Summary
Vi beskriver här de förfaranden för extraktion och rening av mRNA och metaboliter från
Abstract
Under det senaste årtiondet har vi försökt förstå de molekylära och cellulära mekanismer av neuronal degenerering med Drosophila som en modell organism. Även fruktflugor ger uppenbara experimentella fördelar har forskning om neurodegenerativa sjukdomar förlitat mestadels på traditionella tekniker, inklusive genetiska interaktion, histologi, immunofluorescens och protein biokemi. Dessa tekniker är effektiva för mekanistiska, hypotes-drivna studier, vilket leder till en detaljerad förståelse av den roll som enskilda gener i väldefinierade biologiska problem. Emellertid, neurodegenerativa sjukdomar är mycket komplexa och påverka flera cellulära organeller och processer över tiden. Tillkomsten av ny teknik och omik ålder ger en unik möjlighet att förstå de globala cellulära störningar bakom komplexa sjukdomar. Flexibel modell organismer såsom Drosophila är idealiska för anpassning av dessa nya tekniker på grund av deras starka Annottion och hög spårbarhet. En utmaning med dessa små djur, är dock rening av tillräckligt informativa molekyler (DNA, mRNA, protein, metaboliter) från mycket relevanta vävnader såsom flyga hjärnor. Andra utmaningar består av att samla in ett stort antal flugor för experimentell replikat (kritisk för statistisk robusthet) och utveckla konsekventa förfaranden för rening av hög kvalitet biologiskt material. Här beskriver vi förfaranden för insamling tusentals flyga huvuden och utvinning av avskrifter och metaboliter att förstå hur globala förändringar i genuttryck och ämnesomsättning bidrar till neurodegenerativa sjukdomar. Dessa förfaranden är skalbar och kan användas för att studera proteomik och epigenomic bidrag till sjukdom.
Introduction
Under det senaste århundradet har Drosophila visat sig vara ett ovärderligt laboratorium verktyg för att undersöka djupa biologiska frågor, framför allt i utvecklingen, cellbiologi, genetik och neurobiologi 1. Orsakerna till denna framgång är att fruktflugor är lätta att manipulera, har ett ständigt växande verktygslåda 18, 21, 31, och har en relativt enkel genomet med hög kvalitet anteckning 26. Dessa tekniska fördelar, i kombination med uppfinningsrikedom och ständig innovation inom flyga samhället, har lett till stora vetenskapliga bidrag, vilket illustreras av tilldelningen av tre Nobelpris (1933, 1995, 2011). På senare tid har Drosophila blivit en relevant modell för att studera mänskliga sjukdomar, främst störningar i utvecklingen, medfödd immunitet, cancer och neurodegeneration 2. Vi är särskilt intresserade av att upptäcka den cellulära och molekylära grunden för neurodegenerativa sjukdomar. Dessa komplexa och olika samnditions är kopplade till församlingar, eventuellt lösliga oligomerer, av onormalt vikta proteiner och därför lätt modelleras i flugor. Alla de stora neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros, flera ataxier, tauopatier, prionsjukdomar, och andra sällsynta störningar, har modellerats i flugor under de senaste femton åren 23. Fly laboratorier har bidragit till förståelsen av dessa sjukdomar främst genom att utnyttja framgångar i Drosophila genetik för att identifiera nya gener som är inblandade i neurotoxicitet av patogena proteiner. När nya gener som är relevanta för neurotoxiska kaskad identifieras, deras effekter normalt analyseras genom traditionella metoder, inklusive histologi att konstatera mönster av degenerering, immunofluorescens att bestämma protein distribution och cellulär patologi, och biokemiska analyser för att bedöma mängden och typen av onormala proteiner konformationer . Slutligen, Behavioral analys fungerar som en funktionell avläsning av sjukdomar resultat. Dessa väletablerade tekniker har utnyttjats för att undersöka bidraget av en eller ett fåtal gener kandidat till sjukdomen, inbegripet oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion 13, transkriptionell dysreglering 9, 27, 30, avvikande axonal transport och synaptisk aktivitet 14, onormal RNA biologi 9, hindrade oreglerad cellsignalering 29, ER dyshomeostasis 6, cellulär proteostasis 33, och många andra 23. Det är dock inte klart hur dessa toxiska proteiner kan störa samtidigt med flera sammankopplade vägar, är det den temporala sekvensen av dessa förändringar, och vad är det relativa bidraget från varje väg till patogenes. Årtionden av forskning inriktad på enstaka gen har hypotesen drivna strategier i både människor och djurmodeller har lett till en ofullständig, förbryllande bild av de cellulära mekanismer som orsakarneurodegenerering. Den nuvarande bristande förståelse av de exakta mekanismerna genom vilka dessa toxiska proteiner aggregat orsakar neuropatologi är en viktig begränsning för utvecklingen av sjukdomsmodifierande terapier.
Vi är nu intresserade av att tillämpa nya metoder för att förstå hur dessa patogena proteiner inducerar globala cellulära störningar. Tillkomsten av omik eran tillåter den djupa sondering av komplexa biologiska problem med hjälp av avancerade teknik med hög kapacitet, vilket kan leda till effektiva sjukdom behandlingar i en nära framtid. Genuttryck (transkriptomik) studier etablerades efter slutförandet av flera genomet sekvenser, eftersom högkvalitativ anteckningar kan förutsäga de flesta utskrifter. Den senare tillämpning av nästa generations sekvensering för utskrift analys (RNA-seq) har gett nya fördelar och möjligheter jämfört med mikroarrayer, inklusive en objektiv metod, förbättrad kvantitativ räckvidd och reducerad kostnad 32.Vi vill utnyttja fördelarna med RNA-seq för att bättre förstå den vanligaste formen av dominant ärftlig ataxi, spinocerebellär ataxi typ 3 (SCA3) eller Machado-Joseph sjukdom. SCA3 är en monogena, dominant sjukdom med full penetrans, som orsakas av en CAG trinukleotid expansion i Ataxin3 genen (ATXN3) 16. Denna mutation leder till produktion av Atxn3 protein med en lång polyglutamine (polyQ) spår som gör det benäget att aggregera. Eftersom mutant Atxn3 är neurotoxiskt agent i SCA3 ansvarig för alla sjukdomsrelaterade störningar, är detta en idealisk sjukdom för att tillämpa de nya miska metoder. Dessutom var SCA3 en av de tidigaste neurodegenerativa sjukdomar modelleras i flugor 34.
Medan införa förfaranden för att samla in stora mängder fly huvuden för RNA-seq, insåg vi att vi kunde använda samma material för att utföra globala studier av andra informativa molekyler. Bland annat nya disciplinjer, proteomik, Epigenomics och metabolomik tillåta undersökning av cellulär patologi på ett djup som inte tidigare uppnåtts, men inte utan utmaningar. I motsats till mRNA är katalogen av proteiner och metaboliter ganska ofullständig vid denna tid på grund av den ökade svårigheten att förutse alla tänkbara splitsningsvarianter och ännu mer gåtfulla ursprunget till alla normala och patogena metaboliter. Stora ansträngningar pågår för närvarande för att katalogisera proteiner i många organismer och sjukdomstillstånd. För detta ville vi fokusera på bidrag förändrade metaboliter till SCA3 patogenes med en enkel organism, såsom Drosophila. Detta är ett relativt nytt och lovande område, särskilt det nyligen införda kärnmagnetisk resonans (NMR), som ger hög reproducerbarhet och inte förstör proverna 5, 24. Vi föreslår att metabolit profilering kan bidra till att identifiera biomarkörer och sjukdomsmekanismer inblandade i neurodegeneratipå.
En viktig faktor med dessa miska projekt är att de kräver stora, enhetliga prover (200 flyga huvuden) samt exakta reningstekniker för att minimera experimentell variation. Vi började samla flugor efter rutiner som vi hade använt tidigare för mikromatriser och används även nyligen för RNA-seq 12. Men vi stött snart ett antal problem i samband med misexpressing de SCA3 konstruktioner. Först var vi tvungna att välja en Gal4 drivrutin för dessa experiment 4, där målvävnaden för analys var hjärnan. Det självklara valet skulle vara en pan-neural förare sedan SCA3 är en hjärnsjukdom. Men eftersom vi har för avsikt att samla mRNA och metaboliter från hela huvuden, skulle detta alternativ ger blandat material från vävnader uttrycker och icke-uttryckande konstruktionerna. För att generera homogena prover där alla celler uttrycker konstruktionerna, beslutade vi att använda en svag men allestädes närvarande driver linjen, daughterless (da)-Gal4. Intressantnervös, många av de gener inblandade i neurodegenerativa sjukdomar, däribland ATXN3 20, har en bred fördelning, vilket gör valet av allestädes närvarande uttryck lämplig. Sedan mötte vi ett annat problem: ubiquitous uttryck av patogena Atxn3-78Q orsakade dödlighet under utveckling. För att kringgå denna dödlighet, införlivade vi GAL80 ts att styra den tidsmässiga aktiveringen av Gal4 19. Detta tillät oss att samla in de experimentella flugor, ålder dem för upp till 20 dagar, frysa dem och bearbeta sina frystorkade huvuden för antingen RNA (TRIzol) eller metabolit (metanol-kloroform) extraktion (Figur 1). Vi har redan använt detta protokoll för att erhålla prover för transcriptomic och metabolomic analyser, men det finns andra uppenbara tillämpningar för denna teknik (t.ex. proteomik eller neuro-peptidomic analyser).
Experimentell översikt: Det övergripande målet för dessa protokoll är att stödja insamling av consistent prover av fly huvuden för utvinning av avskrifter och metaboliter. Det specifika målet för dessa förfaranden är att förvärva flugor uttrycker Atxn3-27Q och Atxn3-78Q (icke-patogena och patogena experimentella konstruktioner) samt LacZ (kontroll konstruktion), där ett enda prov består av 200 flyga huvuden. Även dagens teknik tillåter analys av mycket små prover, inklusive enskilda celler 28, poolade vi 200 huvuden för att eliminera experimentella, biologiska och tekniska variation, vilket gör att vi kan identifiera de cellförändringar som är förknippade med sjukdomen process med hög statistisk konfidens. Detta tillvägagångssätt är utformat för att upptäcka bara de förändringar i genuttryck som är konsekventa i befolkningen, styra oss mot de mest kritiska vägar vägbeskriving degenerering. Eftersom vi är intresserade av åldersberoende förändringar i huvudet på dessa flugor, varje genotyp erhålls vid 1, 10 och 20 dagars ålder.
En grundläggande aspekt av dessaglobala analyser är produktion av biologiska replikerar som stödjer en robust statistisk analys. Vår tidigare erfarenhet av mikromatriser och RNA-punkter tyder på att analys av biologiska prover i tre exemplar ger starka statistisk signifikans av data 11, 12. Vi beskriver i avsnitt 1) hur man skapar en enda biologisk replikera (Rep 1) för varje genotyp och tidpunkt. Dessa förfaranden kan upprepas för att generera representanter 2 och 3, eller göras parallellt, så länge som varje Rep korrekt identifieras. Även tre representanter är målet, ställa kvart (eller ens femte) Rep rekommenderas att behandla frågor som gäller lågt utbyte, förlust av flugor under åldrandet, eller oavsiktlig förlust av material (flugor, huvuden eller RNA) i en eller flera prover.
Vi fann att tio inslag (flaskor som identifierats av bokstäverna AJ) gav tillräckligt avkomma för att erhålla 200 huvuden / genotyp / tidpunkt. Extrem försiktighet måste tillämpas för att undvika förvirring, eftersom ett stort antal flaskorre krävs för att erhålla ett Rep (10 flaskor x 3 genotyper x 3 tidpunkter = 90 flaskor). För detta, betecknade vi varje flaska med genotyp, tidpunkt och flaska brev. Till exempel refererar SCA3-27Q 20E till den femte flaskan (av tio) av flugor som uttrycker Atxn3-27Q åldras i 20 dagar. När avkomman eclose är flugorna hålls i separata flaskor märkta med den unika identifieraren.
Vi höll antalet flugor som erhållits för varje prov, flaska, och uppsamlingsplats (morgon och kväll) i ett Excel-ark. Vi reviderade antalet flugor per flaska innan frysning beakta dödlighet och rymlingar. Från de sista räknas, kan flaskorna lägga 200 flugor lätt placeras innan du öppnar frysen, vilket bidrar till att bevara proverna. Eftersom flugor som samlats in från en flaska kan endast användas i en Rep, maximeras vi deras bidrag per biologisk replikera, även om alla representanter innehöll flugor från flera flaskor. Vi reserveradeflugorna från flaskorna inte används i deras planerade Rep för andra representanter, som ersättning prover eller för andra experiment (western blöt, qPCR).
Protocol
1. Generera en kopia och om frysande av flugor (VARNING, flytande kväve)
Mål: Samla minst 200 honor per genotyp / tidpunkt och Flash-freeze.
- Genotyper: GAL80 ts; da-Gal4, stam för ubiquitous expression av Gal4 under kontroll av den daughterless regulatorisk region och temperaturkänsliga GAL80. Som en styrledning, använde vi UAS-LacZ, som tidigare har visat sig inducera några skadliga effekter. UAS-Atxn3-27Q och UAS-Atxn3-78Q, icke-patogen och patogena experimentella konstruktioner, respektive. (Y, HS-Hid konstruktion har använts tidigare för en mer effektiv insamling av jungfruliga honor, men vi beslutade mot det eftersom den extra tid som krävs för att införa Y, HS-Hid med GAL80 ts, da-Gal4 om kromosomer II och III.)
- Expandera alla bestånd genom att kombinera 10 kvinnor och 5 män i flaskas för att förhindra överbeläggning. Alla experiment utfördes i Jazz Mix flyga medier, som är lätt att förbereda och främjar snabb Drosophila tillväxt och låg angrepp kvalster.
- Samla 50 GAL80 ts, da-Gal4 hanar, och 100 UAS-Atxn3-78Q jungfrur (endast en UAS linje kommer att användas som ett exempel) för varje tidpunkt.
- Gör tio kors per genotyp / tidpunkt. Bedöva män och kvinnor på koldioxid (CO 2) sovhytt / pad. Placera tio jungfruliga UAS-Atxn3-78Q flugor (inte äldre än fem dagar) och fem män GAL80 ts, da-Gal4 in varje stor flaska spetsad med jäst pasta (rehydreras torrjäst). Märk flaskorna med genotyper, punkter tid och identifierare flaska (brev AJ), och placera dem vid 25 ° C.
- Efter 2 dagar bort de vuxna från flaskorna, lägg ett stänk av torr jäst och en skvätt vatten för att stimulera optimal larver tillväxt och placera flaskorna vid 18 ° C (GAL80 aktiv,Gal4 undertryckta). Kopiera inte kors, eftersom detta kan införa experimentell variation i avkomma från befruktade jämfört virgin honor. Dessutom representerar avkomman från varje flaska oberoende biologisk replikat (varje flaska ger unik avkomma), men överförda inslag (kopior) skulle vara tekniskt replikat (extra avkomma med samma genetiska konstitution).
- När avkomman ecloses vid 18 ° C, söva på CO 2 sleeper / pad, samla jungfrur av de önskade genotyper, och placera dem i små flaskor med (11:58 flugor per flaska). Label injektionsflaskor med flaskan identifierare. Inte poolen flyger från olika flaskor. Placera rören tillbaka på 18 ° C under 24 timmar. För att maximera avkomma, fortsätt samla på varandra följande morgnar och kvällar.
- När varje flaska är klar 24 timmar vid 18 ° C, flytta dem till 29 ° C (GAL80 inaktiv, Gal4 aktiv). Detta är dag 0, utgångspunkten av experimentet, då tHan Transgener initiera deras uttryck.
- Överför flugorna att rengöra flaskor varje 2 dagar tills de når dagar 10 och 20.
- När flugorna når önskad ålder (1, 10, 20 dagar), räkna och överföra dem från mat flaskorna till pre-märkta kryokärl med en liten tratt. Undvik söva inte flugorna. Vänd flaskorna på bänken.
- Vänta 30 minuter så att flugorna att återhämta sig från överföringen (stress), därefter flash-frysa flaskorna genom nedsänkning i flytande kväve och förvara i en pre-märkt, före kyld Frysfack Kom ihåg:. Frys flugorna i samma ordning de överfördes till köldkärlet, vilket gör tiden i köldkärlet likformig över prover.
2. Insamling och lyofilisering av Fly Heads (Utför i kylrum, Pre-chill all utrustning, VARNING, flytande kväve och torris)
Mål: Snabb separation, insamling och frystorkning av vävnad.
- Assemligt sikten (största mesh i övre kammaren för att samla organ, näst störst i nedre kammaren för att samla huvuden, lock på botten för att samla små delar) och pre-chill vid -80 ° C under minst 30 minuter.
- Samla 200 flugor från kryokärl genom att maximera bidraget från flugor härstammar från samma flaska. För att kompensera för skillnader mellan flugor samlas på morgonen eller kvällen, se till att varje prov använder en identisk morgon / kväll förhållande (vi använde 47% morgon / 53% kväll) Anmärkning:. Resulterande RNA från två 100-huvud prover kan kombineras senare för att generera motsvarande 200 flugor i en enda replikat.
- Kyla en bit parafilm (~ 9 x 14 cm) på torr is under 5 minuter.
- Töm kryokärl med de fullständiga flugor på parafilm, några i taget, räkna flyger med pensel, och förvara i en annan köldkärlet på torr is tills når 100 flugor.
- Doppa silen i flytande kväve, tillsätt de 100 flugorna till den övre CHAMBER. Skaka sikten kraftigt under 1 minut. Doppa den i flytande kväve igen, och skaka i 1 min.
- Öppna sikten samla huvuden från den nedre kammaren i ett mikrorör, och plats vid -80 ° C.
- Öppna mikrorören, linda toppar i parafilm och göra små hål.
- Placera proverna i lyofilisator i minst 2 dagar.
3. Totalt RNA-extraktion och mRNA rening (Behandla alla ytor med RNaseZap, byta handskar ofta)
Mål: Homogenisera vävnad för att maximera avkastningen, extrahera totalt RNA, och rena mRNA.
- Ta bort proverna från frystork och tillsätt tre små, sterila, stål slipning bollar till varje mikrorör. Place i Geno / Grinder, köra på 1.500 slag / min i 1 min.
- Öppna rören, tillsätt 1 ml TRIzol och försegla rören med parafilm. Grind 1 minut, tryck rören upp och ned för att lossa stålkulorna vid behov. Mal 1 minut.
- InteCentrifugera röret vid denna punkt (röret blir spröd). Överför blandningen (utom stålkulor) till en ny RNas-fri mikrorör. Pelletera cellrester i en bordsskiva mikrocentrifug vid 4 ° C under 10 minuter vid 12.000 x g..
- Överför supernatanten till ett nytt mikrorör. Lägg 0,1 volymer av 1-brom-3-klorpropan (BCP), skaka kraftigt under 15 sekunder. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter. Snurra i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 15 min vid 12.000 x g Anmärkning: många RNA-extraktion protokoll använder kloroform i detta skede, BCP är avsedda att maximera RNA-utbytet genom att öka effektiviteten av fasseparation.. Hålla proverna vid 4 ° C under centrifugeringssteget kommer också att öka effektiviteten av fasseparation och minska föroreningen av protein och genomiskt DNA i den vattenhaltiga fasen.
- Överför den övre vattenhaltiga skiktet till en ny mikrorör. Fälla ut RNA genom tillsats 0,5 volymer iskall isopropanol, invertsocker sex gånger till mix. Inkubera vid rumstemperatur under 10 min. Snurra i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 10 min vid 12.000 x g..
Obs: Förutom att återhämta RNA kan proteiner också ur det organiska skiktet och interfas av TRIzol, så båda proteomik och transkriptomik analyser kan utföras på samma prover. Även om vi inte utföra detta steg i våra analyser, ger TRIzol utvinning utmärkt representation av lösliga proteiner och större representation av membran och nukleära proteiner än de flesta buffert / tvättmedel extraktioner. Lee och Lo 17 beskriver ett förfarande för att extrahera proteiner med TRIzol lämplig för proteomik analys, däribland 2-D gel och LC-MS/MS.
- Avlägsna supernatanten. Tvätta RNA genom tillsats av 1 ml iskall 70% etanol (använd DEPC-behandlat vatten), och blanda med en kort virvel. Snurra i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 5 minuter vid 12.000 x g..
- Avlägsna supernatanten. Lufttorka pelleten för ent minst 15 minuter. Lägg 80 pl DEPC-vatten till RNA-pelleten och placera den vid 55 ° C under 10 minuter. Låt vid 4 ° C över natten.
- Bestäm RNA-koncentrationen med hjälp NanoDrop spektrofotometer. Förhållandet av absorbansen vid 260 nm/280 nm bör vara mellan 1,8 och 2,1, med 2,1 är optimalt.
- Ta 30-RNA ig bulk, tillsätt 4 U DNas I, 60 U RNasin, 10 pl 10x reaktionsbuffert, och DEPC-behandlat vatten för att bringa den totala volymen upp till 100 pl. Inkubera vid 37 ° C under 20 minuter.
- Rena RNA med användning av RNeasy Mini Kit. Följ tillverkarens anvisningar, utom utföra alla centrifugeringar i 30 sekunder och inkluderar alla "frivilliga" åtgärder.
- Bestäm RNA-koncentrationen med hjälp av NanoDrop, och bedöma RNA kvalitet med "totala RNA pico"-analys på en BioAnalyzer.
- För mRNA-rening, överför 30 | il Dynabeads till en RNas-fri mikrofugrör.
- Placera röret på en magnet under 1-2 min och avlägsna supernatanten. Återsuspendera pärlorna i15 il bindningsbuffert. Upprepa.
- Från och med 5 ng totalt RNA, justera volymen till 15 pl med DEPC-vatten. Värm vid 65 ° C under 2 minuter, och placera på is.
- Lägg 15 il totalt RNA till 15 pl förtvättade pärlorna. Blanda noggrant genom att pipettera var 5 minut under 30 minuter för att glödga RNA till pärlorna. Placera på magneten under 1-2 min och avlägsna allt av supernatanten.
- Lägg 35 il tvättbuffert B. Blanda genom försiktig pipettering. Placera på magneten och ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa tvätten två gånger.
- Eluera mRNA genom att tillsätta 15 | il kall 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) och upphettning till 80 ° C under 2 minuter. Placera omedelbart röret på magneten, överföra supernatanten till en RNas-fri slang, och frysa vid -80 ° C. Kvantifiera som under 3,8). Utbyte bör vara ~ 1-5% av totalt RNA.
För metabolomic analyser, utför protokoll 1 och 2), och fortsätter med 4) nedan:
4. Metanol-kloroform ExtraInsatser av metaboliter
Syfte: Separata polära och icke-polära metaboliter.
- Lägg antioxidanten butylerad hydroxitoluen (BHT) till kloroform vid en koncentration av 0,1 mg / ml för att förhindra autooxidation av lipider under extraktionen. Använd denna BHT-kloroform för alla efterföljande steg.
- Överför 200 huvuden i kyld, förvägda koniska skruvkork polypropenrör, fryser vid -80 ° C, och lyofilisera. Bestämma torrvikten.
- Sätt 5-7 zirkon pärlor i rören och homogenisera i en vulst-beater för två cykler av 20 sekunder vardera vid 800 Hz.
- Baserat på torrvikt tyngsta provet, tillsätt vatten, metanol och kloroform i följande förhållanden: 11,74 x metanol, 10,59 x vatten, 11,74 X kloroform, där x är vikten av den tyngsta provet i gram och produkten är det volym i ml. Lägg all metanol som beräknats och 45% av det totala vattnet till vulsten visp röret innehållande de lyofiliserade huvuden.
- Homogenize i pärlan-beater för två cykler av 20 sekunder vardera.
- Kombinera de volymer av kloroform (100%) och resten av vattnet (55%) i en konisk glasflaska på is. Sedan överför vävnaden blandningen (med pärlor) till glasflaska. Skaka under 10 min. Inkubera i 10 min på is.
- Snurra i en centrifug vid 4 ° C under 5 minuter vid 2.000 x g.. Ta bort den polära (övre) fas med en Pasteurpipett (undvik plast) och placera i en andra mikrocentrifugrör.
- Spara den icke-polära (lägre) fasen i en liten glasflaska och frys vid -80 ° C. Torka under en ström av kvävgas, se till att slangen löper från kväve tanken är hög renhet Tygon för att undvika mjukgörare i extraktet.
- Rehydrera det icke-polära fasen med 620 pl deutererad kloroform. Överför 600 pl i märkta NMR-rör. Förvaras i en explosionssäker -80 ° C frys.
- Placera polär fas i Centrivap och kör tills röret är helt torr vid 30 ° C (~ 7 timmar).
- Rehydrate den polära fasen med 620 pl 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,3) i deuteriumoxid med 1 mM TMSP [3 - (trimetylsilyl) propionsyra-2 ,2,3,3-d4-syra] som en intern standard. Vortex under 30 sek. Snurra i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 5 minuter vid 10.000 varv per minut för att fälla pigment och andra stora molekyler, som skulle störa med NMR-spektra. Överför 600 pl av supernatanten till märkta NMR-rör.
Representative Results
Att kringgå dödlighet inducerad av allestädes närvarande uttryck av expanderad Atxn3 under kontroll av da-Gal4 införde vi temporal reglering av Gal4 med GAL80 ts. Men innan du fortsätter med insamling och frysning av ett stort antal flugor, ville vi bestämma uttrycket dynamiken i vår transgen under kontroll av GAL80 ts och da-Gal4. För att göra detta, genererade vi korsen, lämnade avkomma vid 18 ° C, samlas de vuxna flugor, och underhålls dem under 24 timmar vid 18 ° C. Sedan placerade vi flugorna vid den restriktiva temperaturen (29 ° C) och inkuberades dem för 0, 6, 12, 24, 36, 48, och 72 timmar. Därefter upptäckte vi ackumuleringen av den expanderade polyQ allelen genom western blöt från enstaka flugor efter publicerad protokoll 10. Uttryck först upptäcktes, men svag 6 timmar efter temperatur skift och fortsatte att öka fram till 48 timmar, då den nådde mättnadsnivå (figur 2A). Intressantnervös, föreföll en högmolekylär band av olösligt polyQ efter 48 timmar, vilket signalerar den tid det tar för proteinet att bilda stora aggregat. Vi dissekerade också flyga hjärnor vid varje tidpunkt för att bestämma fördelningen av den expanderade polyQ allelen genom immunofluorescens (fig 2B). Proteinet först upptäcktes 24 timmar efter temperaturförändringen men med ojämn fördelning. Mellan 24 och 48 timmar nivåerna av protein fortsatte att stiga, vilket gör flera centra i hjärnan tydligt, inklusive antenn loberna och svamp prognoser kroppen (Figur 2B). Mellan 48 och 72 timmar uttrycket av den expanderade polyQ allelen nådde maximala nivåer, vilket antyder att Gal4 systemet helt aktiverades vid denna tidpunkt. Baserat på dessa resultat valde vi 24 timmar efter det att temperaturen skift som den första tidpunkten (dag 1) för efterföljande experiment. Samlingarna av flugor 10 och 20 dagar gamla mättes också utgående från den temperatur skift (timig 0), vilket är den tid då experimentet börjar med det nya uttrycket av de patogena och kontroll transgener.
När vi kontrollerat att Atxn3 upptäcktes efter 24 timmar under kontroll av GAL80 ts och da-Gal4 vid 29 ° C, undrade vi om dessa flugor skulle visa tecken på neurodegeneration under 20 dagar. Eftersom dessa flugor börjar uttrycka patogena proteiner som vuxna, fruktade vi att de kanske behöver en lång inkubationstid för att visa neurodegenerativa fenotyper. För att bestämma toxiciteten av Atxn3-78Q i dessa villkor, samlade vi flugor som uttrycker LacZ, Atxn3-27Q, och Atxn3-78Q, och spelade deras livslängd. Medan flugor som uttrycker LacZ och Atxn3-27Q visas över 90% viabilitet efter 20 dagar, flugor uttrycker Atxn3-78Q visade låg överlevnad på dag 20 (30%) (Figur 3). Faktum Atxn3-78Q flugor börjat dö på dagen 10 (7% dödlighet) och dag 15 förlusten var betydande (20%), som accelererade under de senaste fem days. Således visade dessa resultat att vuxna uttryck av en patogen-gen resulterade i förkortad livslängd, en viktig tecken på neurodegenerativa fenotyper som induceras av Atxn3-78Q.
En av de mest kritiska aspekterna av detta protokoll var hantering och bevarande av prover efter frysning för att säkerställa kvaliteten av det utvunna materialet. Vi extraherade mellan 15-80 ng totalt RNA per 200 huvuden (beroende på ålder och genotyp) före DNas behandling enligt NanoDrop. Ungefär en tredjedel (6-25 pg) utvanns som mycket ren RNA efter DNas-behandling av förhållandet mellan absorbansen vid 260 nm/280 nm. Vi fann emellertid att det bästa sättet att bestämma kvaliteten av RNA för beredning av cDNA-bibliotek för RNA-seq var att analysera total-RNA på BioAnalyzer. Lyckligtvis var endast en liten mängd RNA (5 ng) används på BioAnalyzer, så det inte påverka förmågan att producera flera bibliotek per prov. Som ett exempel, körde vi två prover av totaltRNA före DNas-behandling på en BioAnalyzer chip misstänks en av dem för att vara nedbrutna (figur 4A-C). Den höga kvaliteten RNA (prov 1) producerade tre skarpa RNA band, två strax under 2.000 nukleotider (nt) i storlek och en mindre band under 200 nt, som representerar de ribosomala RNA (figur 4A). De två banden omkring 2.000 nt motsvarar 18S rRNA (mindre topp) och två fragment från 28S rRNA (större topp), vilket är en unik aspekt av rRNA biologi i Drosophila (se figur 4B). Dessa egenskaper observerades även i de BioAnalyzer spåren (fig 4B). I motsats härtill en nedbruten RNA-prov (prov 2) ger inte de skarpa topparna för de ribosomala RNA, och ackumulerade multipla band av mindre än 500 nt (figur 4A). Denna storleksfördelning var lätt särskiljas i BioAnalyzer spåren (Figur 4C), där breda toppar med kortare storlek noterades. Också viktigt att notera wsom skillnaden i andelar i y-axeln mellan de två RNA-proverna, vilket visade att den nedbrutna provet hade mindre RNA. Endast RNA visa maximal kvalitet (NanoDrop förhållande absorbans vid 260 nm/280 nm mellan 1,8 och 2,1, med 2,1 är optimalt, se protokoll steg 3,8) kommer att användas för generering av bibliotek.
För utvinning av metaboliter, följde vi en klassisk vatten / metanol / kloroform (2.0:2.0:1.8) extraktionsförfarande 3 uppdelad i två steg för att maximera utvinningen av både polära och icke-polära metaboliter 35. Efter separation av polära och icke-polära faser, rekonstitueras vi dem i deutererad vatten eller deutererad kloroform, respektive, och sattes interna standarder för analys genom NMR. NMR-spektra som erhållits med denna extraktionsmetod väl löstes med platta baslinjer och smala linjer (Figur 5), vilket indikerar rening av högkvalitativa extrakt, passar både metabolisk profilering ettd. identifiering av ett stort antal metaboliter. Figur 5 visar identifieringen av några framträdande toppar motsvarar starkt rikliga metaboliter, såsom glukos och sackaros, och två viktiga metaboliska syror, laktat och acetat, enligt kemiska förskjutningar i litteraturen 7. Den kemiska förskjutningen (i delar per miljon) representerar elektromagnetisk skärmning av en molekyl i förhållande till en vanlig molekyl (TMS, första toppen från höger). Fler shieldedmolecules har högre elektrontäthet runt kärnan och visas till höger av spektrumet, inklusive alkyler. Deshielded molekyler såsom amid och aromatiska väteatomer kommer att visas till vänster av spektrumet. Den livliga mittsektionen (3-4 ppm) anrikas för sockermolekyler.
Figur 2. Expression kinetik (A) Western blot som visar Atxn3-78Q uttryck (GAL80 ts, da-Gal4 / UAS-Atxn3-78Q). Flugor inkuberade vid 29 ° C 0 till 72 timmar. En svagt band detekteras först vid 6 timmar och mättnad nås av 48 h efter induktion. (B) Immunofluorescens av hela hjärnor i samma flugor. Hjärnor dissekerades, fast, end färgats med en antikropp som känner igen den utökade polyQ proteinet. Proteinet detekteras först i (MB) svamp kroppen utsprången och antenn loberna (AL). Mellan 48 och 72 timmar, når uttrycket gränsvärden och är mycket synlig i centra i hjärnan med riklig innervation. Uttrycket nivå per neuron är svag sett i optiska loben (OL), utom i ett fåtal stora neuroner mellan OL och den centrala hjärnan. 
Figur 3. Atxn3-78Q minskar livslängden Flugor uttrycker LacZ, Atxn3-27Q, och Atxn3-78Q överallt hos vuxna stadier (GAL80 ts, da-Gal4). Övervakades för sin livslängd vid 29 ° C. Flugor uttrycker LacZ (blå) och Atxn3-27Q (grön) visade låga nivåer av dödlighet vid dag 20. Däremot flyger uttrycker Atxn3-78Q (röd) visasen uttalad dödlighet börjar vid dag 10. Vid dag 15 visade de en 20% minskning av lönsamheten, som accelererade under de kommande fem dagarna och nådde en 70% dödlighet vid dag 20. 
Figur 4. RNA-kvalitetsbedömning. RNA från hög kvalitet och försämrade prover kördes på en BioAnalyzer chip. (A) BioAnalyzer drivs med en hög kvalitet RNA (prov 1) och en försämrad RNA (prov 2) bredvid en storlek markör (vänster körfält). Notera de tre skarpa toppar motsvarande ribosomalt RNA i den centrala banan. (B) BioAnalyzer spåra för prov 1, med två karakteristiska starka toppar strax under 2.000 nt och en annan under 200. (C) BioAnalyzer spåra för prov 2, som består av mestadels nedbrutna RNA. Notera skillnaden i enheter på y-axeln mellan panelerna B och C.
Figur 5. Representativ 1D NMR-spektra av polära metaboliter. Representant 1D proton NMR-spektrum för polära metaboliter från Drosophila och kompletterande 2D COSY (korrelation spektroskopi) och HSQC (heteronukleär enda quantum korrelation) experiment för maximal tilldelning. Metaboliter identifieras i enlighet med kända kemiska skift-1: sackaros, 2: Glukos, 3: Beta-alanin, 4: Acetate, 5: Laktat.
Discussion
Bygga på våra tidigare erfarenheter transkriptomik 11, 12, ämnesomsättning 15, och neurodegenerativa sjukdomar 6, 8, presenterar vi här ett nytt protokoll för insamling tusentals flyga huvuden med vuxen-uttryck av patogena gener och rening mRNA och metaboliter för RNA- seq och NMR-spektroskopi, respektive. Arten av dessa experiment krävs införlivandet av flera innovationer före flyga insamling, inklusive valet av en allestädes närvarande Gal4 linje och användning av temporala regleringen av genuttryck. Beträffande Gal4, allestädes närvarande expression av transgener var avgörande för två skäl. Först, ett stort antal gener som är involverade i neurodegenerativa sjukdomar, däribland ATXN3, huntingtin, Amyloid prekursorprotein, och Superoxiddismutas 1, bland annat är allmänt uttrycks i neuronala och gliaceller, liksom i andra celltyper utanför nervsystemet. Vi villekorrekt modellera denna aspekt av biologi dessa patogena gener genom att analysera konsekvenserna av allestädes närvarande uttryck snarare än att fokusera enbart på neural uttryck. Det andra är det inte möjligt att samla flyga hjärnor i stort antal, men vi kan göra det med fly huvuden (över 200 i tre exemplar per skick) 11, 12. Eftersom homogenisering av hela huvuden blandar neurala och icke-neurala vävnader, blir allmänt förekommande transgenuttryck kritisk för att erhålla enhetliga RNA och metaboliter från populationer av celler som uttrycker samma transgener. Det är viktigt att notera att da-Gal4 valdes för dess ganska jämn fördelning, inte på grund av dess höga uttryck nivå, även om en färsk rapport föreslog att da-Gal4-inte kan vara helt allestädes närvarande 25. Vi hade tidigare övervägt andra ubiquitous Gal4 linjer, inklusive arm-, Tub-och Act-GA4, men alla visade komplext uttryck mönster i de vuxna CNS och muskler, vilket gör dem mindre endequate för denna studie. I själva verket visade immunfluorescens hos vuxna hjärnor som da-Gal4 inducerar omfattande men svagt uttryck, som endast samlats vid höga nivåer i centra i hjärnan som består av ett par tusen axoner och ett fåtal stora neuroner (figur 2). Även om uttrycksnivåer av konstruktionerna var låg, minskade dessa villkor dramatiskt överlevnad i en polyQ-beroende sätt. Detta uttryck dynamik uppfyllde våra behov och samtidigt hålla uttrycksnivåer låg, vilket var viktigt för observation de långsamma, progressiva cellulära förändringar orsakade av neurotoxiska proteiner.
En förutsägbar konsekvens av att inducera överallt uttryck av neurotoxiska proteiner var att det orsakade dödlighet före vuxen eclosion. Lyckligtvis var denna komplikation kringgås med användning av GAL80 ts. Som diskuterats ovan, nådde genuttryck maximala nivåer omkring 48 timmar efter det att temperaturen skift, som passar väl med tiden framig av experimentet. En ytterligare fördel med att använda GAL80 ts var att, i motsats till experiment där de neurotoxiska proteinerna konstitutivt uttryckta pan-neuralt fanns ingen expression under utvecklingen av nervsystemet. Således skapade användningen av GAL80 ts en "ren" bakgrund där nervsystemet inte utsätts för toxiska aktiviteter dessa neurotoxiska proteiner under känsliga utvecklingsstadier. Enligt vår uppfattning resulterade aktivering av genuttryck hos vuxna i en bättre modell för denna klass av vuxen ålder patologier. Däremot infördes GAL80 ts också några komplikationer i samband med temperaturförändringar. En var att växande flugor vid låga temperaturer (18-20 ° C) fördröjde livscykeln, vilket gör experimenten betydligt längre. Dessutom är det väl känt att växande flugor vid höga temperaturer (29-31 ° C) påskyndar deras ämnesomsättning, vilket illustreras av den förkortade livslängd jämfört med flugor i åldern vid 25 ° C. Since de transkriptionella och metaboliska studier kommer att utföras i flugor i åldern vid hög temperatur, kan vi förvänta oss att se viktiga förändringar i cellulära stressreaktioner vägar och energiomsättning. Det är därför det var så viktigt att introducera två kontroller till experimentet, en med icke-patogena Atnx3-27Q och en obesläktad kontroll uttrycker LacZ. Dessa kontroller kommer att ge en grund för genuttryck och metabola förändringar i samband med hög temperatur så att vi kan identifiera de förändringar som är direkt kopplade till uttrycket av toxiska Atxn3. Sammantaget har vi infört flera ändringar insamling av flugor som ger många fördelar - och några nackdelar (temperatur frågor och nästa stycke) - för att studera vuxen ålder, progressiva sjukdomar.
Även den tidsmässiga reglering med GAL80 ts var en bra Dessutom införde också en oväntad komplikation. Samtidigt generera flugorna bär både GAL80 ts ennd da-Gal4 konstruktioner i en stabil lager, märkte vi att flugor dubbelt homozygot för båda konstruktionerna var livskraftiga men steril. Eftersom homozygot GAL80 ts och da-Gal4 stammar var livskraftig och bördig av sig själva, är det inte klart varför kombinationen visade låg fertilitet. Det har varit känt en tid att Gal4 är något toxisk för Drosophila vävnaderna 22. Det är då möjligt att den heterologa expressionen av jäst transkriptionell repressor GAL80 bidrog till toxiciteten av Gal4 genom störande, eventuellt, med den endogena transkriptionsmaskineriet. Denna toxicitet kan förvärras av den allestädes närvarande fördelningen av Gal4 under kontroll av da, en gen som spelar en nyckelroll i tidig utveckling och sexuell beslutsamhet. Oavsett de bakomliggande orsakerna till sterilitet, expanderade vi GAL80 ts, da-Gal4 flugor genom att upprätthålla en balansaxel kromosom över da-Gal4 samtidigt som Homozygosity för GAL80 t s, vilket tyder på att Gal4 är en mer kritisk bidragsgivare till sterilitet. Denna lösning var nyckeln eftersom vi använde hundratals av dessa män varannan vecka för att korsa sig med var och en av UAS transgener. Men korsar bär en balanserare skapat merarbete vid valet av lämplig avkomma. Endast fjärdedel (25%) av avkomman samlades (honor, icke-balansaxlar), som läggs val tid, minskade avkastningen per flaska, och ökade antalet flaskor som behövs för att få minst 200 flugor per genotyp / replikera / tid punkt. Sammantaget, även om insamling av flugor blev tidsödande på grund av de stora nödvändiga apparater, är vi övertygade om att studera cellförändringar bara några timmar efter att du slår på uttrycket av sjukdomsgener överallt kommer att identifiera nya och intressanta processer inblandade i progressiv neuronal förlust.
När den genetiska konstruktionen var på plats, vi betalat särskild uppmärksamhet åtexperimentella manipulationer som kan införa biologisk variabilitet. Först samlade vi bara orörda kvinnor för att säkerställa homogenitet av proverna, även om detta innebar att kasta bort hanar och kontroll för avkomma två gånger om dagen. Under åldrandet har högst 12 flugor förvaras i samma flaska för att undvika överbeläggning och stress. Även före frysning, var flugor över till kryokärl utan bedövning och fick återhämta sig från överföringen i 30 min. Dessa till synes triviala faktorer kan påverka genuttryck och ämnesomsättning, att införa variation i slutändan som inte skulle vara relevant för experimentet.
För att säkerställa kvaliteten på de frysta material (huvuden, RNA, och metaboliter) betalade vi särskild uppmärksamhet åt varje detalj som kan bidra till vävnadsnedbrytning. Eftersom flugor överförs till kryokärl i litet antal (upp till 12 flugor per flaska) var vi tvungna att hämta många flaskor för insamling av 200 huvuden. Dessa manipulationer var den med stor försiktighet i ett kallt rum med torris och flytande kväve. Insamlingen av flugor, separation av huvuden, och rening av informativa molekyler är alltför tidskrävande att upptäcka att materialet var ned vid slutet av denna långa process. Förutom att se till att materialet bibehåller sin kvalitet, beskriver detta protokoll flera steg som maximerar avkastningen av RNA och metaboliter, inklusive frystorkning och pärla stryk. Dessa steg är inte nödvändiga för normal extraktioner för RT-PCR eller kvantitativ PCR från hela flugor, men de är avgörande för konsekventa rening från små prover, såsom flyga huvuden. Vi bestämde att andra steg påverkar utbytet av RNA. Till exempel producerade äldre flugor betydligt mindre RNA än yngre flugor, oavsett genotyp. Denna observation tyder på att åldras vid hög temperatur inducerar dramatiska förändringar. Dessutom, utvinna RNA från 100 huvuden var faktiskt mer effektiv än från 200 huvuden, så vi fortsatte att rena i två Batches av 100 per prov, bara för att kombinera dem efter kontroll av kvalitet med BioAnalyzer. Dessutom tycktes kolumner för mRNA-rening för att mätta lätt, så att mängden av totalt RNA användes per kolumn måste optimeras.
Metaboliter är en skiftande blandning av små molekyler, så kvalitetskontroll är svårare än med DNA, RNA eller proteiner. Tyvärr finns det ingen komplett katalog av metaboliter för alla djurmodell vid denna tid, något som kan förändras under de närmaste åren tack vare att flera tekniska innovationer, bland annat NMR-spektroskopi och en ökad användning av vätskekromatografi - masspektrometri ( LC-MS). Fastän NMR är mindre känslig än MS, visar det många lovande fördelar, inklusive ingen destruering av de prov, inga analytiska förfaranden som inför förspänning (LC), och hög reproducerbarhet som möjliggör statistisk jämförelse av representanter och flera experimentella förhållanden 24. Sålunda kan provet varatestas på nytt för att verifiera observationer eller analyseras på nytt med LC-MS för att bekräfta NMR-data. Här visade vi preliminära NMR-data från flugor som vi använder för att sammanställa en katalog av metaboliter i Drosophila. Denna information kommer att vara avgörande för hur uttrycket av sjukdomsgener förändrar normal ämnesomsättning, öppnar ett nytt fönster för att ytterligare förstå de cellulära mekanismerna bakom neurodegenerativa sjukdomar.
Framväxande miska teknik ger den bästa möjligheten att studera neurodegenerativa sjukdomar på en detaljnivå som tidigare inte uppnåtts. Kanske det största hindret att övervinna i dessa hög kapacitet studier är trogen samling reproducerbara prover som kan analyseras med mycket känsliga metoder. De förfaranden som införs här ett sätt att uppnå konsekvens, och kommer att leda till resultat som lätt kan jämföras mellan datamängder. Även om våra primära forskningsintresse inblandade undersöka förändringar av gen Expressjon och metaboliter kan de genererade flugor också utsättas för proteomik och epigenomic analys. Proteomik och epigenomic förändringar under neurodegeneration är också sannolikt att vara av största betydelse för sjukdomsprocessen. När det vetenskapliga samfundet slutligen identifierar hela spektrumet av molekylära förändringar som påverkar sjukdomsprocessen kommer en sann systemnivå förståelse av sjukdomen vara möjlig. På denna nivå kommer sjukdomsmodifierande behandlingar fram till slut som en realitet.
Disclosures
Författarna förklarar några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Janice Santiago, Gabriel Figueroa, och Jose Herrera för tekniskt bistånd och Bloomington Drosophila Stock Center vid Indiana University för flyga bestånd. DH och CW stöddes av medel från NSF-IOS-1.051.890. PF-F och LMM stöddes av en affärsmöjlighet Seed Fund från University of Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32" grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 | |
References
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
- Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
- Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
- Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
- Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
- Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
- Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
- Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
- Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
- Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
- Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
- Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
- Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
- Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
- Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
- Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
- Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
- Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
- Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
- Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
- Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
- Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).
