Summary
在这里，我们描述的程序，用于提取和纯化的mRNA和代谢物从
Abstract
在过去的十年中，我们试图利用果蝇作为模式生物的神经元变性的细胞和分子机制的了解。虽然果蝇为实验的优势明显，对神经退行性疾病的研究大多依赖于传统的技术，包括遗传相互作用，组织学，免疫荧光法，蛋白质生物化学。这些技术是有效的机械，假设驱动的研究，从而导致了详细的了解单个基因的作用在明确定义的生物问题。然而，神经退行性疾病是非常复杂的，随着时间的推移影响多种细胞的细胞器和进程。新技术和新的组学时代的到来提供了一个独特的机会，了解全球移动扰动底层的复杂疾病。灵活的果蝇等模式生物适应这些新技术的理想选择，因为其强大的阿诺ATION和高的可追踪性。与这些小动物的一大挑战，虽然是高度相关的组织，如苍蝇的大脑足够的信息分子（DNA，mRNA，蛋白质，代谢物）的净化。其它挑战包括收集大量实验复制（用于统计的鲁棒性的关键）苍蝇和发展一致的高品质的生物物质的净化程序。在这里，我们描述的程序收集成千上万的苍蝇头和成绩单和代谢产物提取，以了解全球变化的基因表达和代谢促进神经退行性疾病。这些程序易于扩展，可应用于蛋白质组和表观基因疾病的研究。
Introduction
在上个世纪， 果蝇已经被证明是一个非常宝贵的实验室深刻的生物学问题，最显着的发展，细胞生物学，遗传学和神经生物学研究工具。这一成功的原因是，果蝇容易操作，有不断扩大的工具箱18，21，31，并拥有一个相对简单的基因组与高品质的注释26。这些技术优势，与飞社区内的聪明才智，不断创新相结合，导致了广泛的科学贡献，说明了三个诺贝尔奖颁发（1933年，1995年，2011年）。最近， 果蝇已经成为一个相关的模型，为研究人类的弊病，主要发育障碍，先天性免疫，癌症，神经退行性疾病2。我们特别感兴趣的是发现神经退行性疾病的细胞和分子基础的。这些复杂和多样的合作条件是与集会，可能是可溶性的寡聚体，非正常折叠的蛋白质，所以很容易在果蝇模型。所有的主要神经退行性疾病，包括老年痴呆症，帕金森氏症，亨廷顿氏病，肌萎缩性侧索硬化症，几个共济失调，tau蛋白，朊病毒疾病，和其他罕见疾病，在果蝇中被塑造的最后15年23。飞行实验室作出了贡献，了解这些疾病主要是利用果蝇的遗传学研究，以确定新的神经毒性的致病蛋白质的基因牵连的威力。相关的新的基因的神经毒性级联一旦被确定，其效果通常是通过传统的方法，包括组织学检查，以确定模式的变性，免疫荧光，以确定蛋白的分布和细胞病理学，和生化分析分析评估异常蛋白质构象的数量和类型。最后，行为ioral分析作为一个功能读出疾病的结果。这些已确立的技术已被利用来检查一个或几个候选基因的贡献的疾病过程，包括氧化应激和线粒体功能障碍性13，转录失调9日，27日，30日 ，异常轴突运输和突触活动14，异常RNA生物9，失调的细胞信号转导29中 ，ER dyshomeostasis 6，阻碍细胞proteostasis的33，和许多其他人23。然而，目前尚不清楚如何将这些毒蛋白可能会干扰同时与多个相互关联的途径，什么是这些变化的时间序列，每一个途径，发病的相对贡献是什么。几十年的研究集中于单一的基因在人类和动物模型中，假设驱动的方法导致的细胞机制，导致不完整的，令人费解的图片神经退行性病变。目前缺乏了解，这些有毒的蛋白质组件的确切机制导致神经病理学疾病修饰疗法的发展是一个重要的限制。
我们现在是否有兴趣在应用新的方法来了解这些致病蛋白诱导全球蜂窝扰动。组学时代的到来使的深探测复杂的生物学问题，使用先进的高通量技术，它可以导致有效的疾病治疗在不久的将来。基因表达（转录）的研究，建立了多个基因组序列完成后，由于高品质的注解可以预测最成绩单。最近应用新一代测序（RNA-seq的）转录分析提供了新的优势和机遇相比，芯片，包括一个公正的方法，提高了定量范围，并降低成本32。我们要利用的优势，RNA-seq的，以便更好地了解显性遗传性共济失调，脊髓小脑共济失调3型（SCA3）或Machado-Joseph病的最常见的形式。 SCA3是完全外显的单基因显性遗传病，造成的CAG三核苷酸扩展的目的基因的基因（ATXN3），16。此突变导致具有长的多聚（polyQ蛋白）的轨道，使得它容易聚集ATXN3蛋白的生产。 ，由于突变ATXN3是在SCA3负责所有的疾病相关的扰动的神经毒性剂，应用这些新的组学方法，这是一种理想的疾病。此外，SCA3是在果蝇中34为蓝本的最早的神经退行性疾病之一。
虽然将在RNA-seq的飞头收集大量的程序，我们意识到，我们可以使用同样的材料进行全球研究的其他信息分子。在其他新兴式行动线组学，蛋白质组学，表观基因组学和代谢组学，让细胞病理学检查在以前没有达到的深度，虽然没有挑战。反对的mRNA，蛋白质和代谢物的目录，是相当不完整的，在这个时候，由于在预测的所有可能的剪接变体，和更神秘所有正常和致病性代谢物的起源的难度增加。大的努力，目前正在进行中，以目录蛋白质在许多生物和疾病的条件。对于这一点，我们想专注于使用一个简单的生物体，如果蝇的贡献，改变代谢产物SCA3发病。这是一个相对较新的和有前途的领域，特别是最近推出的核磁共振（NMR），它提供了高重复性和不破坏样品中5个，24。我们建议，代谢产物分析可以有助于确定生物标志物和疾病的机制牵连neurodegenerati上。
与这些组学项目的一个重要的考虑因素是，它们需要大，均匀的样品（200飞头）以及精确的纯化技术，以尽量减少实验误差。我们开始收集苍蝇程序，我们以前使用的芯片和最近使用的RNA-seq的12。但是，我们很快就遇到了一些相关的misexpressing SCA3结构的问题。首先，我们必须选择一个Gal4的驱动这些实验4的方法 ，其中用于分析的靶组织是脑的。最明显的选择将是一个泛神经的驱动程序，因为SCA3是一种脑部疾病。然而，由于我们打算收集基因和代谢物从整个头，此选项会产生混合材料的组织表达和不表达结构。要产生均匀样品，所有的细胞表达的结构，我们决定用一个弱，但无处不在的车手阵容，daughterless（DA）-GAL4。 Interes刺痛感，许多基因牵连的神经退行性疾病，包括ATXN3 20，有广泛的分布，使得无处不在表达的选择适当的。然后，我们遇到了第二个问题：在开发过程中无处不在的表达致病ATXN3-78Q造成的杀伤力。要绕过这个杀伤力，我们Gal80 TS控制的时间激活的GAL4 19。这使我们能够收集到的实验苍蝇，年龄为20天，冻结他们，和处理冻干头，无论是RNA（TRIzol试剂）或代谢物（甲醇-氯仿）提取（ 图1）。我们已经使用了这个协议获得的转录组和代谢组学分析的样本，但也有其他明显的，这种技术的应用（ 如蛋白质组或神经多肽表达分析）。
实验概述：这些协议的总体目标是支持收集的注意事项，飞头支架的样品成绩单和代谢产物的提取。这些程序的具体目标是获得苍蝇表达ATXN3-27Q和ATXN3的78Q（致病性和非致病性实验结构）以及LacZ的控制结构，在一个单一的样本包括200飞头。虽然目前的技 术允许非常小的样本的分析，包括单细胞28，我们汇集了200头，以消除实验，生物和技术的变化，从而使我们能够识别的细胞变化与疾病的进程与高统计的信心。这种方法是用来检测这些基因表达的变化是一致的人群中，引导我们向驾驶退化的最重要的途径。由于我们感兴趣的是年龄相关的变化，这些果蝇的负责人，各基因型1，10，20日龄。
一个基本方面，这些全局分析是生产生物复制，支持强大的统计分析。我们以往的经验与微阵列和RNA-seq的建议，一式三份，生物样品分析提供了强有力的统计学意义的数据，11日，12。我们将在第1节）如何生成一个单一的生物复制（REP 1）各基因型和时间点。这些程序可以重复产生销售代表2和3，或并行执行，只要每个代表的正确识别。 ，虽然三销售代表的目标是，设置了第四的（甚至第五）代表强烈建议，产量低，损失的苍蝇在衰老过程中的问题，或意外丢失的材料（苍蝇，头，或RNA）中的一个或多个样本。
我们发现，10个杂交（瓶标识的字母AJ）生产出足够的后代获得200头/基因型/时间点。必须十分谨慎，以避免混乱，因为大量的瓶重新获得一个代表（10瓶×3基因型×3次= 90瓶）。对于这一点，我们指定每个瓶用基因型，时间点，瓶信。例如，SCA3-27Q 20E是指到的第五瓶（10），表示ATXN3-27Q岁的20天的苍蝇。一旦后代E关闭，苍蝇得以维持的唯一标识符标记在不同的小瓶。
我们维持获得每个样品，瓶，收集点（早晨和晚上）在Excel电子表格中的数字的苍蝇。我们修订了苍蝇每小瓶冷冻前要考虑的杀伤力和在逃。从那些最后的计数，可以很容易地找到小瓶增加200苍蝇，在打开的冰柜前，从而有利于保存的样品。由于苍蝇收集从一个瓶只能用于在一个代表，我们最大化每生物学重复的贡献，尽管所有的重复次数包含从多个瓶苍蝇。我们保留苍蝇不使用其他销售代表在预定的代表，作为替代品的样品，或其他相关实验（免疫印迹，定量PCR）从瓶子。
Protocol
1。生成的复制和“蝇王”（注意，液氮冷冻）
目标：收集每基因型/时间点，至少有200名女性和闪光冻结。
- 基因型：Gal80 日ts;哒-Gal4的 ，应变的控制下的无女的调节区和温度敏感的Gal80 Gal4的无处不在的表达。的控制线，我们使用UAS-LacZ的 ，先前已被证明诱导没有有害影响。 的UAS-ATXN3-27Q和UAS-ATXN3-78Q，非致病性和致病性实验的结构，分别（Y，HS-HID工程已使用过的处女雌为一个更有效的收集，但我们还是决定反对，因为需要额外的时间介绍Y，HS-HID Gal80 TS DA-GAL4染色体上的II III。）
- 展开全部股票相结合，10名女性和5名男性瓶s以防止过度拥挤。所有的实验都进行了爵士混合的苍蝇媒体，这是很容易准备与螨虫，促进快速的果蝇增长和低侵扰。
- 每个时间点而言，收集50 Gal80 日ts;哒-Gal4的男性，和100的UAS-ATXN3-78Q处女（只有一个UAS的线将被用来作为一个例子）。
- 10十字架每基因型/时间点。麻醉男性和女性的二氧化碳（CO 2）卧铺/垫。将10处女的UAS-ATXN3-78Q苍蝇（年龄不超过五天），到每个大瓶和5名男Gal80 TS DA-GAL4添加了酵母膏（复水干酵母）。瓶子贴上标签基因型，时间点，和瓶子标识符（字母AJ），并将其放置在25°C。
- 术后第2天，清除从瓶子上的成年人，添加干酵母和洒一滴的水，以鼓励最佳幼虫的生长，将瓶在18°C（Gal80活跃，Gal4的抑制）。 不要复制的十字架，因为这可能会引入实验变异后代中来自受精与处女雌。此外，从每个瓶子的后代代表独立生物学重复（每一瓶产生独特的后代），但将技术转移杂交（复印件）重复（更多的后代具有相同的遗传体质）。
- 当的后代ecloses在18°C，麻醉卧铺CO 2 /垫，收集处女所需的基因型，并把他们的小瓶装（十一时五十八苍蝇每小瓶）。出版商瓶与瓶标识符。 不要池航班从不同的瓶子。将瓶在18°C为24小时。为了最大限度地提高后代，继续收集上连续的早晨和晚上。
- 当每个小瓶完成24小时，在18°C，将它们转移至29°C（Gal80无效的，Gal4的激活）。这是第0天，在实验的起点，当t他转基因引发他们的表达。
- 转移的苍蝇清洁小瓶，每2天，直到他们达到10和20天。
- 苍蝇时达到所需的年龄（1，10，20天），计数和将它们传输从食品小瓶进入预标记的离心管中，使用一个小漏斗。 不要麻醉苍蝇。倒置瓶放在了替补席上。
- 等待30分钟，让苍蝇恢复从转移（压力），然后闪冻结瓶浸泡在液氮中，并存储在一个标记，预冷冷冻箱。 请记住 ：在相同的顺序，冻结苍蝇他们被转移到离心管的离心管均匀的样品中花费的时间。
2。收集和冷冻干燥的苍蝇头（执行冷库，预冷设备，注意事项，液氮和干冰）
目的：快速分离，收集，组织和冷冻干燥。
- ASSEMBLE筛（最大的网格在收集尸体上腔，下腔第二大收集头，盖在底部收集一小部分）和预冷在-80°C至少30分钟。
- 从离心管中收集200苍蝇的苍蝇源于同样的瓶子的贡献最大化。为了弥补在早晨或傍晚收集的苍蝇之间的差异，确保每一个示例使用了一个相同的早上/晚上比（我们使用47％的早上/晚上53％）。 注：可以从两个100头样本的RNA结合购买以产生相当于200苍蝇的一个复制。
- 冷藏封口膜（〜9×14厘米）的一块，在干冰上5分钟。
- 清空离心管上的封口膜，一次几个完整的苍蝇;数，直至达到100只苍蝇，苍蝇用画笔，并存储在另一个离心管干冰。
- 浸在液态氮中的筛，添加100苍蝇的上部chamb呃。剧烈摇动筛子，持续1分钟。再次浸在液态氮中，并摇晃1分钟。
- 打开的筛，收集从下部腔室中的微管的头，并将其放置在-80℃下
- 打开微管，包的顶部封口膜，使小孔。
- 将样品放置在冻干机了至少2天。
3。总RNA的提取和纯化mRNA（把所有表面RNaseZap，勤换手套）
目的：均质组织，以最大限度地提高产量，提取总RNA，并纯化mRNA的。
- 冷冻干燥机中取出的样品，三小，不育，钢磨球，每个微管。地点在基因型/磨床;运行在1500次/分钟，持续1分钟。
- 打开管中，加入的TRIzol1毫升，并用封口膜密封管。研磨1分钟;，挖掘管上下颠倒，以清除钢球，如果必要的。研磨1分钟。
- 别离心管，在这一点（管将是脆性）。混合物（钢球除外）转移到一个新的无RNase的微管。在桌面的离心沉淀细胞碎片，在4℃下以12,000×g的10分钟。
- 将上清转移至新的小管。加入0.1体积的1 - 溴-3 - 氯丙烷（BCP），剧烈振摇15秒。在室温下孵育3分钟。附带在一个离心在4℃下15分钟，于12,000×g下注 ：许多RNA提取协议使用氯仿在此阶段; BCP被旨在最大限度地提高RNA的产量增加的相分离的效率。保持的样品在4℃下的离心步骤期间，也将增加的相分离的效率，并降低到水相中的蛋白质和基因组DNA污染。
- 最佳的水层转移至新的小管。通过加入0.5倍体积的冰冷的异丙醇沉淀RNA;反转六次英里X。在室温下孵育10分钟。附带在一个离心在4℃下10分钟，于12,000× 克。
注：除了回收RNA，蛋白质也可以被从有机层和相间的TRIzol提取，所以蛋白质组学和转录组学分析，可以对相同的样品进行。虽然我们没有进行这一步在我们的分析，TRIzol试剂提取的可溶性蛋白和膜与细胞核蛋白比大多数缓冲液/清洁剂提取更大的代表性，产生出色的代表。李罗17描述了一个程序，用以提取蛋白质的使用的TRIzol适当的蛋白质组学分析，其中包括2-D凝胶和LC-MS/MS。
- 除去上清液。洗净，通过添加1毫升冰冷的70％乙醇（用DEPC处理过的水），和一个短的涡旋和混合的RNA。附带在一个离心在4℃下以12,000×g的5分钟。
- 除去上清液。空气干燥的颗粒至少15分钟。加入80微升DEPC-水的RNA沉淀，并将其放置在55℃，10分钟。发表在4°C过夜。
- 使用的NanoDrop分光光度计确定RNA浓度。在260 nm/280 nm处的吸光度的比例应该是1.8和2.1之间，与2.1是最佳的。
- 以了30微克散的RNA，添加4 U的DNA酶I，60单位RNA酶抑制剂，10微升的10倍反应缓冲液，和DEPC-处理水使总体积为100μl。在37℃下孵育20分钟。
- 用RNeasy Mini试剂盒纯化RNA。按照制造商的指示，除了执行所有离心30秒，包括所有“可选”的步骤。
- 确定RNA浓度的NanoDrop，并使用“总RNA在生物分析仪的微型”法评估RNA的质量。
- mRNA纯化，30微升磁珠转移到RNase-free的离心管中。
- 将管上的磁铁1-2分钟，除去上清液。中重悬珠15μL结合缓冲液。重复以上步骤。
- 从5μg的总RNA，将音量调节到15μLDEPC水。热，在65℃处理2分钟，并放置在冰上。
- 加入15微升15微升预洗过的小珠的总RNA。通过移液，每隔5分钟30分钟退火的RNA，以珠粒调匀。广场上的磁铁1-2分钟，取出所有的上清液。
- 通过仔细的移液中加入35微升的洗涤缓冲液B.混合。广场上的磁铁，小心地取出上清液。重复洗涤两次。
- 洗脱出的mRNA，通过添加15微升冷的10mM的Tris-HCl（pH值7.5）中和加热至80℃，持续2分钟。立即放置在管上的磁铁，将上清转移至一个无RNase的管，并在-80℃下冻结量化为3.8）。产量应该是约1-5％的总RNA。
代谢组学分析，执行协议1和2），并继续进行，4）所示：
4。甲醇 - 氯仿额外ction中的代谢产物
目的：单独的极性和非极性的代谢物。
- 添加的抗氧化剂，丁基化羟基甲苯（BHT）在氯仿的浓度为0.1毫克/毫升，在提取过程中，以防止自动氧化的脂类。使用此BHT-氯仿的所有后续步骤。
- 200目传输到冷藏，预称重的锥形带螺旋帽的聚丙烯管中，冷冻于-80℃下，并冻干。确定的干重。
- 将5-7氧化锆珠管，在珠打浆机，均质两个周期在20秒内每800赫兹。
- 基于最重的样品的干重，添加水，甲醇，和氯仿在以下比率：11.74所述甲醇; 10.59 x水; 11.74所述三氯甲烷，其中x是克的重量最重的样品和产品的体积毫升数。所计算出的所有的甲醇和45％的总的水加入到的胎圈打浆机管含有冻干头的。
- Homogeni泽珠打手两个周期的每个20秒。
- 合并体积的氯仿（100％）和剩余的水（55％）在一个锥形玻璃小瓶中在冰上。然后，将该组织的混合物（珠）的玻璃小瓶中。振摇10分钟。在冰上孵育10分钟。
- 附带在离心机中在4℃下以2,000×g的5分钟。除去极性相（上层），用巴氏吸管（避免塑料）和地点在第二个微量离心管中。
- 下次（低级）的非极性相在一个小的玻璃小瓶中并冷冻在-80℃。下干燥的氮气流;确保油管氮气罐从运行，以避免在提取物中的增塑剂是高纯度的Tygon。
- 再水合的非极性相，与620微升的氘代氯仿。标记的NMR管，600μL转移。防爆-80℃冰箱中保存。
- 将极性相的Centrivap和运行，直到管是完全干燥的，在30°C（约7小时）。
- 则热ydrate的极性相，用620微升0.1M的磷酸钠缓冲液（pH值7.3）中氧化氘1mM的TMSP [3 - （三甲基甲硅烷基）丙酸-2 ,2,3,3-d4上酸]作为内部标准。为30秒的涡流。附带在一个离心在4℃下以10,000 rpm的转速下，以沉淀的颜料和其他大的分子，这将干扰的NMR谱的5分钟。 600微升上层清液转移到标记的NMR管。
Representative Results
要绕过控制DA-GAL4下扩大ATXN3无处不在表达诱导的杀伤力，我们推出的时间Gal4的调控Gal80 TS。但在此之前进行的收集和冻结大量的苍蝇，我们想要确定我们的基因的表达动态的控制下Gal80 TS和DA-GAL4。要做到这一点，我们所产生的杂交后代，留下的后代在18°C，收集到的成虫，并保持24小时在18°C。然后，我们把苍蝇在严格的温度（29°C）孵育0，6，12，24，36，48，和72小时。接下来，我们检测的积累polyQ蛋白等位基因的扩大，从单一的苍蝇印迹发布的协议10。表达是首次发现，但微弱的温度漂移和6小时后继续增加，直到48小时，当它达到饱和水平（ 图2A）。 Interes刺痛感，高的分子重量的不溶性polyQ蛋白带出现48小时后，信号所花费的时间的蛋白质，以形成大的聚集体。我们还解剖苍蝇的大脑在每个时间点，以确定分布的扩大polyQ蛋白等位基因者免疫荧光（ 图2B）。的蛋白质首先被检测到24小时后，在温度变化，虽然分布不均。 24至48小时的蛋白水平的持续上涨，使得几个大脑中心清晰可见，包括触角叶和蘑菇体的预测（ 图2B）。在48和72小时之间的表达扩大polyQ蛋白等位基因达到最大水平，这表明此时完全激活的Gal4系统。基于这些结果，我们选择了24个小时后，在温度变化的第一个时间点（1天）为随后的实验中。收藏10至20天的苍蝇也进行了测量的温度漂移（TI我0），这是在实验开始时，与新的致病性和控制转基因表达的时间。
一旦我们验证了ATXN3检测控制的Gal80 TS和DA-GAL4在29°C下24小时后，我们不知道这些果蝇是否会出现超过20天的神经退行性疾病。由于这些果蝇表达的致病蛋白作为成年人，我们担心，他们可能需要很长的培养时间显示神经退行性表型。要确定的，毒性ATXN3-78Q在这样的条件下，我们收集了苍蝇表达LacZ，ATXN3-27Q，ATXN3-78Q，并记录了他们的寿命。而表达LacZ和ATXN3-27Q显示90％以上的可行性，经过20天的苍蝇，苍蝇表达ATXN3-78Q呈低生存率为20天（30％）（ 图3）。事实上，第10天（7％的死亡率）和第15天开始死亡，损失是显着（20％），从而加速了在过去的5个D ATXN3-78Q苍蝇AYS。因此，这些结果表明，成人的致病基因的表达导致寿命缩短，诱导-78Q ATXN3，神经变性表型的一个关键标志。
本协议中最关键的环节之一是处理和保存的标本后，冻结，以确保质量的物质中提取。我们之间15-80微克总RNA提取前每200头（根据年龄和基因型）DNase处理根据的NanoDrop。大约三分之一（6-25微克）中回收高纯度的RNA，DNA酶处理后的由在260 nm/280 nm处的吸光度的比例。然而，我们发现RNA-seq的cDNA文库的准备，以确定RNA的质量，最好的办法是分析总RNA的生物分析仪。幸运的是，只需要少量的RNA（5纳克）的生物分析仪上使用的，因此它不影响的能力，产生每个样品的几个库。作为一个例子，我们跑了两个样本的总核糖核酸DNase处理前在生物分析仪的芯片，其中一个怀疑被降解（ 图4A-C）。高品质的RNA（样品1）三尖RNA条带，低于2000个核苷酸（nt）的大小和一个较小的带低于200新台币，较核糖体RNA（ 图4A）。约2,000个核苷酸的两个频带对应的18S rRNA的（较小的峰值）和28S rRNA的（较大的峰值），这是一个独特的方面的rRNA生物学在果蝇中（参见图4B）的两个片段。这些特质也观察到了在生物分析仪痕迹（ 图4B）。降级的RNA样品（样品2）相反，没有产生的核糖体RNA的尖锐的峰，及累计小于500核苷酸（ 图4A）的多个频带。这个尺寸分布很容易区分在生物分析仪痕迹（ 图4C），其中较短的尺寸的宽峰被指出。另外需要注意的瓦特作为两者之间的RNA样品，表明退化样品有以下的RNA中的y轴的单位的差异。只发生在RNA显示最高的质量（260 nm/280 nm处的吸光度在1.8和2.1之间的NanoDrop比，与2.1是最佳的，请参阅协议步骤3.8）将被用于生成图书馆。
如果在代谢物的提取，我们遵循一个典型的水/甲醇/氯仿（2.0:2.0:1.8）提取程序3分割成两个步骤，以最大限度地提高提取的极性和非极性的代谢物35。极性和非极性相分离后，我们重组他们在氘代水或氘代氯仿，分别，并通过NMR附加的内部标准进行分析。 NMR谱得到很好的解决这种提取方法与平面基准线和窄线（ 图5），说明高品质的提取物的净化，适合为代谢谱d为识别大量的代谢物。 图5示出的识别几个突出的峰值相对应的高度丰富的代谢物，如葡萄糖和蔗糖，和两个关键代谢酸，乳酸和醋酸，根据文献7中的化学位移。的化学位移（每百万分之几）表示相对于一个标准的分子（TMS，从右侧的第一个峰值）的分子的电磁屏蔽。更多shieldedmolecules有细胞核周围的电子密度较高的，并会出现的频谱的权利，包括烷基。 deshielded分子如酰胺和芳族氢会出现的左侧的频谱。繁忙的中间部分（3-4 PPM）丰富的糖分子。
图2。表达动力学（A）Western blot检测显示ATXN3-78Q的表达（Gal80 TS DA-GAL4 /的UAS-ATXN3-78Q）在果蝇培养在29°C从0到72小时。一个微弱的乐队是首次发现在6小时和饱和度达到了48小时后，感应。 （B）免疫全脑在同一个苍蝇。大脑进行解剖，固定的，ð染色与扩大polyQ蛋白蛋白的抗体，该抗体识别。在蕈状体（MB）的预测和触角叶（AL），是首次发现的蛋白质。在48和72小时，表达达到最高水平，并在大脑中心，丰富的神经支配是非常明显的。每个神经元的表达水平弱的光叶（OL），除了在几个大脑神经元之间的OL和中央的大脑。 
图3。 ATXN3-78Q减少寿命。苍蝇表达LacZ，ATXN3-27Q，ATXN3-78Q无处不在成年阶段（Gal80 TS DA-GAL4）进行了监测他们的寿命在29°C。苍蝇表达LacZ的 （蓝色）和ATXN3-27Q（绿色）的20天死亡率呈低水平。与此相反，苍蝇，表达ATXN3-78Q（红色）显示一个显着的死亡率，从第10天开始。 15天中，他们表现出了减少20％的活力，加快了未来5天，20天的死亡率达到了70％。 
图4。 RNA的质量评估。高品质和降解的样品RNA从一个生物分析仪的芯片上运行。 （A）生物分析仪运行与高品质的RNA（样品1）和降解的RNA（样品2）的大小标记（左线）。注意三个尖锐的峰对应的核糖体RNA在中央车道。 （B）生物分析仪的跟踪样品1，有两个特征强峰，仅低于2000元，低于200。 （C）的生物分析仪跟踪样品2，其中包括主要是降解的RNA。注意板 B 和 C之间的y轴的单位中的差异。
图5。代表性的一维NMR谱的极性代谢物。代表1D从果蝇和互补2D COSY（相关光谱）和HSQC（异核单量子相关）峰值分配实验极性代谢物的质子NMR谱。代谢物的确定，根据已知的化学位移-1：蔗糖，2：葡萄糖3：β-丙氨酸，4：醋酸，5：乳酸。
Discussion
我们以往的经验，在转录11，12，15新陈代谢，神经退行性疾病，8的基础上，我们提出了一个新的协议在这里收集成千上万的苍蝇头与成人致病基因的特异性表达，净化mRNA和代谢物RNA- seq和核磁共振光谱，分别。这些实验的性质要求成立前几项新技术的飞集合，包括选择一个无处不在的Gal4的线和使用时间的基因表达调控。关于Gal4的，无处不在的外源基因的表达是至关重要的，原因有两个。首先，在神经退行性疾病，包括ATXN3，亨廷顿 ， 淀粉样蛋白前体蛋白 ，和超氧化物歧化酶1，其中包括了大量的基因参与，广泛表达在神经元和神经胶质细胞中，以及在其他类型的细胞外神经系统。我们希望地模拟这些致病基因的生物学这方面的后果进行分析无处不在的表达，而不是只专注于神经表达。其次，它是在大量收集苍蝇的大脑并不可行，但我们可以这样做的飞头（200每条件，一式三份）11，12。由于整个磁头的同质化混合神经和非神经组织中，无处不在的转基因表达成为用于获得均匀的从相同的转基因的细胞表达的种群的RNA和代谢物的关键。重要的是要注意，DA-GAL4选择相当均匀分布，而不是因为它的高表达水平，虽然最近的一份报告表明，DA-GAL4可能不完全无处不在的25。我们曾考虑其他无处不在的Gal4的线，包括臂 ， 浴缸 ， 法，GA4，但他们都表现出复杂的表达模式在成人中枢神经系统和肌肉，使他们少了一个为这项研究dequate。事实上，在成年老鼠大脑的免疫荧光显示，DA-GAL4引起普遍，但微弱的表达，这不仅积累在高的水平在大脑中枢由几千元轴突和在几大神经元（ 图2）。虽然构建的表达水平是低的，这些条件在polyQ蛋白依赖的方式显着降低生存。这种表达的动态观察缓慢的，渐进的神经毒蛋白引起的细胞改变满足了我们的需求，同时保持低表达水平，这是非常重要的。
诱导的神经毒性蛋白的表达无处不在一个可预见的后果是，它造成的杀伤力成虫羽化前。幸运的是，这种并发症的使用的Gal80 TS绕过。如上所讨论的，基因表达达到约48小时后，在温度变化的最大水平，它适合与时间FRA我的实验。使用Gal80 日ts的一个附加的优点是，在对比实验中的神经毒性的蛋白质的组成型表达的泛神经，神经系统的发展过程中不表达。因此，使用Gal80 日ts创建一个“干净”的神经系统的背景下，不暴露这些神经毒性的蛋白质的毒性活动期间敏感的发展阶段。我们认为，激活基因表达的成人，成人发病的病理这个类的一个更好的模型。然而，Gal80 TS还介绍了一些相关的并发症随温度的变化。其中之一是，在低的温度下（18-20℃）的延迟增长苍蝇的生命周期，使实验显着更长。此外，它是众所周知的，在高的温度下（29-31℃）的增长苍蝇加速其新陈代谢，所示相比，在25岁的苍蝇的寿命缩短℃。硅NCE将在果蝇年龄在高温下进行的转录和代谢的研究，我们希望能看到在细胞压力的途径和能量代谢的重要变化。这就是为什么它是如此重要的两个控件的实验与非致病性Atnx3的-27Q和无关的控制，表达LacZ，一个。这些控件将提供一个基准与高温有关的基因表达和代谢的变化，这样我们就可以识别这些变化的有毒ATXN3表达直接关系到。整体而言，我们推出了多项修改，以收集苍蝇，提供众多的优势 - 有一些缺点（温度问题和下段） - 成人发病，渐进性疾病的研究。
颞规管与Gal80 TS虽然是一个有帮助的，它也推出了一个意想不到的并发症。在产生苍蝇携带两种Gal80 TS AND DA-GAL4结构在一个稳定的股票，我们发现，过得双纯合子的两个结构是可行的，但不育的。由于纯合子Gal80 TS和DA-GAL4株是可行的和肥沃的自己，目前尚不清楚为什么组合低生育率。人们已经知道了一段时间，Gal4的果蝇组织22有轻微毒性。这是可能的，那么，通过干扰，潜在的，与内源性转录机制，异源表达的酵母转录阻遏Gal80提供的Gal4的毒性。这种毒性可能加剧的GAL4控制下的大，在早期发育和性别决定的基因，起着关键的作用无处不在的分布。无论是不育的根本原因，我们扩大了Gal80 TS DA-GAL4果蝇保持平衡染色体DA-GAL4，同时保持了浩mozygosity为T S Gal80，Gal4的是不育的一个更重要的贡献。此解决方案是关键的，因为我们使用数百个这些男性每隔一周交叉与每个的UAS转基因。然而，十字架背着一个平衡器选择适当的后代的过程中创造了额外的工作。收集的后代只有四分之一（25％）（女性，非平衡），它增加了选择的时间，降低了产量瓶，并增加了数瓶需要获得至少200个苍蝇，每基因型/复制/时间点。总体而言，虽然收集的苍蝇成了耗时由于需要大集，我们相信，只有几个小时后打开致病基因的表达无处不在研究细胞的变化将确定新颖有趣的过程，牵涉到进步的神经元的损失。
一旦遗传设计非常到位，我们特别注意实验操作，可以引进生物的变异。首先，我们只收集了处女的女性，以确保样本的同质性，尽管这意味着扔掉男性和检查的后代，一天两次。在老化过程中，不超过12个苍蝇被关在同一个小瓶，避免过度拥挤和压力。另外，在冷冻前，苍蝇被转移到离心管中没有麻醉的，并允许恢复30分钟从转印。这些看似微不足道的因素可以影响基因的表达和新陈代谢，引入变异在最后的分析，将不相关的实验。
为确保质量的冷冻材料（头，RNA和代谢物），我们特别重视每一个细节，可以促进组织退化。由于苍蝇转移到离心管中在小数字（最多12个苍蝇每小瓶），我们必须检索多瓶收集200头。这些操作分别为d用干冰和液氮在寒冷的房间格外小心。头苍蝇，分离，纯化的信息分子的集合是太费时发现，该材料是在结束这个漫长的过程中退化。此外，以确保该材料保持其质量，该协议描述的几个步骤，最大限度地提高产量的RNA和代谢物，包括冷冻干燥和珠跳动。这些步骤是不正常提取所需的RT-PCR或定量PCR技术，从整体苍蝇，但他们如苍蝇头小样本的净化一致是至关重要的。我们确定，其他步骤影响RNA产量。例如，苍蝇显着减少的RNA比年轻苍蝇，无论基因型。这一观察结果表明，在高温下老化引起了巨大的变化。另外，RNA提取100头实际上是更有效的从200头，所以我们在两个B进行净化atches每个样品100个，仅与生物分析仪的质量验证后，把它们结合起来。此外，mRNA纯化列似乎容易饱和，所以使用的总RNA的量每列需要优化。
的小分子代谢物是一个多元化的组合，因此与DNA，RNA或蛋白质的质量控制是比较困难的。不幸的是，在这个时候，没有任何动物模型的代谢产物的完整目录的东西，在未来几年可能会发生变化的应用多项技术创新，其中包括NMR光谱和扩大使用液相色谱 - 质谱（ LC-MS）。虽然核磁共振比MS是不太敏感的，它显示了许多有希望的优点，其中包括没有破坏的样品，没有介绍偏压（LC）的分析程序，和高再现性，允许代表和几个实验条件24的统计比较。因此，样品可以是重新检测，以验证观测或重新分析用LC-MS，以验证NMR数据。在这里，我们发现从苍蝇的初步NMR数据，我们使用编译的目录，在果蝇的代谢产物。确定致病基因的表达如何改变正常的新陈代谢，打开一个新窗口，进一步了解神经退行性疾病的细胞机制，这将是至关重要的。
新兴组学技术提供了最好的机会来研究神经退行性疾病，在以前没有实现的细节。也许在这些高通量的研究克服的最大障碍是忠实再现的高度敏感的方法，可以分析样本的收集。这里介绍的程序提供了一种方法来实现这一目标的一致性，并会导致的结果，可以很容易地比较整个数据集。虽然我们的主要研究兴趣参与研究的基因表达的变化离子和代谢物，生成的苍蝇也可以进行蛋白质组或表观分析。也有可能发生在神经退行性疾病的蛋白质组和表观基因改变疾病的进程是非常重要的。当科学界最终确定了全方位的分子变化影响疾病的过程，一个真正的系统级对疾病的认识是可能的。在这个层面上，疾病修饰疗法最终将成为一个现实。
Disclosures
作者宣称没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢关颖圣地亚哥，加布里埃尔·菲格罗亚，技术援助和飞股票在美国印第安纳大学布卢明顿果蝇库存中心和何塞·埃雷拉。 DH和CW的资金支持NSF-IOS-1051890。 PF-F和LMM由佛罗里达大学的机会的种子基金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32" grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 | |
References
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