على رؤساء مجفف بالتجميد.
- Homogeniزي في الخافق، حبة لمدة أكثر من 20 ثانية دورات لكل منهما.
- الجمع بين وحدات التخزين من كلوروفورم (100٪) والباقي من المياه (55٪) في قارورة زجاجية مخروطية على الجليد. ثم، نقل الخليط الأنسجة (مع الخرز) إلى قارورة زجاجية. يهز لمدة 10 دقيقة. احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
- تدور في جهاز للطرد المركزي في 4 لمدة 5 دقائق في ز X C ° 2000. إزالة القطبية (العليا) المرحلة مع ماصة باستور (تجنب البلاستيك) ومكان في أنبوب microcentrifuge الثاني.
- حفظ غير القطبية (أقل) المرحلة في قارورة زجاجية صغيرة وتجميد في -80 ° C. تجف تحت تيار من غاز النيتروجين، تأكد من أن أنابيب يمتد من خزان النتروجين هو Tygon عالية النقاء لتجنب المواد البلاستيكية في استخراج.
- ترطيب المرحلة غير القطبية مع كلوروفورم 620 ميكرولتر بالديوتيريوم. نقل 600 ميكرولتر في أنابيب NMR المسمى. متجر في انفجار واقية من -80 ° C الفريزر.
- وضع المرحلة القطبية في Centrivap وتشغيل الأنبوب حتى يجف تماما في 30 ° C (~ 7 ساعات).
- REHydrate المرحلة القطبية ميكرولتر العازلة مع 620 0.1 M فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.3) في أكسيد الديوتيريوم مع 1 ملم اجتماع الدول الأطراف الثالث [3 - (trimethylsilyl) حمض البروبيونيك D4-،2،3،3-2] كمعيار داخلي. دوامة لمدة 30 ثانية. تدور في ميكروسنتريفوج ب 4 ل 5 دقائق في 10،000 دورة في الدقيقة لأصباغ راسب والجزيئات الكبيرة الأخرى، التي من شأنها أن تتداخل مع أطياف NMR C °. نقل 600 ميكرولتر من طاف لأنابيب NMR المسمى.
Representative Results
لتجاوز الفتك الناجم عن التعبير في كل مكان من Atxn3 موسعة تحت سيطرة DA-Gal4، قدمنا التنظيم الزمني للGal4 مع Gal80 TS. ولكن قبل الشروع في جمع وتجميد أعداد كبيرة من الذباب، أردنا أن تحديد ديناميات التعبير عن التحوير لدينا تحت سيطرة TS Gal80 ودا Gal4. للقيام بذلك، ولدت لدينا الصلبان، وترك ذرية في C ° 18، جمع الذباب الكبار، والحفاظ عليها لمدة 24 ساعة في 18 ° C. ثم، وضعنا الذباب في درجة الحرارة التقييدية (29 ° C) وحضنت لهم لمدة 6، 0، 12، 24، 36، 48، والموارد البشرية 72. المقبل، اكتشفنا تراكم الأليل polyQ موسعة من طخة غربية من الذباب واحد بعد نشر البروتوكولات 10. تم اكتشافه لأول مرة التعبير، ولكن خافت 6 ساعة بعد تحول درجات الحرارة واستمرت في الزيادة حتى 48 ساعة، عندما وصلت إلى مستويات التشبع (الشكل 2A). ينتيريسالوخز، ظهرت الفرقة عالية الوزن الجزيئي للpolyQ غير قابلة للذوبان بعد 48 ساعة، مما يشير الى الوقت الذي يستغرقه للبروتين لتشكيل المجاميع الكبيرة. نحن تشريح أدمغة ذبابة أيضا في كل نقطة من الوقت لتحديد توزيع أليل polyQ الموسع من قبل المناعي (الشكل 2B). تم الكشف لأول مرة بعد 24 ساعة البروتين التحول درجة الحرارة، وعلى الرغم من أن التوزيع غير المتكافئ مع. بين 24 و 48 ساعة واصلت مستويات البروتين في الارتفاع، مما يجعل الدماغ العديد من المراكز واضحة للعيان، بما في ذلك فصوص antennal والتوقعات الجسم الفطر (الشكل 2B). بين 48 و 72 ساعة وصلت إلى التعبير عن أليل polyQ الموسع مستويات القصوى، مما يوحي بأن تم تفعيل النظام بشكل كامل Gal4 في هذا الوقت. بناء على هذه النتائج، اخترنا 24 ساعة بعد التحول درجة الحرارة ونقطة أول مرة (اليوم 1) لتجارب لاحقة. كما تم قياس مجموعات من الذباب 10 و 20 يوما من العمر بدءا من درجة حرارة التحول (منظمة الشفافية الدوليةلي 0)، وهو الوقت الذي يبدأ التجربة مع تعبير جديد من الجينات المحورة المسببة للأمراض ومكافحتها.
تساءلنا مرة واحدة علينا التحقق من أن تم الكشف عن Atxn3 بعد 24 ساعة تحت سيطرة TS Gal80 ودا Gal4-في 29 ° C، ما إذا كانت هذه الذباب وتظهر علامات تنكس عصبي أكثر من 20 يوما. منذ بدء هذه الذباب التعبير عن البروتينات المسببة للأمراض مثل البالغين، ويخشى أنهم قد كنا في حاجة الى فترة حضانة طويلة لإظهار الظواهر الاعصاب. لتحديد سمية 78Q-Atxn3 في هذه الظروف، معربا عن الذباب جمعنا LacZ، Atxn3-27Q، 78Q وAtxn3، وسجلت طول العمر. بينما معربا عن الذباب وLacZ Atxn3-27Q عرض أكثر قابلية 90٪ بعد 20 يوما، معربا عن الذباب أظهرت Atxn3-78Q بقاء منخفضة في يوم 20 (30٪) (الشكل 3). في الواقع، Atxn3-78Q الذباب راح تموت بعد يوم 10 (7٪ معدل وفيات) ويوم 15 الخسارة كانت كبيرة (20٪)، والتي تسارعت في د الخمس الماضيةAYS. وهكذا، أشارت هذه النتائج إلى أن التعبير الكبار من الجين المسببة للأمراض أدت إلى تقصير عمر، علامة رئيسية من الظواهر العصبية الناجمة عن 78Q-Atxn3.
كان واحدا من أهم جوانب هذا البروتوكول ومعالجة حافظة للعينات بعد تجميد لضمان نوعية المواد المستخرجة. استخراج نحن بين 15-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع رؤوس لكل 200 (اعتمادا على العمر وراثى) قبل العلاج وفقا لالدناز NanoDrop. تم انتشال ما يقرب من الثلث (6-25 ميكروغرام) ونقية للغاية RNA بعد العلاج الدناز من نسبة امتصاص نانومتر في nm/280 260. ومع ذلك، وجدنا أن أفضل طريقة لتحديد نوعية RNA لإعداد مكتبات [كدنا] تسلسل الرنا لكان لتحليل الحمض النووي الريبي مجموع على BioAnalyzer. لحسن الحظ، كان يستخدم سوى كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي (5 نانوغرام) على BioAnalyzer، لذلك لم يؤثر على القدرة على إنتاج العديد من المكتبات في العينة. وكمثال على ذلك، ركضنا عينتين من الكلRNA قبل العلاج الدناز على شريحة BioAnalyzer، واحدة من يشتبه بأنهم المتدهورة (الشكل 4A-C). أنتجت عالية الجودة RNA (نموذج 1) ثلاثة نطاقات حادة RNA، وهما فقط تحت 2000 النيوكليوتيدات (NT) في حجم أصغر وأقل من 200 فرقة NT، تمثل الرناوات الريباسي (الشكل 4A). وشريطين حوالي 2،000 NT تتوافق مع الرنا الريباسي 18S (أصغر الذروة) واثنين من شظايا الرنا الريباسي 28S (أكبر الذروة)، وهو الجانب الفريد من الأحياء الرنا الريباسي في ذبابة الفاكهة (انظر الشكل 4B). كما لوحظ في هذه الصفات آثار BioAnalyzer (الشكل 4B). في المقابل، لم عينة الحمض النووي الريبي المتدهورة (عينة 2) لا تنتج قمم حادة من الرناوات الريباسي، وتراكمت نطاقات متعددة من أقل من 500 NT (الشكل 4A). وقد تميز هذا التوزيع بسهولة في حجم آثار BioAnalyzer (الشكل 4C)، التي لوحظت في القمم واسعة من أقصر الحجم. المهم أيضا أن نلاحظ ثكما أن الاختلاف في وحدات محور y بين عينات الحمض النووي الريبي اثنين، مما يدل على أن العينة كان أقل RNA المتدهورة. (RNA) فقط عرض أقصى قدر من الجودة (نسبة NanoDrop من الامتصاصية في 260 نانومتر nm/280 بين 1.8 و 2.1، مع 2.1 يجري الأمثل، راجع الخطوة بروتوكول 3.8) وسوف تستخدم لتوليد المكتبات.
لاستخراج الأيضات، تابعنا من الماء الكلاسيكية / الميثانول / كلوروفورم (2.0:2.0:1.8) استخراج الانقسام الداخلي 3 إلى خطوتين لتحقيق أقصى قدر من استخراج كل الأيضات القطبية وغير القطبية-35. بعد فصل المراحل القطبية وغير القطبية، أعادت نحن في الماء أو بالديوتيريوم بالديوتيريوم كلوروفورم، على التوالي، وأضاف المعايير الداخلية لتحليلها من قبل NMR. حصلت NMR أطياف باستخدام تم حل هذه الطريقة بشكل جيد مع خطوط الأساس استخراج شقة وخطوط ضيقة (الشكل 5)، مما يدل على تنقية عالية الجودة مقتطفات، ومناسبة لكلا من التنميط التمثيل الغذائيد تحديد أعداد كبيرة من مستقلبات. ويبين الشكل 5 تحديد قمم بارزة قليلة الموافق الأيضات وفيرة للغاية، مثل الجلوكوز والسكروز، واثنين من الأحماض الأيضية الرئيسية، وخلات اللاكتات، وفقا للتحولات الكيميائية في الأدب 7. التحول الكيميائي (في أجزاء لكل مليون) يمثل الكهرومغناطيسية التدريع من جزيء جزيء نسبة إلى معيار (TMS، الذروة الأولى من اليمين). أكثر shieldedmolecules لها كثافة أعلى الإلكترون حول النواة، وسوف تظهر على يمين الطيف، بما في ذلك ألكيلات. سوف جزيئات Deshielded مثل الهيدروجين العطرية أميد وتظهر إلى اليسار من الطيف. غير المخصب الجزء الأوسط مشغول (جزء في المليون 3-4) لجزيئات السكر.
ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. حركية التعبير (A) لطخة غربية تظهر Atxn3-78Q التعبير (TS Gal80؛ DA-Gal4 / UAS-78Q-Atxn3). الذباب في المحتضنة في 29 ° C 0 حتي 72 ساعة. تم الكشف أولا الفرقة خافت في 6 ساعة ويتم التوصل إلى التشبع من 48 ساعة بعد الاستقراء. (B) من العقول المناعي كله في نفس الذباب. تم تشريح أدمغة، ثابتة، وهيد ملطخة مع الأجسام المضادة التي تعترف البروتين polyQ الموسعة. تم الكشف لأول مرة البروتين في التوقعات الفطر (MB) الجسم والفص antennal (AL). بين 48 و ساعة 72، والتعبير تصل إلى المستويات القصوى واضح للغاية في مراكز المخ مع تعصيب وفيرة. مستوى التعبير في الخلايا العصبية ضعيفة كما رأينا في الفص البصري (OL)، إلا في عدد قليل من كبار الخلايا العصبية بين المخ وOL المركزية. 
الشكل 3. Atxn3-78Q يقلل عمر الذباب معربا عن LacZ، Atxn3-27Q، 78Q-Atxn3 وبتواجد مطلق في مراحل الكبار (TS Gal80؛ DA-Gal4). تم رصدها لطول العمر الخاصة بهم في C. ° 29 معربا عن الذباب LacZ (الأزرق) وAtxn3-27Q (الأخضر) أظهرت انخفاض مستويات وفيات بعد يوم 20. في المقابل، معربا عن الذباب Atxn3-78Q (أحمر) عرض وفيات وضوحا اليوم ابتداء من الساعة 10. من اليوم 15 أظهروا انخفاضا بنسبة 20٪ في قدرتها على البقاء، التي تسارعت خلال الأيام الخمسة المقبلة، لتصل إلى 70٪ وفيات بعد يوم 20. 
الشكل 4. تم تشغيل RNA تقييم الجودة. RNA من جودة عالية وعينات المتدهورة على شريحة BioAnalyzer. (A) BioAnalyzer تشغيل مع RNA ذات جودة عالية (عينة 1) والحمض النووي الريبي المتدهورة (عينة 2) بجوار علامة حجم (حارة اليسار). لاحظ ثلاث قمم حادة الموافق RNA الريباسي في حارة المركزية. (B) BioAnalyzer تتبع لعينة 1، مع وجود قمم مميزة العتيدين أسفل NT 2000 وآخر أقل من 200. (C) BioAnalyzer تتبع العينة 2، الذي يتكون من الحمض النووي الريبي المتدهورة في الغالب. لاحظ الفرق في وحدات على محور Y بين فريقي B و C. 
الشكل 5. ممثل أطياف NMR 1D الأيضات القطبية. الممثل NMR الطيف بروتون 1D الأيضات القطبية من ذبابة الفاكهة ومتكاملة 2D COSY (الارتباط الطيفي) وHSQC (heteronuclear علاقة الكم واحد) لتخصيص التجارب الذروة. حددت وفقا لنواتج الأيض الكيميائية المعروفة التحولات-1: السكروز، 2: الجلوكوز، 3: بيتا ألانين؛ 4: خلات؛ 5: اللاكتات.
Discussion
بناء على خبرتنا السابقة في transcriptomics 11 و 12، والتمثيل الغذائي 15، وأمراض الاعصاب 6، 8، نقدم هنا بروتوكول جديد لجمع الآلاف من رؤساء الطاير مع الكبار محددة من الجينات المسببة للأمراض التعبير، وتنقية مرنا والأيضات لRNA- ويليها التحليل الطيفي NMR، على التوالي. يطلب من طبيعة هذه التجارب إدماج العديد من الابتكارات قبل مجموعة الطاير، بما في ذلك اختيار خط Gal4 في كل مكان، واستخدام التنظيم الزمني في التعبير الجيني. فيما يتعلق Gal4 والتعبير في كل مكان من الجينات المحورة أمر حاسم لسببين. أولا، عدد كبير من الجينات المسؤولة عن أمراض الاعصاب، بما في ذلك ATXN3، Huntingtin، اميلويد السلائف البروتين، والفائق 1، من بين أمور أخرى، وأعرب على نطاق واسع في الخلايا العصبية والدبقية وكذلك في أنواع الخلايا الأخرى خارج الجهاز العصبي. أردنا أننموذج صحيح هذا الجانب من علم الأحياء من هذه الجينات المسببة للأمراض من خلال تحليل النتائج المترتبة على التعبير في كل مكان بدلا من التركيز فقط على التعبير العصبية. الثاني، فإنه ليس من الممكن جمع العقول ذبابة بأعداد كبيرة، ولكن يمكننا أن نفعل ذلك مع رؤساء الطيران (أكثر من 200 حالة في ثلاث نسخ لكل) 11، 12. منذ تجانس رؤساء كله يخلط الأنسجة العصبية وغير العصبية، في كل مكان التعبير التحوير تصبح حرجة للحصول على الحمض النووي الريبي موحدة والأيضات من السكان من الخلايا معربا عن الجينات المحورة نفسه. من المهم أن نلاحظ أن تم اختيار DA-Gal4 لتوزيعه حتى إلى حد ما، ليس بسبب مستواه التعبير عالية، على الرغم من تقرير صدر مؤخرا إلى أن DA-Gal4 قد لا تكون في كل مكان تماما 25. كنا قد تعتبر في السابق في كل مكان أخرى Gal4 خطوط، بما في ذلك ذراع، حوض استحمام، وقانون-Ga4، لكنها أظهرت جميع أنماط التعبير معقدة في الجهاز العصبي المركزي والعضلات الكبار، مما يجعلها أقل منdequate لهذه الدراسة. في الواقع، أظهرت أدمغة البالغين في المناعي أن يدفع DA-Gal4 التعبير على نطاق واسع ولكنها ضعيفة، والتي تراكمت فقط عند مستويات مرتفعة في مراكز الدماغ تتألف من بضعة آلاف محاور عصبية وخلايا عصبية في عدد قليل من كبار (الشكل 2). على الرغم من أن مستويات التعبير من بنيات كانت منخفضة، وهذه الشروط خفضت بشكل كبير البقاء على قيد الحياة بطريقة تعتمد على polyQ. الوفاء بهذا ديناميات التعبير احتياجاتنا مع الحفاظ على مستويات منخفضة التعبير، وهذا أمر مهم لرصد وتقدمية بطيئة التعديلات الخلوية الناجمة عن البروتينات أعصاب.
وكان من نتيجة متوقعة لحمل التعبير في كل مكان من البروتينات أعصاب أنه تسبب الفتك قبل eclosion الكبار. لحسن الحظ، كان هذا التعقيد تجاوز مع استخدام Gal80 TS. كما نوقش أعلاه، وصلت مستويات التعبير الجيني القصوى حوالي 48 ساعة بعد التحول درجة الحرارة، والتي تناسبها بشكل جيد مع فرنسا مرةلي من التجربة. كان واحدا من استخدام ميزة إضافية Gal80 TS ذلك، وعلى النقيض من التجارب حيث يتم التعبير عن البروتينات جوهري أعصاب عموم العصبي، لم يكن هناك تعبير أثناء وضع الجهاز العصبي. وهكذا، تم إنشاؤها باستخدام TS Gal80 "نظيف" الخلفية حيث لم تتعرض الجهاز العصبي للأنشطة السامة من هذه البروتينات خلال مراحل نمو أعصاب حساسة. في رأينا، أسفرت تفعيل التعبير الجيني في البالغين في وضع أفضل نموذج لهذه الفئة من الأمراض الذي يصيب البالغين. ومع ذلك، Gal80 TS كما عرض بعض المضاعفات المصاحبة للتغيرات في درجة الحرارة. كان واحدا أن الذباب المتزايد في درجات الحرارة المنخفضة (18-20 ° C) تأجيل دورة الحياة، مما يجعل التجارب أطول بكثير. أيضا، ومن المعروف جيدا أن الذباب المتزايد في درجات حرارة عالية (29-31 ° C) يسرع عملية الأيض لديهم، كما يتضح من مقارنة تقصير عمر الذباب في الذين تتراوح أعمارهم بين 25 ° C. SINCE سيتم تنفيذ الدراسات النسخي والتمثيل الغذائي في الذباب في درجة حرارة عالية تتراوح أعمارهم بين، ونحن قد نتوقع أن نرى تغييرات هامة في مسارات الإجهاد الخلوية واستقلاب الطاقة. هذا هو السبب في أنه أمر حاسم من أجل إدخال عنصري تحكم لتجربة واحدة مع الممرضة غير Atnx3-27Q والسيطرة لا علاقة لها معربا عن LacZ. وهذه الضوابط توفير قاعدة للتعبير الجيني والتغيرات الأيضية المرتبطة ارتفاع في درجة الحرارة حتى نتمكن من تحديد هذه التغييرات مرتبطة مباشرة إلى التعبير عن Atxn3 السامة. وعموما، لقد قدمنا تعديلات عديدة لجمع الذباب التي توفر العديد من المزايا - وعيوب قليلة (درجة الحرارة والقضايا الفقرة التالية) - لدراسة الذي يصيب البالغين، والأمراض التدريجي.
على الرغم من أن التنظيم الزمني مع TS Gal80 كان إضافة مفيدة، فإنه قدم أيضا مضاعفات غير متوقعة. بينما تعمل على توليد الذباب يحمل كل Gal80 TS علىالثانية DA-Gal4 يبني في الأسهم مستقرة، لاحظنا أن يطير متماثلة اللواقح مضاعف لكل من يبني وقابلة للحياة ولكن العقيمة. منذ متماثلة اللواقح Gal80 TS وسلالات DA-Gal4 كانت خصبة وقابلة للحياة في حد ذاتها، فإنه ليس من الواضح لماذا الجمع بين عرض انخفاض الخصوبة. وقد كان من المعروف منذ بعض الوقت أن Gal4 هي سامة قليلا إلى الأنسجة ذبابة الفاكهة 22. فمن الممكن، إذن، أن تعبير مغايرة للGal80 الخميرة قامع النسخي ساهمت في سمية Gal4 عن طريق التداخل، من المحتمل، مع الآلية الذاتية النسخي. يمكن أن تتفاقم هذه السمية عن طريق توزيع في كل مكان من Gal4 تحت سيطرة دا، وهو الجين الذي يلعب دورا رئيسيا في التنمية في وقت مبكر وتحديد الجنسية. بغض النظر عن الأسباب الكامنة وراء العقم، قمنا بتوسيع نهاية الخبر Gal80؛ DA-Gal4 الذباب من خلال المحافظة على كروموسوم موازن أكثر DA-Gal4 مع الحفاظ على حوmozygosity لGal80 ر ق، مما يوحي بأن Gal4 هو المساهم أكثر أهمية للعقم. وكان هذا مفتاح الحل لاننا كنا نستخدم المئات من هذه الذكور كل أسبوع الأخرى لعبور مع كل من الجينات المحورة UAS. ومع ذلك، يعبر يحمل موازن خلق أعمال إضافية خلال اختيار سلالة المناسبة. وقد تم جمع سوى ربع (25٪) من ذرية (الإناث، غير موازن)، والتي أضافت اختيار الوقت، وانخفاض العائد للزجاجة الواحدة، وزيادة عدد الزجاجات اللازمة للحصول على الذباب لا يقل عن 200 في التركيب الوراثي / مكرر / الوقت النقطة. وعموما، على الرغم من أن مجموعة من الذباب أصبح مضيعة للوقت نظرا لحاجة مجموعات كبيرة، ونحن واثقون من أن دراسة التغيرات الخلوية بضع ساعات فقط بعد تشغيل الجينات المسببة للأمراض التعبير بتواجد مطلق وتحديد العمليات ومثيرة للاهتمام رواية المتورطين في فقدان الخلايا العصبية تدريجيا.
مرة واحدة في تصميم الجينية في المركز، أولينا اهتماما خاصا لالتلاعب التجريبية التي يمكن أن تقلب إدخال البيولوجية. أولا، نحن فقط جمع الإناث البكر لضمان تجانس العينات، رغم أن هذا يعني رمي الذكور والتحقق من وجود ذرية مرتين في اليوم. خلال الشيخوخة، وأبقى أكثر من 12 في القارورة الذباب واحد لتجنب الازدحام والضغط. أيضا، قبل التجميد، تم نقل الذباب لcryovials بدون تخدير وسمح للتعافي من نقل لمدة 30 دقيقة. يمكن لهذه العوامل تؤثر على ما يبدو تافها التعبير الجيني والتمثيل الغذائي، وإدخال التنوع في التحليل النهائي الذي لن تكون ذات صلة التجربة.
لضمان جودة المواد المجمدة (رؤساء، RNA، والأيضات)، ودفعنا اهتمام خاص إلى كل التفاصيل التي يمكن أن تساهم في تدهور الأنسجة. منذ يتم نقل الذباب لcryovials في أعداد صغيرة (تصل إلى 12 في قارورة الذباب)، كان لدينا العديد من قوارير لاسترداد لجمع من 200 رأس. وكانت هذه المناورات دواحد مع الحذر الشديد في غرفة باردة مع الثلج الجاف والنيتروجين السائل. جمع الذباب، والفصل بين الرؤوس، وتنقية جزيئات الإعلامية هو أيضا مضيعة للوقت لاكتشاف ان المادة المتدهورة في نهاية هذه العملية الطويلة. بالإضافة إلى ضمان أن المواد يحتفظ بجودته، يصف هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي تعظيم العائد من RNA والأيضات، بما في ذلك تجميد التجفيف والضرب حبة. ليس مطلوبا من هذه الخطوات لإخراج العادية لRT-PCR PCR الكمي أو من الذباب كله، ولكنها بالغة الأهمية بالنسبة لتنقية متسقة من عينات صغيرة مثل رؤساء الطيران. قررنا أن خطوات أخرى تؤثر على العائد من الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، أنتجت أقدم الذباب RNA أقل بكثير من الذباب الأصغر سنا، بغض النظر عن التركيب الوراثي. واقترح أن هذه الملاحظة الشيخوخة في درجة حرارة عالية يؤدي الى تغييرات دراماتيكية. أيضا، استخراج الحمض النووي الريبي من 100 رئيس كان في الواقع أكثر كفاءة من رؤساء من 200، لذلك نحن لتنقية شرع في اثنين بatches 100 في العينة، إلا أن الجمع بينهما بعد التحقق من الجودة مع BioAnalyzer. أيضا، يبدو الأعمدة لتنقية مرنا لتشبع بسهولة، وبالتالي فإن كمية الحمض النووي الريبي مجموع المستخدمة في العمود يحتاج إلى أن يكون الأمثل.
الأيضات هي خليط متنوع من الجزيئات الصغيرة، لذلك مراقبة الجودة هي أكثر صعوبة من مع DNA، RNA، أو البروتينات. للأسف، ليس هناك فهرس كامل من الأيضات لأي نموذج حيواني في هذا الوقت، وهو الأمر الذي قد يتغير في السنوات القليلة المقبلة بفضل لتطبيق العديد من الابتكارات التكنولوجية، بما في ذلك التحليل الطيفي NMR والتوسع في استخدام اللوني السائل - الطيف الكتلي ( LC-MS). على الرغم من أن NMR أقل حساسية من MS، فإنه يظهر مزايا واعدة كثيرة، بما في ذلك أي تدمير العينات، أي إجراءات التحليلية التي يدخل التحيز (LC)، واستنساخ العالية التي تسمح المقارنة الإحصائية للممثلين والظروف التجريبية عدة 24. وهكذا، يمكن أن تكون العينةإعادة اختباره للتحقق من الملاحظات أو إعادة تحليلها بواسطة LC-MS للتحقق من صحة البيانات NMR. هنا، نحن أظهرت بيانات أولية من الذباب NMR التي نستخدمها لتجميع قائمة من الأيضات في ذبابة الفاكهة. وسوف تكون هذه المعلومات حاسمة لتحديد كيفية التعبير عن الجينات المسببة للأمراض التمثيل الغذائي العادي يغير، وفتح نافذة جديدة لتعزيز فهم الآليات الكامنة وراء أمراض الاعصاب الخلوية.
التكنولوجيات الناشئة حديثا OMIC تقدم أفضل فرصة لدراسة أمراض الاعصاب على مستوى من التفاصيل لم يتحقق من قبل. ولعل أكبر عقبة للتغلب على هذه الدراسات في الإنتاجية العالية هو جمع عينات من المؤمنين استنساخه التي يمكن تحليلها بطرق حساسة للغاية. عرض الإجراءات هنا توفر وسيلة لتحقيق هذا الاتساق، وسوف يؤدي إلى النتائج التي يمكن مقارنتها بسهولة عبر مجموعات البيانات. على الرغم من أن البحوث الأولية مصالحنا المشتركة التغييرات دراسة من التعبير عن الجيناتأيون والأيضات، يمكن أيضا الذباب ولدت التعرض للتحليل البروتين أو epigenomic. التغييرات التي تحدث البروتين وepigenomic خلال تنكس عصبي ومن المرجح أيضا أن تكون ذات أهمية قصوى في عملية المرض. عندما يحدد المجتمع العلمي في نهاية المطاف مجموعة كاملة من التغيرات الجزيئية التي تؤثر على عملية المرض، ومستوى أنظمة صحيح فهم المرض يكون ممكنا. على هذا المستوى، فإن أمراض تعديل العلاجات الظهور أخيرا كواقع.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن ممتنون إلى سانتياغو جانيس، فيغيروا غابرييل، وخوسيه هيريرا للحصول على المساعدة الفنية والمالية مركز بلومنغتون ذبابة الفاكهة في جامعة إنديانا للأسهم الطاير. وقدم الدعم وDH CW من الأموال من NSF-IOS-1051890. وقدم الدعم PF-F وLMM من فرصة صندوق البذور من جامعة ولاية فلوريدا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32" grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 | |
References
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
- Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
- Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
- Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
- Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
- Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
- Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
- Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
- Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
- Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
- Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
- Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
- Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
- Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
- Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
- Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
- Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
- Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
- Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
- Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
- Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
- Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).
