Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Oprensning af udskrifter og metabolitter fra Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50245
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 2, 3, 1,4, 1,4
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida, 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida, 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida, 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

Summary

Vi beskriver her procedurerne for ekstraktion og oprensning af mRNA og nedbrydningsprodukter fra

Abstract

Gennem det sidste årti, har vi forsøgt at forstå de molekylære og cellulære mekanismer af neuronal degeneration ved hjælp af Drosophila som model organisme. Selv bananfluer giver åbenlyse eksperimentelle fordele, har forskning i neurodegenerative sygdomme oftest har været på traditionelle teknikker, herunder genetisk samspil, histologi immunfluorescens, og protein biokemi. Disse teknikker er effektive til mekanistisk, hypotese-drevne undersøgelser, der fører til en detaljeret forståelse af den rolle enkelte gener i veldefinerede biologiske problemer. Imidlertid neurodegenerative sygdomme er meget komplekse og påvirke flere cellulære organeller og processer over tid. Fremkomsten af ​​nye teknologier og omik alder giver en unik mulighed for at forstå de globale cellulære perturbationer underliggende komplekse sygdomme. Fleksible modelorganismer såsom Drosophila er ideelle til at tilpasse disse nye teknologier på grund af deres stærke Annottion og høj medgørlighed. En udfordring med disse små dyr, selv om, er oprensningen af ​​tilstrækkeligt informative molekyler (DNA, mRNA, protein, metabolitter) fra yderst relevante væv såsom flyve hjerner. Andre problemer omfatter indsamle et stort antal fluer til forsøgsgentagelser (kritisk for statistisk robusthed) og udvikling af ensartede procedurer for oprensning af høj kvalitet biologisk materiale. Her beskriver vi de procedurer for indsamling tusindvis af flyve hoveder og udvinding af udskrifter og metabolitter at forstå, hvordan de globale ændringer i genekspression og metabolisme bidrager til neurodegenerative sygdomme. Disse procedurer er let skalerbar og kan anvendes til studiet af proteomik-og epigenomic bidrag til sygdom.

Introduction

I det sidste århundrede har Drosophila vist sig at være et uvurderligt laboratorium redskab til at undersøge dybe biologiske spørgsmål, især i udvikling, cellebiologi, genetik og neurobiologi 1. Årsagerne til denne succes er, at frugtfluer er lette at håndtere, har en stadig voksende værktøjskasse 18, 21, 31, og har et relativt simpelt genom med høj kvalitet annotation 26. Disse tekniske fordele, kombineret med opfindsomhed og konstant innovation inden for flue samfund, har ført til brede videnskabelige bidrag, som illustreret ved tildelingen af ​​tre Nobelpriser (1933, 1995, 2011). På det seneste har Drosophila opstået som en relevant model for at studere menneskelige sygdomme, primært udviklingsmæssige forstyrrelser, medfødte immunitet, kræft og neurodegeneration 2. Vi er især interesseret i at afdække den cellulære og molekylære basis for neurodegenerative sygdomme. Disse komplekse og forskelligartede cold er knyttet til samlinger, eventuelt opløselige oligomerer, med unormal foldede proteiner og er derfor let modelleres i fluer. Alle de store neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, flere ataksi, tauopathies, prionsygdomme og andre sjældne sygdomme, er blevet modelleret i fluer i de sidste femten år 23. Fly laboratorier har bidraget til forståelsen af disse sygdomme, hovedsageligt ved at udnytte dygtighed af Drosophila genetik til at identificere nye gener involveret i neurotoksiciteten af de patogene proteiner. Når nye gener er relevante for neurotoksisk kaskade er identificeret, er deres virkninger typisk analyseret ved traditionelle tilgange, herunder histologi at konstatere mønstre af degeneration, immunfluorescens at bestemme protein fordeling og cellulære patologi og biokemiske analyser for at vurdere mængden og typen af ​​unormale protein konformationer . Endelig BehavIoral analyse tjener som en funktionel udlæsning af sygdomstilstande resultater. Disse veletablerede teknikker er blevet udnyttet for at undersøge bidraget af en eller nogle få kandidatgener for sygdommen, herunder oxidativ stress og mitokondriel dysfunktion 13, transkriptionel dysregulation 9, 27, 30, aberrant axonal transport og synaptisk aktivitet 14, unormal RNA biologi 9, hindrede dysreguleret cellesignalering 29, ER dyshomeostasis 6, cellulære proteostasis 33, og mange andre 23. Det er imidlertid ikke klart, hvordan disse toksiske proteiner kan forstyrre samtidigt med flere indbyrdes forbundne veje, hvad der er den tidsmæssige rækkefølge af disse ændringer, og hvad der er det relative bidrag af hver vej til patogenese. Årtiers forskning fokuseret på enkelt gen, har hypotesen drevne strategier i både mennesker og dyremodeller førte til en ufuldstændig, gådefuldt billede af de cellulære mekanismer, som forårsagerneurodegeneration. Den nuværende ringe forståelse for de nøjagtige mekanismer, ved hvilke disse giftige protein samlinger forårsager neuropatologiske er en vigtig begrænsning for udviklingen af ​​sygdomsmodificerende behandlinger.

Vi er nu interesseret i anvendelsen af ​​nye metoder til at forstå, hvordan disse patogene proteiner fremkalde globale mobiltjenester perturbationer. Fremkomsten af ​​omik æra tillader dybe sondering af komplekse biologiske problemer ved hjælp af avancerede high-throughput teknologier, som kan føre til effektiv sygdomsbehandlinger i den nærmeste fremtid. Genekspression (transcriptomics) undersøgelser blev oprettet efter afslutningen af ​​flere genomsekvenser siden af ​​høj kvalitet annotation kan forudsige de fleste udskrifter. Den nylige anvendelse af næste generation sekventering til udskrift analyse (RNA-seq) har givet nye fordele og muligheder i forhold til microarrays, herunder en fordomsfri tilgang, forbedret kvantitativ rækkevidde, og reducerede omkostninger 32.Vi ønsker at udnytte fordelene ved RNA-seq til bedre at forstå den mest almindelige form for dominant nedarvet ataksi, spinocerebellar ataksi type 3 (SCA3) eller Machado-Joseph sygdom. SCA3 er en monogeniske, dominant sygdom med fuld penetrans, forårsaget af en CAG trinukleotid ekspansion i Ataxin3 genet (ATXN3) 16. Denne mutation fører til produktion af Atxn3 protein med en lang polyglutamine (polyQ) spor, der gør det tilbøjelige til at aggregere. Da mutant Atxn3 er neurotoksisk agent i SCA3 ansvarlig for alle sygdomsrelaterede perturbationer, dette er en ideel sygdom for anvendelse af disse nye OMIC tilgange. Derudover SCA3 var en af de tidligste neurodegenerative sygdomme modelleret i fluer 34.

Mens indføre de procedurer for indsamling stort antal flyve hoveder til RNA-seq, indså vi, at vi kunne bruge det samme materiale til udførelse globale studier af andre informative molekyler. Blandt andre nye disciplinjer, proteomik, Epigenomics og metabolomics tillader undersøgelse af cellulære patologi i en dybde, der ikke tidligere nået, dog ikke uden udfordringer. I modsætning til mRNA, kataloget af proteiner og metabolitter er temmelig ufuldstændig på dette tidspunkt på grund af de stigende vanskeligheder med at forudsige alle mulige splejsningsvarianter og endnu mere gådefulde oprindelse af alle normale og patogene metabolitter. Store bestræbelser er i øjeblikket i gang med at katalogisere proteiner i mange organismer og ved sygdomstilstande. Til dette har vi ønsket at fokusere på bidrag ændrede metabolitter til SCA3 patogenese ved hjælp af en simpel organisme, såsom Drosophila. Dette er et relativt nyt og lovende område, især med den nylige indførelse af kernemagnetisk resonans (NMR), som giver høj reproducerbarhed og ikke ødelægger prøverne 5, 24. Vi foreslår, at metabolit profilering kan bidrage til at identificere biomarkører og sygdomsmekanismer impliceret i neurodegeneratiden.

En vigtig overvejelse med disse OMIC projekter er, at de kræver store ensartede prøver (200 flyve hoveder) samt præcise rensningsteknikker at minimere eksperimentelle variation. Vi begyndte at indsamle fluer efter procedurer, vi havde brugt tidligere for microarrays og også brugt for nylig til RNA-seq 12. Men vi snart stødt på en række problemer i forbindelse med misexpressing de SCA3 konstruktioner. Først havde vi at vælge en Gal4 driver til disse eksperimenter 4, hvor målvævet til analyse var hjernen. Det oplagte valg ville være en pan-neuralt driver siden SCA3 er en hjernesygdom. Men da vi har til hensigt at indsamle mRNA og metabolitter fra hele hoveder, ville denne mulighed give blandet materiale fra væv udtrykke og ikke-udtrykkende konstruktionerne. For at generere homogene prøver, hvor alle celler udtrykker de konstruktioner, vi besluttet at bruge en svag, men allestedsnærværende driver linje, daughterless (da)-Gal4. Interestingly er mange af generne involveret i neurodegenerative sygdomme, herunder ATXN3 20, har en bred fordeling, hvilket gør valget af allestedsnærværende ekspression passende. Så vi stødt på et andet problem: allestedsnærværende udtryk for patogene Atxn3-78Q forårsagede dødelighed under udvikling. For at omgå denne dødelighed, vi indarbejdet Gal80 ts til at styre den tidsmæssige aktivering af Gal4 19. Dette tillod os at samle de eksperimentelle fluer, alder dem i op til 20 dage, fryse dem og behandle deres frysetørrede hoveder for enten RNA (TRIzol) eller metabolit (methanol-chloroform) ekstraktion (figur 1). Vi har allerede brugt denne protokol til opnåelse af prøver til transkriptomisk og metabolomisk analyser, men der er andre oplagte anvendelser af denne teknik (f.eks proteomisk eller neuro-peptidomic analyser).

Eksperimentel oversigt: Det overordnede mål med disse protokoller er at støtte indsamlingen af ​​consistent prøver af flyve hoveder til udvinding af udskrifter og metabolitter. Det specifikke mål med disse procedurer er at erhverve fluer udtrykker Atxn3-27Q og Atxn3-78Q (ikke-patogene og patogene eksperimentelle konstruktioner) samt LacZ (kontrol-konstruktion), hvor en enkelt prøve består af 200 fly hoveder. Selv om den nuværende teknologi tillader analysen af meget små prøver, herunder enkelte celler 28, vi samlet 200 hoveder til at fjerne eksperimenterende, biologisk og teknisk variation, hvilket giver os mulighed for at identificere de cellulære forandringer forbundet med sygdommen proces med høj statistisk tillid. Denne fremgangsmåde er designet til at detektere kun de ændringer i genekspression, der er forenelige i befolkningen, lede os i retning af de mest kritiske veje køre degeneration. Da vi er interesseret i aldersbetingede forandringer i hovedet på disse fluer blev hver genotype opnået ved 1, 10, og 20 dage gamle.

Et grundlæggende aspekt af disseglobale analyser er produktion af biologiske replikater som understøtter et robust statistisk analyse. Vores tidligere erfaring med microarrays og RNA-seq tyder på, at en analyse af biologiske prøver i tre eksemplarer giver stærk statistisk signifikans af data 11, 12. Vi beskriver i afsnit 1) hvordan man kan generere en enkelt biologisk replikat (Rep 1) for hver genotype og tidspunkt. Disse procedurer kan gentages for at generere Reps 2 og 3, eller gøres parallelt, så længe hver Rep korrekt identificeret. Selvom tre Reps er målet, at sætte en fjerdedel (eller endda femte) Rep anbefales stærkt at dække spørgsmål vedrørende lavt udbytte, tab af fluer under aldring, eller utilsigtet tab af materiale (fluer, hoveder eller RNA) i en eller flere prøver.

Vi fandt, at ti krydser (flasker identificeret ved bogstaver AJ) produceret nok afkom til opnåelse af 200 dyr / genotype / tidspunkt. Den yderste forsigtighed skal anvendes for at undgå forvirring, da et stort antal flasker are kræves for at opnå en Rep (10 flasker x 3 genotyper x 3 tidspunkter = 90 flasker). Til dette, betegnet vi hver flaske med genotype, tidspunkt og flaske brev. For eksempel henviser SCA3-27Q 20E til den femte flaske (af ti) af fluer udtrykker Atxn3-27Q ældet i 20 dage. Når afkom eclose er fluerne holdes i separate hætteglas mærket med den entydige identifikationskode.

Vi fastholdt antallet af fluer opnået for hver prøve, flaske, og indsamlingssted (morgen og aften) i et Excel-regneark. Vi reviderede antallet af fluer pr hætteglasset før frysning for at tage hensyn letalitet og undslupne. Fra disse sidste tællinger, kan hætteglas tilføje 200 fluer let kan findes, før du åbner fryseren og dermed bidrage til bevarelsen af ​​prøverne. Da fluer indsamlet fra en flaske kun kan anvendes i en Rep, vi maksimeres deres bidrag pr biologiske gentagelse, selvom alle Reps indeholdt fluer fra flere flasker. Vi reserveredefluerne fra flaskerne bruges ikke i deres planlagte Rep for andre Reps, som erstatning prøver samt andre beslægtede eksperimenter (western blot, qPCR).

Protocol

1. Generering af en Repliker og Indefrysning af fluer (FORSIGTIG, flydende nitrogen)

Mål: Saml mindst 200 tæver pr genotype / tidspunkt, og flash-frost.

  1. Genotyper: Gal80 TS; da-GAL4, stamme for ubikvitær ekspression af Gal4 under kontrol af den daughterless regulatoriske region og temperaturfølsom Gal80. Som en styreledning anvendte vi UAS-LacZ, som tidligere er blevet vist at inducere nogen skadelige virkninger. UAS-Atxn3-27Q og UAS-Atxn3-78Q, ikke-patogen og patogene eksperimentelle konstruktioner hhv. (Y, hs-Hid konstruktion har været brugt før til en mere effektiv indsamling af jomfruelige hunner, men vi besluttede imod det på grund af den ekstra tid, det tager at introducere Y, hs-Hid med Gal80 ts, da-Gal4 på kromosomer II og III.)
  2. Udvid alle bestande ved at kombinere 10 hunner og 5 hanner i flaskes for at forhindre overfyldning. Alle eksperimenter blev udført i Jazz Mix flyve medier, der er let at fremstille og fremmer hurtig Drosophila vækst og lav angreb med mider.
  3. Collect 50 Gal80 ts, da-Gal4 mænd, og 100 UAS-Atxn3-78Q jomfruer (kun en UAS linie vil blive anvendt som eksempel) for hvert tidspunkt.
  4. Lave ti krydser pr genotype / tidspunkt. Bedøve hanner og hunner på kuldioxid (CO 2) sovekabine / pude. Place ti jomfruelige UAS-Atxn3-78Q fluer (ikke ældre end fem dage) og fem mænd Gal80 ts, da-Gal4 i hver stor flaske tilsat gær pasta (rehydreret tørgær). Mærk flaskerne med genotyper, tidspunkter og flaske identifikatorer (breve AJ), og læg dem ved 25 ° C.
  5. Efter 2 dage, skal du fjerne de voksne fra flaskerne, tilføje et drys af tørgær og en stråle af vand for at fremme optimal larve vækst, og placere flaskerne ved 18 ° C (Gal80 aktiv,Gal4 undertrykt). Du skal ikke kopiere krydsene, da dette kan indføre eksperimentelle variation i afkom af befrugtede versus jomfru hunner. Også afkommet fra hver flaske betegner uafhængigt biologiske replikater (hver flaske producerer unikke afkom), men overførte kors (kopier) ville være teknisk gentagelser (yderligere afkom med samme genetiske konstitution).
  6. Når afkommet ecloses ved 18 ° C, anesthetize på CO 2 sovekabine / pad, indsamle jomfruer af de ønskede genotyper, og læg dem i små hætteglas med (11:58 fluer pr hætteglas). Label hætteglas med flasken identifikator. Må ikke pulje flyver fra forskellige flasker. Anbring hætteglassene igen ved 18 ° C i 24 timer. For at maksimere afkom, fortsætte indsamlingen på hinanden følgende morgen og aften.
  7. Når hvert hætteglas fuldender 24 timer ved 18 ° C, flytte dem til 29 ° C (Gal80 inaktiv, Gal4 aktiv). Dette er dag 0, udgangspunktet for eksperimentet, hvor than transgener indlede deres udtryk.
  8. Overfør fluerne til at rense hætteglas hver 2 dage, indtil de når dage 10 og 20.
  9. Når fluerne har nået den ønskede alder (1, 10, 20 dage), tælle og overføre dem fra de fødevarer, hætteglas i pre-mærkede kryohætteglas ved hjælp af en lille tragt. Må ikke bedøver fluerne. Inverter hætteglassene på bænken.
  10. Vent 30 min, så fluerne at komme sig efter overdragelsen (stress), derefter lynfryser hætteglassene ved nedsænkning i flydende nitrogen og opbevares i en præ-mærket, præ-kølet frostbox Husk:. Frys fluer i samme rækkefølge de blev overført til cryovialet, hvilket gør tid i cryovialet uniform tværs prøver.

2. Indsamling og Lyofilisering af Fly Heads (Udfør i kølerum, Pre-chill alt udstyr, FORSIGTIG, flydende nitrogen og tøris)

Formål: Hurtig adskillelse, indsamling, og frysetørring af væv.

  1. Assemble sigten (største maske i øverste kammer til at indsamle organer, næststørste nedre kammer til at indsamle hoveder, låg på bunden til at indsamle små dele) og præ-chill ved -80 ° C i mindst 30 min.
  2. Saml 200 fluer fra kryoglas ved at maksimere bidraget fra fluer stammede fra den samme flaske. For at kompensere for forskelle mellem fluer indsamlet om morgenen eller aftenen, sørge for, at hver prøve bruger et identisk morgen / aften ratio (vi brugte 47% morgen / 53% aften) Bemærk:. De resulterende RNA fra to 100-hoved prøver kan kombineres senere at generere svarer til 200 fluer i et enkelt replikat.
  3. Chill et stykke parafilm (~ 9 x 14 cm) på tøris i 5 min.
  4. Tøm kryohætteglas med de fuldstændige fluer over på parafilm, et par på et tidspunkt, tæller flyver med pensel, og opbevar det i en anden cryovialet på tøris indtil den når 100 fluer.
  5. Dyp sien i flydende nitrogen, tilsæt de 100 fluer til den øverste chambis. Ryst sigten kraftigt i 1 min. Dyppe den i flydende nitrogen igen og rystes i 1 min.
  6. Åbne sigte, indsamle hoveder fra det nedre kammer i et mikrorør, og den anbringes ved -80 ° C.
  7. Åbn mikrorør, wrap toppe i parafilm, og laver små huller.
  8. Placere prøverne i frysetørreren i mindst 2 dage.

3. Total RNA Extraction og mRNA Purification (Behandl alle overflader med RNaseZap, ændre Handsker Ofte)

Formål: homogeniseres væv for at maksimere udbyttet, ekstrahere totalt RNA, og rense mRNA.

  1. Tag prøverne fra frysetørrer og tilføje tre små, sterile, stål slibning bolde til hvert mikrorør. Plads i Geno / Grinder, kørt ved 1500 slag / min i 1 min.
  2. Åben tuberne, tilsættes 1 ml TRIzol, og forsegle glassene med parafilm. Grind 1 min, skal du trykke rørene op og ned for at fjerne de stålkugler, hvis nødvendigt. Grind 1 min.
  3. Må ikkeCentrifuger røret ved dette punkt (røret vil være skøre). Overfør blandingen (med undtagelse af stålkugler) i en ny RNase-frit mikrorør. Pelletere cellerester i en bordplade mikrocentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter ved 12.000 x g.
  4. Supernatanten overføres til et nyt mikrorør. Tilsæt 0,1 volumener af 1-brom-3-chlorpropan (BCP), ryst kraftigt i 15 sek. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. Spin i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 15 minutter ved 12.000 x g Bemærk: mange RNA-ekstraktionsmetoder protokoller anvender chloroform på dette stadium; BCP er at maksimere RNA udbyttet ved at øge effektiviteten af faseadskillelse.. Holde prøverne ved 4 ° C under centrifugeringstrinnet vil også forøge effektiviteten af faseseparation og reducere forureningen af protein og genomisk DNA i den vandige fase.
  5. Overfør det øverste vandige lag til en ny mikrorør. Præcipitere RNA'et ved tilsætning af 0,5 volumener af iskold isopropanol, invert seks gange til mix. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Spin i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter ved 12.000 x g..

Bemærk: Ud over at inddrive RNA, kan proteiner også udvindes fra det organiske lag og interfase af TRIzol, så både proteomik og transcriptomics analyser kan udføres på de samme prøver. Selvom vi ikke udføre dette trin i vores analyser, TRIzol udvinding giver fremragende repræsentation af opløselige proteiner og større repræsentation af membranen og kerneproteiner end de fleste buffer / detergentekstraktioner. Lee og Lo 17 beskriver en fremgangsmåde til at ekstrahere proteiner ved anvendelse af TRIzol passende for proteomics analyser, herunder 2-D gel og LC-MS/MS.

  1. Supernatanten fjernes. Vask RNA ved tilsætning af 1 ml iskold 70% ethanol (brug DEPC-behandlet vand), og blandes med en kort vortex. Spin i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 5 minutter ved 12.000 x g.
  2. Supernatanten fjernes. Lufttørre pelleten for ent mindst 15 min. Der tilsættes 80 pi DEPC-vand til RNA-pelleten og anbringes ved 55 ° C i 10 minutter. Efterlad ved 4 ° C natten over.
  3. Bestem RNA-koncentrationen ved hjælp af NanoDrop spektrofotometer. Forholdet mellem absorbans ved 260 nm/280 nm bør være mellem 1,8 og 2,1, med 2,1 er optimal.
  4. Tage 30 ug bulk-RNA, tilsættes 4 U DNase I, 60 U RNasin, 10 pi 10x reaction buffer, og DEPC-behandlet vand til at bringe det samlede volumen op til 100 pi. Inkuber ved 37 ° C i 20 minutter.
  5. Oprense RNA under anvendelse af RNeasy Mini kit. Følg producentens anvisninger, undtagen udføre alle centrifugeringer i 30 sek og omfatter alle "valgmuligheder" trin.
  6. Bestem RNA-koncentrationen ved hjælp af NanoDrop, og vurdere RNA kvalitet ved hjælp af "total RNA pico" assay på en BioAnalyzer.
  7. For mRNA oprensning overføres 30 ul Dynabeads til et RNase-frit mikrocentrifugeglas.
  8. Anbring glasset på en magnet for 1-2 min og fjern supernatanten. Resuspendere perlerne i15 pi bindingspuffer. Gentag.
  9. Begyndende med 5 ug totalt RNA, volumenet justeres til 15 pi med DEPC-vand. Opvarm ved 65 ° C i 2 minutter, og anbring på is.
  10. Der tilsættes 15 ul total RNA til 15 pi præ-vaskede perler. Blandes ved pipettering hver 5 min i 30 minutter for at anneale RNA'et til perlerne. Sted på magnet for 1-2 min og fjerne alle supernatanten.
  11. Tilsæt 35 ul vaskepuffer B. Mix ved omhyggelig pipettering. Placer på magneten og fjern forsigtigt supernatanten. Gentag vask to gange.
  12. Eluering af mRNA'et ved tilsætning af 15 ul kold 10 mM Tris-HCI (pH 7,5) og opvarmning til 80 ° C i 2 min. Anbringes straks røret på magneten, Overfør supernatanten til et RNase-frit rør og nedfryses ved -80 ° C. Kvantificer som i 3,8). Udbyttet bør være ~ 1-5% af totalt RNA.

For metabolomisk analyser, udføre protokoller 1 og 2), og fortsæt med 4) nedenfor:

4. Methanol-chloroform Extraktion af metabolitter

Formål: Adskil polære og ikke-polære metabolitter.

  1. Tilsæt antioxidant butyleret hydroxytoluen (BHT) til chloroform ved en koncentration på 0,1 mg / ml for at forhindre autooxidation af lipider under ekstraktion. Brug denne BHT-chloroform for alle efterfølgende trin.
  2. Transfer 200 dyr i afkølet, forvejet koniske skruelåg polypropylenrør, fryse ved -80 ° C, og lyofiliseres. Bestem tørvægten.
  3. Sættes 5-7 zirconiaperler i rørene og homogeniseres i en vulst-piskeris for to cyklusser af 20 sekunder hver på 800 Hz.
  4. Baseret på den tørre vægt af det tungeste prøve, vand, methanol og chloroform tilsættes i de følgende forhold: 11,74 x methanol 10,59 x vand 11,74 x chloroform, hvor x er vægten af ​​den tungeste prøven i gram, og produktet er den volumen i ml. Tilføj alle methanol som beregnet, og 45% af den samlede vandmængde til bead beater røret indeholdende de lyofiliserede hoveder.
  5. Homogenize i perle-tæppebanker yderligere to cykler af 20 sek hver.
  6. Kombiner de volumener chloroform (100%) og resten af ​​vandet (55%) i et konisk hætteglas på is. Derefter overføres vævet blandingen (med perler) til hætteglas. Ryst i 10 min. Inkuber i 10 minutter på is.
  7. Spin i en centrifuge ved 4 ° C i 5 min ved 2.000 x g. Fjern den polære (øvre) fase med en Pasteur-pipette (undgå plast) og sted i et andet mikrocentrifugerør.
  8. Gemme den ikke-polære (lavere) fase i et lille hætteglas og fryse ved -80 ° C. Tørre under en strøm af nitrogengas, sørge for, at røret løber fra nitrogentanken er højrent Tygon at undgå plastificeringsmidler i ekstrakten.
  9. Rehydrere den ikke-polære fase med 620 pi deutereret chloroform. Overfør 600 pi i mærkede NMR-rør. Opbevares i en eksplosion-bevis -80 ° C fryser.
  10. Anbring polære fase i Centrivap og køre indtil røret er helt tør ved 30 ° C (ca. 7 timer).
  11. Rehydrate den polære fase med 620 ul 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,3) i deuteriumoxid med 1 mM TMSP [3 - (trimethylsilyl) propion-2 ,2,3,3-d4-syre] som en intern standard. Vortex for 30 sec. Spin i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 5 minutter ved 10.000 omdrejninger til udfældning af pigmenter og andre store molekyler, der vil forstyrre NMR-spektrene. Overfør 600 pi af supernatanten til mærkede NMR rør.

Representative Results

For at omgå dødelighed induceret af allestedsnærværende udtryk af ekspanderet Atxn3 under kontrol af da-Gal4, indførte vi tidsmæssig regulering af Gal4 med Gal80 ts. Men før du fortsætter med indsamling og nedfrysning af et stort antal fluer, ønskede vi at bestemme udtrykket dynamik i vores transgen under kontrol af Gal80 ts og da-Gal4. For at gøre dette, har vi genereret kors, forlod afkommet ved 18 ° C, indsamlede de voksne fluer, og fastholdt dem i 24 timer ved 18 ° C. Derefter har vi placeret fluerne ved den restriktive temperatur (29 ° C) og inkuberet dem i 0, 6, 12, 24, 36, 48 og 72 timer. Næste, vi opdaget akkumuleringen af den udvidede polyQ allel ved western blot fra enkelte fluer efter offentliggjorte protokoller 10. Ekspression blev først opdaget, men svag 6 timer efter temperaturskift og fortsatte med at stige indtil 48 timer, hvor den nåede mætningsniveauer (figur 2A). Interestingly, en høj molekylvægt bånd af uopløseligt polyQ fremkom efter 48 timer, signalerer den tid det tager for proteinet til dannelse af store aggregater. Vi har også dissekeret fluen hjerner ved hvert tidspunkt at bestemme fordelingen af det ekspanderede polyQ allelen ved immunfluorescens (fig. 2B). Proteinet blev først påvist 24 timer efter temperaturskift, selv med ulige fordeling. Mellem 24 og 48 timer niveauerne af protein fortsatte med at stige, hvilket gør flere hjernecentre tydeligt, herunder de antennal flige og svampe organ fremspring (figur 2B). Mellem 48 og 72 timer ekspressionen af ​​det ekspanderede polyQ allelen nåede maksimale niveauer, hvilket antyder, at Gal4-systemet var fuldt aktiveret på dette tidspunkt. Baseret på disse resultater, har vi udvalgt 24 timer efter at temperaturen skift som det første tidspunkt (dag 1) for efterfølgende forsøg. Samlingerne af fluer 10 og 20 dage gamle blev også målt startende fra temperaturskift (timig 0), som er det tidspunkt, hvor forsøget starter med den nye ekspression af patogene og kontrol transgener.

Når vi kontrolleret, at Atxn3 blev påvist efter 24 timer under kontrol af Gal80 ts og da-Gal4 ved 29 ° C, vi spekulerede på, om disse fluer ville vise tegn på neurodegeneration over 20 dage. Da disse fluer begynder at udtrykke de patogene proteiner som voksne, vi frygtede, at de muligvis brug for en lang inkubationstid at vise neurodegenerative fænotyper. For at bestemme toksiciteten af ​​Atxn3-78Q på disse betingelser, vi indsamlede fluer udtrykker LacZ, Atxn3-27Q, og Atxn3-78Q, og indspillede deres levetid. Henviser fluer, der udtrykker LacZ og Atxn3-27Q vist over 90% levedygtighed efter 20 dage, fluer udtrykker Atxn3-78Q viste lav overlevelse på dag 20 (30%) (figur 3). Faktisk startede Atxn3-78Q fluer til at dø på dag 10 (7% dødelighed) og dag 15 tabet var signifikant (20%), som tog fart i de sidste fem days. Således er disse resultater viste, at voksen ekspression af en patogen genet resulterede i forkortet levetid, en central tegn på de neurodegenerative fænotyper induceret af Atxn3-78Q.

En af de mest kritiske aspekter af denne protokol var den håndteres og opbevares prøver efter frysning for at sikre kvaliteten af ​​det ekstraherede materiale. Vi ekstraheret mellem 15-80 ug total RNA per 200 hoveder (afhængig af alder og genotype) før DNase behandling i henhold til NanoDrop. En tredjedel (6-25 ug) blev udvundet som højrent RNA efter DNase-behandling ved forholdet mellem absorbans ved 260 nm/280 nm. Vi fandt imidlertid, at den bedste måde at bestemme kvaliteten af ​​RNA til fremstilling af cDNA-biblioteker for RNA-seq var at analysere totalt RNA på BioAnalyzer. Heldigvis blev kun en lille mængde RNA (5 ng), der anvendes på BioAnalyzer, så det ikke påvirker evnen til at producere flere biblioteker pr prøve. Som et eksempel, kørte vi to prøver af totalRNA før DNase-behandling på en BioAnalyzer chip, der mistænkes en af dem at blive nedbrudt (figur 4A-C). Den høje kvalitet RNA (prøve 1) producerede tre skarpe RNA-bånd, to lige under 2000 nukleotider (nt) i størrelse og et mindre bånd under 200 nt, der repræsenterer de ribosomale RNA'er (figur 4A). De to bånd ved 2000 nt svarer til 18S rRNA (mindre peak) og to fragmenter fra 28S rRNA (større top), hvilket er et enestående aspekt af rRNA biologi i Drosophila (se figur 4B). Disse egenskaber blev også observeret i BioAnalyzer spor (figur 4B). I modsætning hertil en nedbrudt RNA-prøve (prøve 2) ikke de skarpe toppe på de ribosomale RNA'er, og akkumuleret multiple bånd på mindre end 500 nt (figur 4A). Denne størrelsesfordeling blev let skelnes i BioAnalyzer spor (Figur 4C), hvori brede toppe med kortere størrelse blev noteret. Også vigtigt at bemærke wsom forskellen i andele i y-aksen mellem de to RNA-prøver, hvilket viste, at den nedbrudte prøve havde færre RNA. Kun RNA viser maksimal kvalitet (NanoDrop forhold mellem absorbans ved 260 nm/280 nm mellem 1,8 og 2,1, med 2,1 er optimal, se protokol trin 3.8) vil blive anvendt til frembringelse af biblioteker.

Til udvinding af metabolitter, fulgte vi en klassisk vand / methanol / chloroform (2.0:2.0:1.8) ekstraktionsprocedure 3 opdelt i to trin for at maksimere udvindingen af både polære og ikke-polære metabolitter 35. Efter separation af polære og upolære faser, rekonstitueret vi dem i deutereret vand eller deutereret chloroform, henholdsvis, og tilføjede interne standarder til analyse ved NMR. NMR-spektre opnået ved anvendelse af denne ekstraktionsfremgangsmåde blev godt løst med flade basislinjer og smalle linjer (fig. 5), hvilket indikerer rensning af høj kvalitet ekstrakter, egnet til både stofskifteprofil end identificering af et stort antal metabolitter. Figur 5 viser identifikationen af et par prominente toppe svarende til meget rigelige metabolitter, såsom glucose og sucrose, og to centrale metaboliske syrer, lactat og acetat, ifølge kemiske skift i litteraturen 7. Det kemiske skift (i ppm) udgør den elektromagnetiske afskærmning af et molekyle i forhold til en standard molekyle (TMS, første top fra højre). Flere shieldedmolecules har højere elektron tæthed rundt om kernen og vises til højre for spektret, herunder alkyler. Deshielded molekyler, såsom amid og aromatiske hydrogenatomer vises til venstre af spektret. Den travle midterste del (3-4 ppm) er beriget med sukkermolekyler.

Figur 1

Figur 2
Figur 2. Expression kinetik (A) Western-blot der viser Atxn3-78Q ekspression (Gal80 ts, da-Gal4 / UAS-Atxn3-78Q). På fluer inkuberet ved 29 ° C fra 0 til 72 timer. Et svagt bånd først detekteres ved 6 timer og mætningen nås ved 48 timer efter induktion. (B) Immunofluorescens af hele hjerner i de samme fluer. Hjernerne blev dissekeret, fastsat, end farvet med et antistof, der genkender den ekspanderede polyQ-proteinet. Proteinet først detekteres i svampen organ (MB) fremspring og de antennal lapper (AL). Mellem 48 og 72 timer, når udtrykket grænseværdierne og er meget synlig i hjernecentre med rigelige innervation. Ekspressionsniveauet pr neuron er svag som det ses i den optiske lap (OL), undtagen i nogle få store neuroner mellem OL og den centrale hjerne.

Figur 3
Figur 3. Atxn3-78Q reducerer levetiden Fluer udtrykte lacZ, Atxn3-27Q, og Atxn3-78Q ubikvitært i voksne stadier (Gal80 ts, da-Gal4). Blev overvåget for deres holdbarhed ved 29 ° C. Fluer udtrykker LacZ (blå) og Atxn3-27Q (grøn) viste lave niveauer af dødelighed ved dag 20. I modsætning hertil flyver udtrykker Atxn3-78Q (rød) visesen udtalt dødelighed begyndende på dag 10. Ved dag 15 viste de en 20% reduktion i levedygtighed, som accelererede i løbet af de næste fem dage, nåede en 70% dødelighed på dag 20.

Figur 4
Figur 4. RNA kvalitetsvurdering. RNA fra høj kvalitet og nedbrudte prøver blev kørt på en BioAnalyzer chip. (A) BioAnalyzer drives med en høj kvalitet RNA (prøve 1) og en nedbrudt RNA (prøve 2) ud for en størrelsesmarkør (venstre bane). Bemærk de tre skarpe toppe svarende til ribosomalt RNA i den centrale bane. (B) BioAnalyzer sporing for prøve 1 med to karakteristiske stærke toppe lige under 2.000 nt og en anden under 200. (C) BioAnalyzer sporing af prøve 2, der består af overvejende nedbrudt RNA. Bemærk forskellen i enheder på y-aksen imellem paneler B og C.


Figur 5. Repræsentant 1D NMR spektre af polære metabolitter. Repræsentant 1D proton NMR spektrum af polære metabolitter fra Drosophila og supplerende 2D COSY (korrelationsspektroskopi) og HSQC (heteronukleær single quantum korrelation) eksperimenter for peak opgave. Metabolitter identificeret i henhold til kendte kemiske skift-1: Saccharose, 2: Glucose, 3: Beta-alanin; 4: Acetate, 5: lactat.

Discussion

Med udgangspunkt i vores tidligere erfaringer i transcriptomics 11, 12, stofskifte 15 og neurodegenerative sygdomme 6, 8, præsenterer vi her en ny protokol til indsamling tusindvis af flyve hoveder med voksen-specifik ekspression af patogene gener, og rensning af mRNA og metabolitter for RNA- seq og NMR-spektroskopi hhv. Arten af ​​disse forsøg kræves inkorporering af flere nyskabelser inden fluen indsamling, herunder valget af et allestedsnærværende Gal4 linie og brugen af ​​tidsmæssig regulering af genekspression. Med hensyn Gal4, allestedsnærværende ekspression af transgenerne var afgørende af to grunde. Dels et stort antal af gener involveret i neurodegenerative sygdomme, herunder ATXN3, huntingtin, amyloidprecursorprotein, og superoxiddismutase 1, blandt andre, er bredt udtrykt i neuronale og gliale celler, såvel som i andre celletyper uden for nervesystemet. Vi ønskede atkorrekt modellere dette aspekt af biologi af disse patogene gener ved at analysere konsekvenserne af allestedsnærværende udtryk i stedet for kun at fokusere på neurale udtryk. For det andet er det ikke muligt at samle flyve hjerner i stort tal, men vi kan gøre det med flyve hoveder (over 200 i tre eksemplarer pr betingelse) 11, 12. Idet homogenisering af hele hoveder blander neurale og ikke-neurale væv, allestedsnærværende transgenekspression bliver kritisk til opnåelse af ensartede RNA og metabolitter fra populationer af celler, der udtrykker de samme transgener. Det er vigtigt at bemærke, at da-Gal4 blev valgt for dets nogenlunde ligelig fordeling, ikke på grund af dens høje ekspressionsniveau, selv om en ny rapport antydede, at da-Gal4 ikke kan være helt allestedsnærværende 25. Vi havde tidligere overvejet andre allestedsnærværende Gal4 linjer, herunder arm-, Tub-og Act-GA4, men de alle viste komplekse ekspressionsmønstre i de voksne CNS og muskler, hvilket gør dem mindre endequate til denne undersøgelse. Faktisk viste immunofluorescens i voksne hjerner, som da-Gal4 inducerer udbredt, men svag ekspression, som kun akkumuleres i høje niveauer i hjernecentre bestående af et par tusinde axoner og i et lille antal store neuroner (fig. 2). Selv ekspressionsniveauerne af konstruktionerne var lave, disse forhold dramatisk reduceret overlevelse i en polyQ-afhængig måde. Dette udtryk dynamik opfyldte vores behov og samtidig holde ekspressionsniveauer lave, hvilket var vigtigt for at observere de langsomme, progressive cellulære ændringer induceret af neurotoksiske proteiner.

En forudsigelig konsekvens af at inducere allestedsnærværende ekspression af neurotoksiske proteiner, var, at det forårsagede dødelighed forud for voksen eclosion. Heldigvis er denne komplikation blev omgået med anvendelsen af Gal80 ts. Som diskuteret ovenfor genekspression nåede maksimale niveauer cirka 48 timer efter temperaturskift, hvilket passer godt med tiden frommig af eksperimentet. Én yderligere fordel ved anvendelse Gal80 ts var, at i modsætning til eksperimenter, hvor de neurotoksiske proteiner konstitutivt eksprimerede pan-neuralt, var der ingen ekspression under udviklingen af nervesystemet. Således er anvendelsen af Gal80 ts skabt en "ren" baggrund, hvor nervesystemet er ikke udsat for de toksiske virkninger af disse neurotoksiske proteiner under følsomme udviklingsstadier. Efter vores mening resulterede aktivering af genekspression i voksne i en bedre model for denne klasse af voksen-debut patologier. Men Gal80 ts også indført nogle komplikationer forbundet med temperaturændringer. Den ene var, at den voksende fluer ved lave temperaturer (18-20 ° C) forsinket livscyklus, hvilket gør forsøgene betydeligt længere. Det er også velkendt, at voksende fluer ved høje temperaturer (29-31 ° C) fremskynder deres metabolisme, som illustreret ved den afkortede levetid sammenlignet med fluer ældet ved 25 ° C. SiNCE de transskriptionelle og metaboliske undersøgelser vil blive udført i fluer alderen ved høj temperatur, kan vi forvente at se store ændringer i cellulære stress veje og energi stofskifte. Det er derfor, det var så kritisk at indføre to kontroller til eksperimentet, den ene med den ikke-patogene Atnx3-27Q og en uafhængig kontrol udtrykker LacZ. Disse kontroller vil give et grundlag for genekspression og metaboliske ændringer forbundet med høj temperatur, så vi kan identificere disse ændringer er direkte forbundet med ekspressionen af ​​giftige Atxn3. Samlet set har vi indført en række ændringer i indsamlingen af ​​fluer, der giver mange fordele - og et par ulemper (temperatur spørgsmål og næste afsnit) - for at studere voksen-debut, progressive sygdomme.

Selv om den tidsmæssige regulering med Gal80 ts var en nyttig Derudover er det også indført en uventet komplikation. Mens generere fluerne bærer både Gal80 ts and da-Gal4 konstruktioner i en stabil bestand, bemærkede vi, at fluer dobbelt homozygote for begge konstruktioner var levedygtige, men sterile. Siden homozygot Gal80 ts og da-Gal4 stammer var levedygtige og fertile i sig selv, er det ikke klart, hvorfor kombinationen viste lav fertilitet. Det har været kendt i nogen tid, at Gal4 er mindre giftige for Drosophila væv 22. Det er muligt, da, at den heterologe ekspression af gær transskriptionsrepressor Gal80 bidraget til toksiciteten af ​​Gal4 ved at gribe, potentielt med det endogene transkriptionelle maskineri. Denne toksicitet kan forværres af den allestedsnærværende fordeling af Gal4 under kontrol af da et gen, der spiller en central rolle i tidlig udvikling og seksuel beslutsomhed. Uanset de underliggende årsager til sterilitet, vi udvidet Gal80 ts, da-Gal4 fluer ved at fastholde en balanceaksel kromosom i da-Gal4 samtidig holde homozygosity for Gal80 t s, hvilket antyder, at Gal4 er et mere kritisk bidragyder til sterilitet. Denne opløsning var nøglen, fordi vi brugte hundredvis af disse hanner hver anden uge til at krydse med hver af de UAS transgener. Men krydser bærer en balanceaksel skabt ekstra arbejde i forbindelse med udvælgelsen af ​​passende afkom. Kun en fjerdedel (25%) af afkommet blev opsamlet (hunner, ikke-Afbalanceringsapparat), hvorved udvælgelsen tid, reduceres udbyttet pr flasken, og øgede antallet af flasker, der er nødvendige for at opnå mindst 200 fluer pr genotype / replikere / tid punkt. Samlet set, selv om indsamlingen af ​​fluer blev tidskrævende på grund af de store nødvendige sæt, er vi overbeviste om, at studere cellulære ændringer kun et par timer efter aktivering af ekspressionen af ​​patogene gener allestedsnærværende vil identificere nye og interessante processer impliceret i progressiv neurontab.

Når den genetiske design var på plads, vi betalte særlig vægt påeksperimentelle manipulationer, der kan medføre biologisk variabilitet. Først vi kun indsamlet jomfruelige hunner for at sikre homogeniteten af ​​prøverne, selv om det betød at smide mænd og kontrol af afkom to gange om dagen. Under ældning blev højst 12 fluer holdes i samme hætteglas for at undgå overbelægning og stress. Også, før frysning, blev fluer overført til kryohætteglas uden bedøvelse og fik lov til at komme sig efter overdragelsen i 30 min. Disse tilsyneladende trivielle faktorer kan påvirke genekspression og metabolisme, indførelse variabilitet i sidste ende, som ikke ville være relevant for eksperimentet.

For at sikre kvaliteten af ​​de frosne materialer (hoveder, RNA og metabolitter), vi betalt særlig opmærksomhed til hver detalje, der kan bidrage til vævsnedbrydning. Da fluer overføres til kryohætteglas i små mængder (op til 12 fluer pr hætteglas), måtte vi hente mange hætteglas til indsamling af 200 hoveder. Disse manipulationer blev den med største omhu i et koldt rum med tøris eller flydende nitrogen. Samlingen af ​​fluer, adskillelse af hovedet, og oprensning af informationsmolekyler, er for tidskrævende at opdage, at materialet blev nedbrudt ved afslutningen af ​​denne lange proces. Ud over at sikre, at materialet bevarer sin kvalitet, beskriver denne protokol adskillige trin, som maksimerer udbyttet af RNA og metabolitter, herunder frysetørring og bead beating. Disse trin er ikke påkrævet for normal ekstraktioner for RT-PCR eller kvantitativ PCR fra hele fluer, men de er kritiske for ensartet oprensning fra små prøver, såsom flyve hoveder. Vi konstateret, at andre trin påvirke udbyttet af RNA. For eksempel producerede ældre fluer signifikant færre RNA end yngre fluer, uanset af genotype. Denne observation foreslog, at ældning ved høj temperatur inducerer dramatiske ændringer. Også udtrække RNA fra 100 hoveder var faktisk mere effektiv end fra 200 hoveder, så vi fortsatte med at rense i to batches på 100 per prøve, kun at kombinere dem efter kontrol af kvalitet med BioAnalyzer. Også kolonner til mRNA oprensning syntes at mætte let, så mængden af ​​total RNA benyttes per kolonne skal optimeres.

Metabolitter er en forskelligartet blanding af små molekyler, så kvalitetskontrol er vanskeligere end med DNA, RNA eller proteiner. Desværre er der ingen komplette katalog af metabolitter for enhver dyremodel på dette tidspunkt, noget der kan være under forandring i de kommende år takket være anvendelsen af ​​flere teknologiske nyskabelser, herunder NMR-spektroskopi og den udvidede brug af væskekromatografi - massespektrometri ( LC-MS). Selv om NMR er mindre følsom end MS, viser mange lovende fordele, herunder uden ødelæggelse af prøver, der ikke analytiske procedurer, der indfører bias (LC), og høj reproducerbarhed, der giver statistisk sammenligning af Reps og adskillige eksperimentelle betingelser 24. Således kan prøven væregentestet for at kontrollere observationer eller re-analyseres ved LC-MS til at validere NMR-data. Her viste vi foreløbige NMR-data fra fluer, som vi bruger til at udarbejde et katalog over metabolitter i Drosophila. Denne information vil være afgørende for, hvordan ekspression af patogene gener ændrer normale stofskifte, åbne et nyt vindue til yderligere at forstå de cellulære mekanismer bag neurodegenerative sygdomme.

Nyopståede OMIC teknologi giver den bedste mulighed for at studere neurodegenerative sygdomme på et detaljeringsniveau, der ikke tidligere opnået. Måske den største hindring for at overvinde disse high-throughput undersøgelser er den trofaste samling af reproducerbare prøver, der kan analyseres med meget følsomme metoder. De procedurer indført her giver en måde at opnå denne overensstemmelse, og vil føre til resultater, der let kan sammenlignes på tværs af datasæt. Selvom vores primære forskningsinteresser involverede undersøge ændringer af gen expression og metabolitter, kan de genererede fluer også udsættes for proteom eller epigenomic analyse. Proteom og epigenomic forandringer under neurodegeneration sandsynligvis også være af afgørende betydning for sygdomsforløbet. Når det videnskabelige samfund sidste ende identificerer det fulde spektrum af molekylære ændringer, der påvirker sygdomsprocessen, vil en sand systemniveau forståelsen af ​​sygdommen være mulig. På dette niveau vil sygdomsmodificerende behandlinger til sidst fremstår som en realitet.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Janice Santiago, Gabriel Figueroa, og Jose Herrera for teknisk bistand og Bloomington Drosophila Stock Center på Indiana University for flyve bestande. DH og CW blev støttet af midler fra NSF-IOS-1.051.890. PF-F og LMM blev understøttet af en salgsmulighed Seed Fund fra University of Florida.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jazz mix Drosophila food Fisher Scientific AS-153
Cryogenic Vials Corning, Inc. 430658
Microtubes Axygen MCT-175-C-S
RNaseZap Ambion AM9786 Treat all surfaces
5/32" grinding balls, stainless steel OPS Diagnostics GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-bromo-3-chloropropane Sigma B9673-200ML
Isopropanol Fisher Scientific A416-500
DEPC-treated water Fisher Scientific BP561-1
DNase I Promega M6101
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification kit Invitrogen 610-06
Conical Screw Cap Tubes Fisher Scientific 02-681-344
Screw Caps w/O-Rings Fisher Scientific 02-681-364
2.0 mm Zirconia beads BioSpec Products 11079124zx
Methanol, HPLC-grade Fisher Scientific A4524
Chloroform, HPLC-grade Acros organics AC39076
Drosophila Stocks
da-Gal4 Bloomington Stock Center 5460
Gal80[ts] Bloomington Stock Center 7108
UAS-MJD-27Q Bloomington Stock Center 8149
UAS-MJD-78Q Bloomington Stock Center 8150
UAS-LacZ Bloomington Stock Center 8529
Equipment
Inject+Matic Sleeper INJECT+MATIC
Microsieve Set Fisher Scientific 3410531 Use two largest meshes
Geno/Grinder 2000 SPEX Sample Prep SP2100-115
Sorvall Legend Microcentrifuge ThermoScientific 75002436
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System LabConco 7670041
BioAnalyzer v. 2.6 Agilent 2100
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 123-21D
NanoDrop spectrophotometer ThermoScientific
Fast Prep bead-beater ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Plus Labconco 022820001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
  3. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  4. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  5. Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
  6. Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
  7. Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  8. Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
  9. Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
  10. Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
  11. Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
  12. Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
  13. Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
  14. Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
  15. Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
  16. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
  17. Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
  18. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
  19. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  20. Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
  21. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
  22. Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
  23. Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
  24. Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
  25. Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  26. Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
  27. Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  28. Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
  29. Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
  30. Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
  31. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
  32. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  33. Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
  34. Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
  35. Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).

Tags

Genetik biokemi molekylærbiologi Neurobiology Neuroscience Bioengineering Cellular Biology Anatomi neurodegenerative sygdomme Biologisk Assay Drosophila bananflue hoved separation oprensning mRNA RNA cDNA DNA udskrifter metabolitter replikater SCA3 neurodegeneration NMR genekspression dyremodel
Oprensning af udskrifter og metabolitter fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, K., Sanchez-Garcia, J.,… More

Jensen, K., Sanchez-Garcia, J., Williams, C., Khare, S., Mathur, K., Graze, R. M., Hahn, D. A., McIntyre, L. M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads. J. Vis. Exp. (73), e50245, doi:10.3791/50245 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter