Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50245
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 2, 3, 1,4, 1,4
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida, 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida, 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida, 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

Summary

אנו מתארים כאן את ההליכים למיצוי והטיהור של mRNA ומטבוליטים מ

Abstract

בעשור האחרון, יש לנו ניסינו להבין את המנגנונים המולקולריים ותאיים של ניוון עצבי באמצעות תסיסנית כאורגניזם מודל. למרות זבובי פרות מספקים יתרונות ברורים ניסיוניים, מחקר על מחלות ניווניות הסתמך בעיקר על טכניקות מסורתיות, כולל אינטראקציה גנטית, היסטולוגיה, immunofluorescence, וביוכימיה חלבון. טכניקות אלה יעילות למכניסטית, מחקרי השערת מונחה, שיובילו להבנה מפורטת של התפקיד של גנים בודדים בבעיות ביולוגיות מוגדרות היטב. עם זאת, מחלות ניווניות הן מורכבות ביותר ולהשפיע האברונים מרובים סלולריים ותהליכים לאורך זמן. כניסתו של טכנולוגיות חדשות וגיל omics מספקת הזדמנות ייחודית להבין את ההפרעות הסלולריות הגלובליות שבבסיס מחלות מורכבות. אורגניזמים מודל גמישים כגון דרוזופילה הם אידיאליים עבור התאמת טכנולוגיות חדשות אלה בגלל ANNOT החזק שלהםation ועקיבות גבוהות. אתגר אחד עם החיות קטנות האלה, אם כי, הוא הטיהור של מולקולות מידע מספיק (ה-DNA, ה-mRNA, חלבון, המטבוליטים) מרקמות רלוונטיות ביותר כגון מוח זבוב. אתגרים אחרים מורכבים איסוף מספר גדול של זבובים לניסוי משכפל (קריטי לחוסן סטטיסטי) ופיתוח נהלים עקביים לטיהור חומר ביולוגי באיכות גבוהה. כאן, אנו מתארים את ההליכים לגביית אלף ראשי זבובים והחילוץ של תמלילים ומטבוליטים להבין כיצד שינויים הגלובליים בביטוי גנים וחילוף חומרים תורמים למחלות ניווניות. הליכים אלו להרחבה בקלות וניתן ליישם את המחקר של תרומות proteomic וepigenomic למחלה.

Introduction

במאה האחרונה, דרוזופילה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור מעבדה חוקרת שאלות עמוקות ביולוגיות, בעיקר בפיתוח, ביולוגיה של תא, גנטיקה, ונוירוביולוגיה 1. הסיבות להצלחה זו הן שזבובי פרות הם קלים לתמרן, יש ארגז כלי הרחבה אי פעם 18, 21, 31, ובעלי הגנום פשוט יחסית עם ביאור באיכות גבוהה 26. יתרונות אלה טכניים, בשילוב עם תחכום וחדשנות מתמדת בתוך קהילת הזבוב, הביאו לתרומתו מדעית הרחבה, כפי שבאו לידי הביטוי בהענקת שלושה פרסי נובל (1933, 1995, 2011). לאחרונה, דרוזופילה התפתחה כמודל רלוונטי לחקר מחלות אדם, הפרעות התפתחות, בעיקר חסינות מולדת, סרטן והניוון של מערכת עצבים 2. אנחנו מעוניינים בעיקר בחשיפת הבסיס התאי ומולקולרי במחלות ניווניות. שיתוף מורכב ומגוון אלהnditions צמוד למכלולים, oligomers אולי מסיס, של חלבונים מקופלים באופן חריג, ועל כן, במודל קלות בזבובים. כל מחל ניווניות העיקריות, כוללים אלצהיימר, פרקינסון ומחלת הנטינגטון, הטרשת לרוחב amyotrophic, כמה ataxias, tauopathies, מחלות פריונים, והפרעות נדירות אחרות, כבר עצב בזבובים בחמש עשר השנים האחרונות 23. מעבדות Fly תרמו להבנת מחלות אלה בעיקר על ידי ניצול היכולת של דרוזופילה גנטיקה לזהות גנים חדשים מעורבים ברעילות העצבית של החלבונים פתוגניים. ברגע שהגנים חדשים רלוונטיים למפל neurotoxic מזוהים, השפעותיהם נתחו בדרך כלל על ידי גישות מסורתיות, כולל היסטולוגיה לדפוסי נוכחים לברר של ניוון, immunofluorescence כדי לקבוע חלוקת חלבון והסלולרי, פתולוגיה וניתוחים ביוכימיים להעריך את הכמות והסוג של תצורות חלבון נורמליות . לבסוף, התנהגויותניתוח ioral משמש כreadout תפקודי של תוצאות מחלה. טכניקות מבוססות היטב אלה נוצלו כדי לבחון את התרומה של אחד או כמה גני מועמדים לתהליך המחלה, כולל סטרס חמצונים ותפקוד המיטוכונדריה 13, dysregulation תעתיק 9, 27, 30, תחבורת axonal חריג ופעילות הסינפטית 14, החריג רנ"א 9 ביולוגיה, dysregulated תא איתות 29, dyshomeostasis ER 6, הפריעה proteostasis סלולרי 33, ועוד רבים אחרים 23. עם זאת, לא ברור כיצד חלבונים רעילים אלה עלולים להפריע זמנית עם מסלולים המחוברים ביניהם מרובים, מהו הרצף של הזמן של שינויים אלו, ומהי התרומה היחסית של כל מסלול לפתוגנזה. עשרות שנים של מחקר התמקדו בגן יחיד, גישות השערת מונחה, באדם ומודלים של בעלי חיים הובילו לתמונה שלמה, תמוהה של המנגנונים התאיים הגורמיםניוון מוחיה. ההבנה הלקויה הנוכחית של המנגנונים המדויקים שבאמצעותו חלבונים רעילים מכלולים אלה גורמים נוירופתולוגיה היא מגבלה מרכזית להתפתחות של מחלות-modifying טיפולים.

עכשיו אנחנו מעוניינים ביישום של גישות חדשות להבנה כיצד חלבונים פתוגניים אלה לגרום הפרעות סלולריות גלובליות. כניסתו של עידן omics מאפשרת חיטוט העמוק של בעיות ביולוגיות מורכבות תוך שימוש בטכנולוגיות מתוחכמות תפוקה גבוהה, אשר יכול להוביל לטיפול במחלה אפקטיבי בעתיד הקרוב. מחקרי ביטוי גנים (transcriptomics) הוקמו בעקבות השלמת רצפי הגנום מרובים מאז ביאור באיכות גבוהה יכול לחזות רוב התמלילים. הבקשה האחרונה של הדור הבא של רצף לניתוח תמליל (RNA-seq) ספקה יתרונות ולהזדמנויות חדשות בהשוואה לmicroarrays, כולל גישה בלתי משוחד, מגוון הכמותית שפר, ועלות המופחתת 32.אנחנו רוצים לנצל את היתרונות של RNA-seq להבין טוב יותר את הצורה הנפוצה ביותר של אטקסיה התורשתית דומיננטי, סוג Spinocerebellar אטקסיה 3 (SCA3) או מחלת Machado-Joseph. SCA3 הוא מחל monogenic, דומיננטית עם חדירנות מלאה, שנגרמה על ידי התרחבות trinucleotide CAG בגן Ataxin3 (ATXN3) 16. מוטציה זו גורמת לייצור של חלבון עם Atxn3 polyglutamine מסלול ארוך (polyQ) שעושה את זה נוטה לצבור. מאז המוטציה Atxn3 הוא הסוכן העצבי בSCA3 האחראי לכל הפרעות הקשורות למחלה, זו מחלה אידיאלית ליישום גישות omic החדשים אלה. בנוסף, SCA3 היה האחת המחלות ניווניות המוקדמות ככבו בזבובים 34.

בעוד לשים במקום את נהלי איסוף מספר גדול של ראשים לטוס לRNA-seq, הבינו שאנחנו יכולים להשתמש באותו חומר לביצוע מחקרים הגלובליים של מולקולות מידע אחרות. בין discip משקים מתעוררים אחרקווים, פרוטאומיקה, epigenomics וmetabolomics לאפשר בחינה של הפתולוגיה התאית בעומק לא השיג בעבר, אם כי לא בלי אתגרים. בניגוד ל- mRNA, הקטלוג של חלבונים ומטבוליטים הוא די חסר בשלב זה בשל הקושי המוגבר בניבוי כל הווריאציות האפשריות ושחבור המוצא אפילו מסתורי יותר מכל מטבוליטים הרגילים ופתוגניים. מאמצים גדולים נמצאים כרגע בעיצומו לקטלג את החלבונים באורגניזמים רבים ובתנאי מחלה. לשם כך, אנחנו רוצים להתמקד בתרומה של מטבוליטים ששונו SCA3 הפתוגנזה באמצעות האורגניזם פשוט, כגון דרוזופילה. זהו תחום חדש יחסית ומבטיח, במיוחד עם המבוא האחרון של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), המספק שחזור גבוה ולא להרוס את דגימות 5, 24. אנו מציעים כי פרופיל המטבוליט יכול לתרום לזיהוי סמנים ביולוגיים ומנגנונים מעורבים במחל neurodegeneratiב.

שיקול חשוב אחד עם פרויקטי omic האלה הוא שהם דורשים דגימות גדולות ואחידות (200 ראשי זבובים), כמו גם טכניקות טיהור מדויקות כדי למזער וריאציה ניסיונית. התחלנו לאסוף זבובים בעקבות הליכים שהשתמשנו בם בעבר עבור microarrays וגם בשימוש לאחרונה ל12 RNA-seq. אבל מהר מאוד נתקל במספר בעיות הקשורות לmisexpressing את SCA3 המבנים. ראשית, היה עלינו לבחור נהג Gal4 לניסויים אלה 4, שבו רקמת היעד לניתוח המוח. הבחירה הברורה תהיה נהג הפאן עצבי מאז SCA3 היא מחלה מוחית. עם זאת, כיוון שאנו מתכוונים לאסוף mRNA ומטבוליטים מראשים שלמים, אפשרות זו הייתי לייצר חומר מעורב מרקמות להביע ולא מבטאות את המבנים. כדי להפיק דגימות הומוגניות שבו כל התאים מבטאים את המבנים, החליט להשתמש בקו חלש, אבל בכל מקום נהג, daughterless (דה)-Gal4. Interesמדגדג, רבים מהגנים המעורבים במחלות ניווניות, כולל ATXN3 20, יש לי הפצה רחבה, מה שהופך את הבחירה של ביטוי בכל המקום מתאים. ואז, נתקל בבעיה שנייה: ביטוי נפוץ של פתוגניים Atxn3-78Q גרמה קטלני במהלך פיתוח. כדי לעקוף את הקטלניות זה, אנו משולבים Gal80 ts לשלוט הפעלה הזמנית של Gal4 19. זה אפשר לנו לאסוף את הזבובים הניסיוניים, גילם לתקופה של עד 20 ימים, להקפיא אותם, ולעבד אותם לראשי lyophilized או רנ"א (TRIzol) או חילוץ מטבוליט (מתנול, כלורופורם) (איור 1). יש לנו כבר בשימוש בפרוטוקול זה לקבלת דגימות לניתוחי transcriptomic וmetabolomic, אבל יש יישומים ברורים אחרים לטכניקה זו (לדוגמא proteomic או ניתוחי נוירו peptidomic).

סקירה ניסויית: המטרה הכללית של פרוטוקולים אלה היא לתמוך באוסף של consiדגימות של סטנט ראשים לטוס לחילוץ של תמלילים ומטבוליטים. המטרה הספציפית של נהלים אלה היא לרכוש זבובים מבטאים Atxn3-27Q וAtxn3-78Q (מבנים שאינם פתוגניים ופתוגניים ניסיוניים), כמו גם LacZ (מבנה שליטה), שבו יחיד מדגם מורכב של 200 ראשי זבובים. למרות שטכנולוגיה נוכחית מאפשרת הניתוח של דגימות קטנות מאוד, כולל תאים בודדים 28, נאגדנו 200 ראשים לחסל וריאציה ניסויית, ביולוגית וטכנית, ובכך מאפשר לנו לזהות את השינויים התאיים הקשורים בתהליך המחלה בביטחון סטטיסטי גבוה. גישה זו נועדה לזהות רק את אותם שינויים בביטוי גנים שאינם עקביים באוכלוסייה שכיוונה אותנו לכיוון השבילים הקריטיים ביותר נהיגת ניוון. מכיוון שאנו מעוניינים בשינויים תלויי גיל בראשיהם של הזבובים האלה, כל גנוטיפ הושג ב1, 10, ו 20 ימים של גיל.

היבט מהותי מאלהניתוחים הגלובליים הוא הייצור ביולוגי משכפל תמיכה שניתוח סטטיסטי חזק. הניסיון הקודם שלנו עם microarrays וRNA-seq מרמז כי הניתוח של דגימות ביולוגיות בשלושה עותקים לספק מובהקות סטטיסטיות חזקות של 11 נתונים, 12. אנו מתארים בסעיף 1) איך לייצר לשכפל ביולוגי בודדה (1 הודעות) עבור כל נקודת גנוטיפ וזמן. נהלים אלה ניתן לחזור לייצר חזרות 2 ו 3, או נעשים במקביל, כל עוד כל הודעות מזוהות כהלכה. למרות 3 חזרות היא המטרה, הגדרת הברירה רביעית (או אפילו 5) מומלצת מאוד לכיסוי נושאים הקשורים לתשואה נמוכה, אובדן של זבובים במהלך ההזדקנות, או אובדן של חומר (זבובים, ראשים, או RNA) באחד או יותר דגימות.

מצאנו כי 10 צלבים (בקבוקים זוהו על ידי אותיות AJ) מיוצרים מספיק צאצאים כדי להשיג 200 ראשים / גנוטיפ / נקודת זמן. זהירות רבה יש ליישם כדי למנוע בלבול, שכן כמויות גדולות של בקבוקים במחדש נדרש לקבל הודעות 1 (10 x 3 בקבוקי גנוטיפים x 3 נקודתי זמן = 90 בקבוקים). לשם כך, אנו משתמשים בכל בקבוק מיועד גנוטיפ, נקודת זמן, ומכתב בקבוק. לדוגמה, SCA3-27Q 20E מתייחס לבקבוק החמישי (מתוך 10) של זבובים מבטאים Atxn3-27Q התיישן במשך 20 ימים. ברגע eclose הצאצאים, את הזבובים נשמרים בצלוחיות הנפרדות שכותרתו עם המזהה הייחודי.

שמרנו את המספרים של זבובים שהתקבלו עבור כל דגימה, בקבוק, ונקודת איסוף (בוקר וערב) בגיליון אלקטרוני של Excel. אנו תוקנו מספר הזבובים לבקבוקון לפני ההקפאה לקחת בחשבון הקטלניות ונמלטים. מהספירה האחרונה האלה, בקבוקוני הוספת 200 זבובים יכולים להימצא בקלות לפני שפתח את המקפיא וכך תורמים לשמירה על הדגימות. מאז זבובים שנאספו מבקבוק אחד ניתן להשתמש רק במחדל אחד, אנחנו מוגדלים תרומתם ללשכפל ביולוגי, למרות כל החזרות הכילו זבובים מבקבוקים מרובים. אנו שמוריםאת הזבובים מבקבוקים לא השתמשו בהודעות המתוכננות שלהם לחזרות אחרות, כדוגמאות להחלפה, או לניסויים אחרים הקשורים (מערבי כתם, qPCR).

Protocol

1. יצירה שכפלה ומקפיא את הזבובים (זהירות חנקן, נוזלי)

מטרות: איסוף לפחות 200 נקבות לנקודת גנוטיפ / שעה, ותקפיא.

  1. גנוטיפים: Gal80 ts; da-Gal4, מתח לביטוי בכל מקום של Gal4 תחת שליטתו של האזור המווסת daughterless והרגיש לטמפרטורה Gal80. כקו שליטה, השתמשו כטב"מ-LacZ, אשר בעבר הוכח לגרום ללא השפעות מזיקות. כטב"מ-Atxn3-27Q ואינם פתוגניים כטב"מ-Atxn3-78Q, ומבנים ניסיוניים פתוגניים, בהתאמה. (Y הבנייה, hs-Hid כבר השתמש בעבר לגבייה יעילה יותר של נקבות בתולות, אבל החליט נגד זה בגלל הזמן הנוסף הדרושים כדי להציג את Y, hs-הסתתר עם ​​Gal80 ts; da-Gal4 על כרומוזומים השניים ו ג.)
  2. הרחב את כל המניות על ידי שילוב של 10 נקבות וזכרים 5 לבקבוקזה כדי למנוע צפיפות יתר. כל הניסויים בוצעו בג'אז מיקס זבוב תקשורת, שהוא קל להכנה ומקדמת צמיחת תסיסנית מהירה והתפשטות נמוכה עם קרדית.
  3. אסוף 50 Gal80 ts;-Gal4 da זכרים, ו100 כטב"מ-Atxn3-78Q בתולות (רק קו אחד כטב"מ ישמש כדוגמה) עבור כל נקודת זמן.
  4. הפוך 10 צלבים לנקודת גנוטיפ / שעה. הרדם את הזכרים ונקבות בפחמן דו חמצני (CO 2) הרדומים / משטח. מקום 10 כטב"מ-Atxn3-78Q בתולת זבובים (לא יותר מחמישה ימים) וחמש זכר Gal80 ts; da-Gal4 לכל בקבוק גדול מתובל בממרח שמרים (שמרים יבשים rehydrated). תייג את הבקבוקים עם גנוטיפים, נקודתי זמן, ומזהה בקבוק (האותיות AJ), ולמקם אותם בגיל 25 ° C.
  5. לאחר 2 ימים, נקה את המבוגרים מן הבקבוקים, להוסיף קמצוץ השמרים יבשים ולהשפריץ מים על מנת לעודד התפתחות רימות אופטימלית, ולמקם את הבקבוקים ב18 ° C (Gal80 פעיל,Gal4 המודחק). אין להעתיק את הצלבים, כמו זה עלול להציג את השונות ניסוייות בצאצאים נגזרים ממופרה לעומת נקבות בתולות. כמו כן, צאצאים מכל בקבוק מייצגים ביולוגיים עצמאית משכפל (כל בקבוק מייצר צאצאים ייחודיים), אבל הצלבים הועברו (עותקים) יהיו טכניים משכפל (צאצאים נוספים עם אותו ההרכב הגנטי).
  6. כאשר צאצאי ecloses ב 18 מעלות צלזיוס, להרדים על 2 CO הרדום / המשטח, לאסוף בתולות של גנוטיפים הרצויים, ולמקם אותם בצלוחיות קטנות עם (11:58 זבובים לבקבוקון). בקבוקונים עם תווית מזהה הבקבוק. אל ברכת זבובים מבקבוקים שונים. מניח את הבקבוקונים חזרה בגיל 18 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי למקסם את הצאצאים, להמשיך לאסוף בבקרים ובערבים ברציפות.
  7. כאשר כל בקבוקון משלים 24 שעות ב 18 ° C, להעביר אותם ל 29 מעלות צלזיוס (Gal80 פעיל, Gal4 פעילים). זה יום 0, נקודת ההתחלה של הניסוי, כאשר tהוא transgenes ליזום הביטוי שלהם.
  8. להעביר את הזבובים לנקות בקבוקונים כל 2 ימים עד שהם מגיעים בימים 10 ו 20.
  9. כאשר הזבובים מגיעים לגיל הרצוי (1, 10, 20 ימים), לספור ולהעביר אותם מהמזון לתוך צלוחיות cryovials מראש שכותרת-באמצעות משפך קטן. לא להרדים את הזבובים. הפוך את הצלוחיות על הספסל.
  10. חכה 30 דקות על מנת לאפשר לזבובים להתאושש מההעברה (מתח), ואז תקפיא את הצלוחיות על ידי טבילה בחנקן נוזלי וחנות שבכותרת התיבה מראש, מראש מצוננת מקפיא זכור:. להקפיא את הזבובים באותו סדר הם הועברו לcryovial, עושים זמן בילה במדי cryovial פני דגימות.

2. אוסף וLyophilization ראשי Fly (בצע בחדר קר, טרום צינה כל הציוד, זהירות, חנקן נוזלי וקרח יבש)

מטרה: הפרדה מהירה, אוסף, וייבוש בהקפאה של רקמה.

  1. עאסםble מסננת (רשת הגדולה ביותר בחדר העליון לאסוף את הגופות, שנייה בגודלה בחדר תחתון כדי לאסוף את הראשים, מכסה על תחתית כדי לאסוף חלקים קטנים) וצינה מראש ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות.
  2. לאסוף 200 זבובים מcryovials ידי מקסם את התרומה של זבובים מקורם מאותו הבקבוק. כדי לפצות על הבדלים בין הזבובים שנאספו בבוקר או בערב, כך שכל מדגם משתמש יחס בוקר / הערב זהה (השתמשנו 47% בוקר / ערב 53%) הערה:. רנ"א הנובע משני מדגמים 100-ראש יכול להיות משולב מאוחר יותר כדי ליצור את המקבילה של 200 זבובים בלשכפל יחידה.
  3. צ'יל פיסת parafilm (~ 9 x 14 סנטימטרים) בקרח יבש למשך 5 דקות.
  4. רוקן את cryovials עם זבובים מלאים על parafilm, כמה בו זמנית; ספירת זבובים בעזרת מכחול, וחנות בcryovial אחר בקרח יבש עד שמגיע 100 זבובים.
  5. טובל את המסננת בחנקן הנוזלי, מוסיף את 100 זבובים לchamb העליוןאה. נער את המסננת נמרצות לדקות 1. לטבול אותו בחנקן הנוזלי שוב, ולנער לדקות 1.
  6. פתח את המסננת, לאסוף את הראשים מהחדר התחתון בmicrotube, והמקום ב-80 ° C.
  7. פתח את microtubes, לעטוף את הצמרות בparafilm, ולעשות חורים קטנים.
  8. מניח את הדגימות בlyophilizer למינימום של 2 ימים.

3. טיהור וחילוץ mRNA רנ"א סה"כ (פנק את כל המשטחים עם RNaseZap; כפפות משתנים לעתים קרובות)

מטרה: הומוגני רקמה על מנת למקסם את התשואה, לחלץ רנ"א כלל, ולטהר את ה-mRNA.

  1. הסר את הדגימות מהקפאת המייבש ולהוסיף שלושה כדורים קטנים, מעוקרים, פלדה שחיקה לכל microtube. מקום בGeno / מטחנות; לרוץ בשבץ 1500 / min דקות 1.
  2. פתח את הצינורות, להוסיף TRIzol 1 מ"ל, ואוטם את הצינורות עם parafilm. לטחון דק '1; להקיש על צינורות הפוכים כדי לסלק את כדורי הפלדה במידת צורך. טוחן דקות 1.
  3. לאחובצה את הצינור בנקודה זו (הצינור יהיה פריך). מעביר את התערובת (חוץ מכדורי הפלדה) לmicrotube חדש RNase חינם. גלולת הפסולת התאית בmicrocentrifuge שולחן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב12000 x גרם.
  4. העברת supernatant לmicrotube חדש. הוסף 0.1 כרכים של 1-bromo-3-chloropropane (BCP); לנער נמרץ במשך 15 שניות. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות. הספין בmicrocentrifuge ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב12000 x גרם הערה: פרוטוקולים רבים מיצוי RNA השתמשו בכלורופורם בשלב זה; BCP נועד למקסם את תשואת RNA על ידי הגדלת היעילות של הפרדת פאזות.. את הדגימות בשעת 4 מעלות צלסיוס במהלך צעד צנטריפוגה יהיה גם להגדיל את היעילות של הפרדת פאזות ולהפחית את הזיהום של חלבון והדנ"א הגנומי לשלב המימי.
  5. העבר את השכבה המימית העליונה לmicrotube חדש. לזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת 0.5 כרכים של isopropanol קר כקרח; מרחב זה שש פעמים למיילx. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. הספין בmicrocentrifuge ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב12000 x גרם.

הערה: בנוסף למתאושש רנ"א, חלבונים יכולים גם להפיק מהשכבה וinterphase האורגנית של TRIzol, ולכן ניתן לבצע שתי פרוטאומיקה וניתוחי transcriptomics באותן דגימות. למרות שאנו לא לבצע שלב זה בניתוחים שלנו, מיצוי TRIzol מניב ייצוג מצוין של חלבונים מסיסים וייצוג גדול יותר של קרום וחלבונים גרעיניים מאשר רוב עקירות חיץ / חומר ניקוי. לי וLo 17 לתאר הליך לחלץ חלבונים באמצעות TRIzol המתאים לניתוחי proteomics, כולל 2-D ג'ל וLC-MS/MS.

  1. הסר את supernatant. שטוף את הרנ"א על ​​ידי הוספת 1 מיליליטר אתנול קר כקרח (70% משתמשים במי DEPC טופל), ולערבב עם מערבולת קצרה. הספין בmicrocentrifuge ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב12000 x גרם.
  2. הסר את supernatant. אוויר יבש לגלולהלא 15 דקות לפחות. הוסף 80 μl של DEPC מים לרנ"א הגלולה ולמקם אותו ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השאר ב 4 ° C למשך הלילה.
  3. לקבוע את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. היחס של ספיגה ב260 ננומטר nm/280 צריך להיות בין 1.8 ו 2.1, עם 2.1 למצב אופטימליים.
  4. קח 30 RNA בתפזורת מיקרוגרם, להוסיף 4 U DNase, 60 U RNasin, חיץ תגובה 10x μl 10, ומי DEPC טופל להביא עד 100 μl נפח הכולל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. לטהר את RNA באמצעות ערכת מיני RNeasy. בצעו את הוראות היצרן, מלבד לבצע את כל centrifugations למשך 30 שניות וכוללים את כל השלבים "האופציונליים".
  6. לקבוע את ריכוז RNA באמצעות NanoDrop, ולהעריך את איכות RNA באמצעות "סך רנ"א הפיק" assay על BioAnalyzer.
  7. לטיהור ה-mRNA, להעביר 30 Dynabeads μl לצינור microfuge RNase חינם.
  8. הנח את הצינור במגנט ל1-2 דקות ולהסיר supernatant. Resuspend את החרוזים ב15 μl של הצפת כבילה למעסיק. חזור.
  9. החל עם 5 מיקרוגרם של רנ"א כלל, להתאים את עוצמת הקול עד 15 μl באמצעות DEPC מים. חום של 65 המעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ומניח על קרח.
  10. הוסף 15 μl של רנ"א המוחלט ל15 חרוזי μl מראש השטף. מערבב היטב על ידי pipetting כל 5 דקות למשך 30 דקות כדי לחשל את הרנ"א לחרוזים. מניח על המגנט ל1-2 דקות ולהסיר את כל supernatant.
  11. הוסף 35 μl של מיקס כביסת המאגר B. ידי pipetting הזהיר. הנח על המגנט ולהסיר את supernatant בזהירות. חזור על לשטוף פעמים.
  12. Elute mRNA על ידי הוספת 15 μl קר 10 mM טריס-HCl וחימום (pH 7.5) עד 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מייד למקם את הצינור על המגנט, להעביר את supernatant לצינור RNase-חופשי, ולהקפיא ב-80 ° C. לכמת כמו ב3.8). תשואה צריכה להיות ~ 1-5% של RNA בסך הכל.

עבור ניתוחי metabolomic, לבצע פרוטוקולי 1 ו 2), ולהמשיך ב4) להלן:

4. מתנול, כלורופורם אקסטרהction של מטבוליטים

מטרה: מטבוליטים קוטב והלא קוטביים נפרדים.

  1. הוסף חמצון butylated hydroxytoluene (BHT) לכלורופורם בריכוז של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​כדי למנוע אוטומטי חמצון של שומנים במהלך חילוץ. השתמש BHT-כלורופורם זה עבור כל השלבים הבאים.
  2. העברה 200 ראשים לתוך צונן, מראש שקל צינורות חרוטי פקק פוליפרופילן, בהקפאת -80 ° C, וlyophilize. לקבוע את המשקל היבש.
  3. שים חרוזי zirconia 5-7 בצינורות והומוגני בחרוז מקצף לשני מחזורים של 20 שניות כל אחת, לפי 800 הרץ.
  4. בהתבסס על המשקל היבש של הדגימה הכבדה ביותר, להוסיף מים, מתנול, וכלורופורם ביחסים הבאים: 11.74 x מתנול; 10.59 x מים; 11.74 x כלורופורם, כאשר x הוא המשקל הכבד ביותר במדגם גרם והמוצר הוא נפח במ"ל. הוסף כל מתנול כפי שמחושב ו45% ממים הכוללים לצינור מקצף החרוז המכיל את ראשי lyophilized.
  5. HomogeniZE ב- מקצף החרוז לשני מחזורים נוספים של 20 שניות כל אחת.
  6. שלב את הכרכים של כלורופורם (100%) ואת שאר המים (55%) בבקבוקון זכוכית חרוטה על קרח. ואז, להעביר את תערובת הרקמה (עם חרוזים) לבקבוקון הזכוכית. Shake למשך 10 דקות. דגירה במשך 10 דקות על קרח.
  7. הספין בצנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב2000 x גרם. הסר את השלב הקוטבי (העליון) עם פיפטה פסטר (להימנע מפלסטיק) ומקום בצינור microcentrifuge שני.
  8. שמור את השלב הלא הקוטבי (נמוך) בבקבוקון זכוכית קטן והקפאה ב-80 ° C. ייבוש בזרם של גז חנקן; לוודא שהצינור פועל ממכל החנקן הוא Tygon טוהר גבוה כדי למנוע plasticizers בתמצית.
  9. Rehydrate השלב הלא הקוטבי עם כלורופורם deuterated 620 μl. העברת 600 μl לתוך צינורות NMR שכותרת. חנות בהוכחת הפיצוץ ° C מקפיא -80.
  10. הנח שלב קוטב בCentrivap ולרוץ עד שהצינור יבש לחלוטין של 30 ° C (~ 7 שעות).
  11. דנ"אydrate השלב הקוטבי עם חיץ 620 μl 0.1 מ 'נתרן פוספט (pH 7.3) בתחמוצת דאוטריום עם 1 מ"מ TMSP [3 - (trimethylsilyl) propionic-2 חומצת ,2,3,3-D4] כתקן פנימי. מערבולת למשך 30 שניות. הספין בmicrocentrifuge ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב10000 סל"ד לפיגמנטים משתמע ומולקולות גדולות אחרות, שמפריעים לספקטרום NMR. העברת 600 μl של supernatant לצינורות NMR שכותרת.

Representative Results

כדי לעקוף את הקטלניות הנגרמות על ידי ביטוי בכל מקום של Atxn3 המורחב תחת שליטתו של דה-Gal4, הציג רגולציה זמנית של Gal4 עם Gal80 ts. אבל לפני שימשיך באיסוף וההקפאה של מספר גדול של זבובים, רציתי לקבוע את דינמיקת הביטוי של transgene תחת השליטה של Gal80 ts ודה-Gal4. לשם כך, יצר את הצלבים, השאיר צאצאים בגיל 18 מעלות צלזיוס, אספנו את הזבובים הבוגרים, ושמרתי עליהם במשך 24 שעות בגיל 18 ° C. לאחר מכן, הצבנו את הזבובים בטמפרטורה המגבילה (29 ° C) ודגרנו עבור 0, 6, 12, 24, 36, 48, ו 72 שעות. בשלב בא, שזיהינו הצטברות של אלל polyQ המורחב על ידי כתם מערבי מזבובים בודדים לאחר 10 פרוטוקולים שפורסמו. ביטוי זוהה ראשון, אבל 6 שעות קלושות לאחר שינוי הטמפרטורה והמשיכו להגדיל עד 48 שעות, כאשר זה הגיע לרמות רוויה (איור 2 א). Interesמדגדג, להקת משקל מולקולרית גבוהה של polyQ המסיס הופיעה לאחר 48 שעות, מסמנת את משך הזמן שלוקח לחלבון ליצירת אגרגטים גדולים. אנחנו גם נתחנו את מוחם לטוס בכל נקודת זמן כדי לקבוע חלוקת אלל polyQ המורחב ידי immunofluorescence (איור 2 ב '). החלבון התגלה לראשונה לאחר 24 שעתי משמרת הטמפרטורה, למרות שעם חלוקה לא שווה. בין 24 ו 48 שעות ברמות של חלבון המשיכו לעלות, מה שהופך מוח כמה מרכזים בבירור, כולל אונות מחושים ואת תחזיות גוף הפטרייה (איור 2 ב '). בין 48 ו 72 שעתי הביטוי של אלל polyQ המורחב הגיע לרמות מקסימליים, מה שמרמז שGal4 המערכת הופעלה באופן מלא בשלב זה. בהתבסס על תוצאות אלו, בחרו 24 שעות לאחר שינוי הטמפרטורה כנקודת הזמן הראשונה (יום 1) לניסויים באים. האוספים של זבובים 10 ו 20 ימים עבר נמדדו גם החלו משינוי הטמפרטורה (ti0), שהוא הזמן שבו מתחיל בניסוי הביטוי החדש של transgenes פתוגניים ושליטה.

ברגע שוידאנו שAtxn3 זוהה לאחר 24 שעות תחת השליטה של Gal80 ts ודה-Gal4 ב29 ° C, תהו אם הזבובים האלה היו מראים סימנים של ניוון מוחיה במשך 20 ימים. מאז זבובים אלה מתחילים לבטא את החלבונים פתוגניים כמבוגרים, אנו חוששים שאולי הם צריכים זמן דגירה ארוכה כדי להראות פנוטיפים ניווניות. כדי לקבוע את הרעילות של Atxn3-78Q בתנאים אלה, אספו זבובים מבטאים LacZ, Atxn3-27Q, וAtxn3-78Q, ונרשם תוחלת החיים שלהם. בעוד זבובים מבטאים LacZ וAtxn3-27Q מוצג מעל כדאיות 90% לאחר 20 ימים, טסו להביע Atxn3-78Q הראה הישרדות נמוכה ביום 20 (30%) (איור 3). למעשה, Atxn3-78Q זבובים החלו למות ביום 10 (7% תמותה) וביום 15 בהפסד היה משמעותי (20%), שהואץ ב5 ד האחרוןays. לפיכך, תוצאות אלה מצביעות על כך שהביטוי בוגר של גן פתוגניים הביא קיצור תוחלת חיים, סימן מפתח של פנוטיפים ניווניות הנגרמים על ידי Atxn3-78Q.

אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה היה הטיפול ושימור של דגימות לאחר ההקפאה כדי להבטיח את האיכות של החומר שחולץ. אנו חילוץ בין 15-80 מיקרוגרם של רנ"א סך כל 200 ראשים (תלוי בגיל וגנוטיפ) לפני טיפול DNase פי NanoDrop. כשליש (6-25 ק"ג) התגלה כרנ"א הטהור ביותר לאחר טיפול DNase על ידי היחס של ספיגה ב260 nm/280 ננומטר. עם זאת, מצא שהדרך הטובה ביותר לקבוע את איכותו של רנ"א להכנת ספריות cDNA לRNA-seq הייתה לנתח רנ"א כלל על BioAnalyzer. למרבה המזל, רק כמות קטנה של RNA (5 ng) שמשה בBioAnalyzer, כך שזה לא ישפיע על היכולת לייצר מספר ספריות לדגימה. כדוגמה, רצנו שתי דגימות בסך הכלרנ"א לפני טיפול DNase על שבב BioAnalyzer, אחד מהם חשוד בלהיות מושפל (איור 4A-C). האיכות הגבוהה רנ"א (מדגם 1) מיוצר שלוש להקות חדות RNA, שתי ממש מתחת 2000 נוקלאוטידים (NT) בגודל קטנה יותר ולהקה מתחת ל 200 NT, המייצגות את RNAs ריבוזומלי (איור 4 א). שתי הלהקות כ -2,000 nt מתאים ל18S rRNA (שיא קטן יותר) ושני שברים מ-28 rRNA (שיא גדול יותר), שהוא היבט ייחודי של rRNA ביולוגיה בדרוזופילה (ראה איור 4 ב). תכונות אלה נצפו גם בעקבות BioAnalyzer (איור 4 ב). לעומת זאת, מדגם RNA מושפל (לדוגמה 2) לא הניב פסגות החדות של RNAs ריבוזומלי, וצבר להקות מרובות של פחות מ 500 NT (איור 4 א). התפלגות גודל זה להבחין בקלות בעקבות BioAnalyzer (האיור 4C), שבו פסגות רחבות של גודל קצר יותר שנקבעו. חשוב גם לציין wכהפרש ביחידות של ציר y בין שתי דגימות רנ"א, אשר הדגימו כי המדגם המושפל היה פחות רנ"א. RNA רק מציג איכות מקסימלית (יחס NanoDrop של ספיגה ב260 ננומטר nm/280 בין 1.8 ו 2.1, עם 2.1 מצב אופטימלי, ראה צעד פרוטוקול 3.8) ישמש לדור של ספריות.

עבור החילוץ של מטבוליטים, עקבו מים / מתנול / כלורופורם (2.0:2.0:1.8) 3 הליך פיצול החילוץ לשני שלבים על מנת למקסם את המיצוי של מטבוליטים שני קטבים ולא קוטב 35 קלסיים. לאחר שהפריד את השלבים קוטביים ולא קוטביים, אנו מחדש אותם במים או deuterated deuterated כלורופורם, בהתאמה, והוספנו תקנים פנימיים לניתוח על ידי תמ"ג. NMR ספקטרום המתקבל באמצעות שיטת חילוץ זה נפתר היטב עם קווי בסיס שטוחים וקווים צרים (איור 5), המציינת את הטיהור של תמציות באיכות גבוהה, מתאימה הוא לפרופיל המטבוליד זיהוי של מספרים גדולים של מטבוליטים. האיור 5 מראה את זיהוי של כמה פסגות מתאימות למטבוליטים שופעים מאוד, כגון גלוקוז וסוכרוז, ושתי חומצות מטבוליות מפתח, חומצת חלב ויצטטו בולטות, על פי משמרות כימיות בספרות 7. השינוי הכימי (חלקים למיליון) מייצג אלקטרומגנטית מיגון של מולקולה ביחס למולקולה סטנדרטית (TMS, השיא ראשון מימין). עוד shieldedmolecules יש צפיפות אלקטרונים גבוהה יותר סביב הגרעין ויופיע בצד הימין של הספקטרום, כולל alkyls. מולקולות Deshielded כגון אמיד ומימנים ארומטיים תופענה בצד השמאל של הספקטרום. החלק האמצעי העסוק (ppm 3-4) מועשר למולקולות סוכר.

איור 1

איור 2
איור 2. קינטיקה ביטוי () כתם מערבי מראה ביטוי Atxn3-78Q (Gal80 ts; DA-Gal4 / כטב"מ-Atxn3-78Q). בזבובים הגו ב29 ° C 0-72 שעות. להקה קלושה הוא זוהה לראשונה ב6 שעות והרוויה תושג על ידי 48 שעות אחרי גיוס. (ב) immunofluorescence של מוח שלם באותם זבובים. המוח נותחו, קבוע,ד מוכתם עם נוגדן שמזהה את חלבון polyQ המורחב. החלבון הוא זוהה לראשונה בגוף תחזיות פטריות (MB) ואת אונות מחושים (AL). בין 48 ועד 72 שעות, מגיע לרמות הביטוי מרביים וחשוף ביותר במרכזים במוח עם עצבוב בשפע. רמת הביטוי לנוירון חלשה כפי שהם נראים באונה האופטית (OL), למעט בכמה תאי עצב גדולים בין OL והמוח המרכזי.

איור 3
איור 3. Atxn3-78Q מקטין את תוחלת חי זבובים להביע LacZ, Atxn3-27Q, וAtxn3-78Q ubiquitously בשלבי בוגרים (Gal80 ts; da-Gal4). נוטרו לאריכות ימיהם ב29 ° C. זבובים להביע LacZ (כחול) וAtxn3-27Q (ירוק) הראה רמות נמוכות של תמותה ביום 20. לעומת זאת, טס להביע Atxn3-78Q (אדום) מוצג תמותה ניכרת החל ביום 10. על ידי 15 יום הם הראו הפחתה של 20% ביכולת קיום, שהואץ בחמשת הימים הקרובים, והגיע לתמותה 70% ביום 20.

איור 4
איור 4. הערכת RNA איכות. רנ"א מאיכות גבוהה ודגימות מושפלות הייתה לרוץ על שבב BioAnalyzer. () BioAnalyzer לרוץ עם איכות גבוהה רנ"א (מדגם 1) וRNA מושפל (לדוגמה 2) ליד סמן גודל (נתיב שמאלי). שים לב השלוש הפסגות המתאימות לרנ"א ריבוזומלי במסלול המרכזי החדות. (ב) BioAnalyzer להתוות לי מדגם 1, עם שני שיאים חזקים אופייניים ממש מתחת 2000 nt ועוד מתחת ל 200. (ג) BioAnalyzer התחקות למדגם 2, אשר מורכב בעיקר RNA המושפל. שים הלב להיבדל ביחידות על ציר y בין הפנלים B ו-C.

s = "jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 5
איור 5. ספקטרום נציג 1D NMR של מטבוליטים קוטב. ספקטרום הנציג 1D פרוטון NMR של מטבוליטים קוטב מדרוזופילה והמשלימה 2D קוזי (המתאם ספקטרוסקופיה) וHSQC (מתאם קוונטים בודד heteronuclear) ניסויים למשימת שיא. מטבוליטים מזוהים לפי כימי ידוע משמרות-1: סוכרוז; 2: גלוקוז; 3: Beta-אלאנין; 4: יצטט; 5: קטט.

Discussion

בונים על הניסיון הקודם שלנו ב11 transcriptomics, 12, חילוף חומרים של 15, ומחלות ניווניות 6, 8, אנו מציגים כאן פרוטוקול חדש לאיסוף אלף ראשי זבוב עם ביטוי מבוגר ספציפי של גני מחוללי מחלות, וmRNA טיהור ומטבוליטים לRNA- seq וספקטרוסקופית NMR, בהתאמה. הטבע של ניסויים אלה נדרש שילוב של מספר חידושים לפני האוסף לטוס, כולל מבחר של Gal4 קו בכל מקום והשימוש בתקנה זמנית של ביטוי גנים. לגבי ביטוי Gal4, בכל מקום מtransgenes היה מכריע משתי סיבות. ראשית, מספר גדול של גני המעורבים במחלות ניווניות, כולל ATXN3, huntingtin, חלבון מבשר עמילואיד, וSuperoxide dismutase 1, בין יתר, באים לידי ביטוי באופן נרחב בתאי עצב וגליה, כמו גם בסוגי תאים אחרים מחוץ למערכת העצבים. רצינומודל נכון היבט זה של הביולוגיה של גני מחוללי מחלות אלה על ידי ניתוח ההשלכות של ביטוי בכל מקום, במקום להתמקד רק בביטוי עצבי. שנית, זה לא ריאלי לאסוף מוחות לטוס במספרים גדולים, אבל אנחנו יכולים לעשות זאת עם ראשי זבוב (מעל 200 בשלושה עותקים לכל מצב) 11, 12. מאז הומוגניזציה של ראשים שלמים מתערבבת רקמות עצביות ולא עצביות, ביטוי transgene כל מקום הופך להיות קריטי לקבלת רנ"א ומטבוליטים אחידים מאוכלוסיות של תאים המבטאים את אותם גנים המושתלים. חשוב לציין כי דה Gal4 נבחר להפצה שלה די אפילו, לא בגלל רמת הביטוי הגבוהה שלה, למרות שהדו"ח אחרון שהציע דה Gal4 לא יכול להיות לגמרי בכל מקום 25. היינו לנו קודם לכן נחשבים Gal4 קווים בכל מקום אחרים, כולל זרוע, אמבטיה, והחוק-Ga4, אבל כולם הראו דפוסי ביטוי מורכבים במערכת עצבים מרכזיים ושרירים למבוגרים, מה שהופך אותם פחותdequate למחקר זה. למעשה, immunofluorescence במוחות בוגרים הראה כי דה Gal4 גורם ביטוי נפוץ אך חלש, שצבר רק ברמות גבוהות במרכזים במוח המורכבים מכמה אלף אקסונים ובכמה תאים עצב גדולים (איור 2). למרות שרמות הביטוי של המבנים היו נמוכות, תנאים אלה צומצמו באופן משמעותי הישרדות באופנה polyQ תלויה. דינמיקת ביטוי זה מלא את הצרכים שלנו, תוך שמירה על רמות נמוכות ביטוי, מה שהיו חשוב להתבוננות בשינויים האיטיים וההדרגתיים הסלולריים המושרים על ידי חלבוני neurotoxic.

תוצאה צפויה של גרימת ביטוי נפוץ של חלבוני neurotoxic הייתה שזה גרם קטלני לפני eclosion המבוגר. למרבה המזל, היה סיבוך זה עקף עם השימוש בGal80 ts. כאמור לעיל, הגיע לרמות ביטוי גנים מקסימאליים כ 48 שעות לאחר שינוי הטמפרטורה, המשתלב היטב עם הזמן fraשלי הניסוי. יתרון נוסף של שימוש באחד Gal80 ts היה כי, בניגוד לניסויים שבו באים לידי ביטוי חלבוני neurotoxic constitutively הפאן עצבי, לא היה שום ביטוי במהלך ההתפתחות של מערכת העצבים. לפיכך, השימוש בGal80 ts יצר רקע "נקי" שבו מערכת העצבים לא נחשף לפעילות הרעילה של חלבוני neurotoxic אלו במהלך שלבי התפתחות רגישים. לדעתנו, הפעלה של ביטוי גנים במבוגרים הביאה למודל טוב יותר לסוג כזה של פתולוגיות מבוגרי התפרצות. עם זאת, Gal80 ts הציג גם כמה סיבוכים הקשורים לשינויי הטמפרטורה. אחד מהם היה שזבובים גדלו בטמפרטורות נמוכות (18-20 מעלות צלזיוס) עכבו את מחזור החיים, מה שהופך את הניסויים באופן משמעותי יותר. כמו כן, זה ידוע שזבובי גידול בטמפרטורות גבוהות (29-31 מעלות צלזיוס) מאיצים את חילוף החומרים שלהם, כפי שהומחש על ידי קיצור תוחלת החיים בהשוואה לזבובים בגילי 25 ° C. סיNCE יבוצעו מחקרי התעתיק וטבולים בזבובים בגילים בטמפרטורה גבוהה, אנו יכולים לצפות לראות שינויים חשובים במסלולי מתח סלולריים וחילוף חומרי אנרגיה. זו הסיבה שזה היה כל כך קריטי להציג שני פקדים לניסוי, אחד עם-פתוגניים אינם Atnx3-27Q ושליטה שאינה קשורה להביע LacZ. פקדים אלה יספקו בסיס לביטוי גנים ושינויים מטבוליים הקשורים לטמפרטורה גבוהה, כדי שנוכל לזהות את אותם שינויים המקושרים ישירות לביטוי של Atxn3 הרעיל. בסך הכל, יש לנו הצגנו כמה שינויים באוסף של זבובים המספקים יתרונות רבים - וכמה חסרונות (בעיות הטמפרטורה והסעיף הבא) - ללימוד מבוגר התפרצות מחלות, נאורה.

למרות שההסדרה הזמנית עם Gal80 ts הייתה תוספת מועילה, הוא גם הציג סיבוך בלתי צפוי. תוך יצירה את הזבובים שנשאו הן Gal80 tsnd-Gal4 da מבנים במניות יציבות, הבחינו שטס כפליים הומוזיגוטים לשני המבנים היו קיימא אך עקרים. מאז הומוזיגוטים Gal80 ts וGal4 da זנים היו קיימא ופורים בעצמם, אין זה ברור מדוע שילוב מוצג פוריות נמוכה. זה כבר ידוע מזה זמן כי Gal4 הוא מעט רעיל לרקמות תסיסנית 22. זה אפשרי, אם כן, שהביטוי של Heterologous Gal80 repressor שמרי התעתיק תרם לרעילות של Gal4 ידי הפרעה, באופן פוטנציאלי, במכונות בתעתיק אנדוגני. רעילות זו עשויה להחריף הפצה בכל המקום של Gal4 תחת שליטתו של דה, גן שמשחק תפקיד מפתח בהתפתחותו המוקדמת ונחישות מינית. ללא תלות בגורמים הבסיסיים של העקרות, הרחיב Gal80 ts; da-Gal4 זבובים על ידי שמירת איזון כרומוזום על דא Gal4 תוך שמירה על הוmozygosity לGal80 t S, טוען כי Gal4 הוא תורם קריטי יותר לעקרות. פתרון זה היה מפתח כי אנחנו משמשים מאה הגברים האלה כל שבוע שני לעבור עם כל אחד מהגנים המושתלים כטב"מ. עם זאת, חוצה ביצוע איזון שנוצר בעבודה נוספת במהלך הבחירה של הצאצאים המתאימים. רק רבע (25%) של הצאצאים נאסף (נקבות, שאינו איזון), שהוסיף זמן בחירה, הקטין את התשואה לבקבוק, והגדיל את מספר הבקבוקים הדרושים כדי להשיג לפחות 200 זבובים לגנוטיפ / לשכפל / שעה נקודה. בסך הכל, למרות שהאוסף של זבובים הפך לארוך זמן רב בשל את הקבוצות הגדולות הדרושות, ואנו בטוחים כי לימוד שינויים תאיים רק כמה שעות לאחר הפעלת הביטוי של גנים פתוגניים ubiquitously יזהה תהליכים חדשניים ומעניינים שהיה מעורבים באיבוד עצבי פרוגרסיבי.

לאחר השלמת התכנון הגנטי היה במקום, שלם תשומת לב מיוחדת למניפולציה שיכולה להציג את השונות ביולוגיות. ראשית, אנו נאספים רק נקבות בתולות כדי להבטיח האחידות של הדגימות, למרות שזה אמור לזרוק את הזכרים ובדיקת הצאצאים פעמים ביום. במהלך הזדקנות, לא יותר מ 12 זבובים הוחזקו באותו הבקבוקון כדי למנוע צפיפות ולחץ. כמו כן, לפני ההקפאה, זבובים הועברו לcryovials ללא הרדמה והורשו להתאושש מההעברה למשך 30 דקות. הגורמים לכאורה הפעוטים הללו יכולים להשפיע על ביטוי גנים וחילוף חומרים, מציגים השתנות בסופו שלא יהיה רלוונטי לניסוי.

כדי להבטיח את איכות החומרים הקפואים (ראשים, RNA, ומטבוליטים), שלם תשומת לב מיוחדת לכל פרט שיכול לתרום לניוון רקמות. מאז זבובים מועברים לcryovials במספרים קטנים (עד 12 זבובים לבקבוקון), היה לנו לאחזר רבים בקבוקונים לאוסף של 200 ראשים. מניפולציות אלה היו דאחד עם זהירות רבה בחדר קר עם קרח יבש וחנקן נוזלי. האוסף של זבובים, הפרדה של ראשים, וטיהור של מולקולות מידע הוא יותר מדי זמן רב כדי לגלות כי החומר היה מושפל בסוף התהליך הארוך הזה. בנוסף להבטחה כי החומר שומר על איכותו, פרוטוקול זה מתאר מספר צעדים למקסם את התשואה של רנ"א ומטבוליטים, כוללים ייבוש בהקפאה ומכות חרוז. צעדים אלה אינם נדרשים לעקירות רגילות לRT-PCR או כמותית PCR מזבובים שלמים, אבל הם קריטיים לטיהור עקבית מדגימות קטנות כגון ראשי זבובים. אנחנו קבענו שצעדים אחרים משפיעים על התשואה של רנ"א. למשל, זבובים מבוגרים מיוצרים באופן משמעותי פחות מאשר רנ"א זבובים צעירים יותר, ללא קשר לגנוטיפ. תצפית זו רמזה שתהליך הזדקנות בטמפרטורה גבוהה גורמת לשינויים דרמטיים. כמו כן, לחילוץ מרנ"א 100 ראש היה דווקא יעיל יותר מ200 ראשים, אז המשיך לטהר ב2 בatches של 100 לדוגמה, רק כדי לשלב אותם לאחר אימות של איכות עם BioAnalyzer. כמו כן, עמודות לטיהור mRNA נראות להרוות בקלות, כך שהכמות של RNA כלל משמשת לעמודה צריכה להיות מותאמת.

מטבוליטים הם תמהיל מגוון של מולקולות קטנות, ולכן בקרת איכות היא יותר קשה מאשר עם DNA, RNA או חלבונים. למרבה הצער, אין קטלוג מלא של מטבוליטים לכל מודל חיה בשלב זה, משהו שיכול להיות שינוי בכמה השנים הבאות הודות ליישום של כמה חידושים טכנולוגיים, כולל ספקטרוסקופית NMR והרחבת השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית - המוני ספקטרומטריית ( LC-MS). למרות NMR הוא פחות רגיש מטרשת נפוצה, זה מראה יתרונות מבטיחים רבים, כולל לא הרס של דגימות, אין נהלים אנליטיים המציגים הטיה (LC), ושחזור גבוה המאפשר השוואה סטטיסטית של חזרות וכמה תנאי ניסוי 24. כך, לדוגמא יכולה להיותהערכה מחדש כדי לוודא תצפיות או מחדש נותחה על ידי-LC-MS לאימות נתוני NMR. הנה, הראו נתוני תמ"ג ראשוניים מזבובים שאנו משתמשים כדי להדר קטלוג של מטבוליטים בדרוזופילה. מידע זה יהיה קריטי לקביעת אופן הביטוי של גנים פתוגניים משנה חילוף חומרים תקין, פתיחה של חלון חדש כדי לקדם את הבנת המנגנונים התאיים העומדים בבסיס מחלות ניווניות.

טכנולוגיות חדשות בomic מתעוררת מציעות את ההזדמנות הטובה ביותר ללמוד מחלות ניווניות ברמת הפירוט שלא הושג בעבר. אולי המכשול הגדול ביותר להתגבר על המחקרים בתפוקה גבוהה האלה הוא האוסף של דגימות לשעתק הנאמן שיכול להיות מנותחות בשיטות רגישות מאוד. הנהלים הציגו כאן מספקים דרך להשיג עקביות זו, ויובילו לתוצאות שניתן להשוות בקלות על מערכי נתונים. למרות שתחומי המחקר העיקריים שלנו היו כרוכים בשינויים שבחנו של גן מפורשיון ומטבוליטים, את הזבובים שנוצרו יכולים גם להיות נתונים לניתוח proteomic או epigenomic. שינויי proteomic וepigenomic מתרחשים במהלך ניוון מוחיה הם גם עשויים להיות בעלת חשיבות עליונה לתהליך המחלה. כשהקהילה המדעית סופו של דבר מזהה את הספקטרום המלא של שינויים מולקולריים המשפיעים על תהליך המחלה, הבנה ברמת מערכות אמיתית של המחלה תהיה אפשרית. ברמה זו, טיפולי מחלה modifying-יהיו סוף הסוף להתגלות כמציאות.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לג'ניס סנטיאגו, גבריאל פיגרואה, וחוסת הררה לקבלת סיוע טכני ובלומינגטון תסיסנית מניות המרכז באוניברסיטת אינדיאנה למניות זבוב. ד"ה וCW נתמכו על ידי כספים מNSF-IOS-1051890. PF-F וLMM נתמכו על ידי קרן הזנק הזדמנות מאוניברסיטת פלורידה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jazz mix Drosophila food Fisher Scientific AS-153
Cryogenic Vials Corning, Inc. 430658
Microtubes Axygen MCT-175-C-S
RNaseZap Ambion AM9786 Treat all surfaces
5/32" grinding balls, stainless steel OPS Diagnostics GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-bromo-3-chloropropane Sigma B9673-200ML
Isopropanol Fisher Scientific A416-500
DEPC-treated water Fisher Scientific BP561-1
DNase I Promega M6101
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification kit Invitrogen 610-06
Conical Screw Cap Tubes Fisher Scientific 02-681-344
Screw Caps w/O-Rings Fisher Scientific 02-681-364
2.0 mm Zirconia beads BioSpec Products 11079124zx
Methanol, HPLC-grade Fisher Scientific A4524
Chloroform, HPLC-grade Acros organics AC39076
Drosophila Stocks
da-Gal4 Bloomington Stock Center 5460
Gal80[ts] Bloomington Stock Center 7108
UAS-MJD-27Q Bloomington Stock Center 8149
UAS-MJD-78Q Bloomington Stock Center 8150
UAS-LacZ Bloomington Stock Center 8529
Equipment
Inject+Matic Sleeper INJECT+MATIC
Microsieve Set Fisher Scientific 3410531 Use two largest meshes
Geno/Grinder 2000 SPEX Sample Prep SP2100-115
Sorvall Legend Microcentrifuge ThermoScientific 75002436
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System LabConco 7670041
BioAnalyzer v. 2.6 Agilent 2100
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 123-21D
NanoDrop spectrophotometer ThermoScientific
Fast Prep bead-beater ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Plus Labconco 022820001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
  3. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  4. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  5. Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
  6. Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
  7. Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  8. Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
  9. Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
  10. Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
  11. Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
  12. Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
  13. Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
  14. Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
  15. Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
  16. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
  17. Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
  18. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
  19. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  20. Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
  21. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
  22. Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
  23. Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
  24. Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
  25. Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  26. Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
  27. Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  28. Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
  29. Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
  30. Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
  31. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
  32. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  33. Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
  34. Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
  35. Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).

Tags

גנטיקה גיליון 73 ביוכימיה ביולוגיה מולקולרית נוירוביולוגיה מדעי המוח Bioengineering ביולוגיה תאית אנטומיה מחלות ניווניות Assay הביולוגי דרוזופילה זבוב פרות הפרדת הראש טיהור mRNA RNA DNA cDNA תמלילים מטבוליטים משכפלת SCA3 ניוון מוחיה NMR ביטוי גנים מודל חיה
טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, K., Sanchez-Garcia, J.,… More

Jensen, K., Sanchez-Garcia, J., Williams, C., Khare, S., Mathur, K., Graze, R. M., Hahn, D. A., McIntyre, L. M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads. J. Vis. Exp. (73), e50245, doi:10.3791/50245 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter