Summary
우리는 여기에서 mRNA의 추출 및 정제를위한 절차와의 metabolites을 설명
Abstract
지난 10 년 동안, 우리는 모델 생물로 Drosophila를 사용하여 neuronal 변성의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 과일 파리는 분명 실험 이점을 제공하기는하지만, neurodegenerative 질병에 대한 연구는 주로 유전 적 상호 작용, 조직학, immunofluorescence, 그리고 단백질 생화학 등의 전통 기술에 의존하고 있습니다. 이 기술은 잘 정의 된 생물 문제의 단일 유전자의 역할에 대한 자세한 이해 될 기계론의, 가설 기반 연구에 대한 효과적입니다. 그러나, neurodegenerative 질병은 매우 복잡하며 시간이 지남에 따라 여러 세포 세포 기관 및 프로세스에 영향을 미칩니다. 새로운 기술과 omics 시대의 등장은 복잡한 질병을 근간 글로벌 세포 섭동을 이해 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 같은 Drosophila와 같은 유연한 모델 생물로 인해 자신의 강력한 ANNOT의 새로운 기술을 적응에 이상적입니다ation 높은 tractability. 이 작은 동물과 하나 문제는,하지만, 이러한 플라이 두뇌 관련성이 높은 조직에서 충분한 정보 분자 (DNA, mRNA, 단백질, metabolites)의 정화입니다. 다른 도전 실험은 복제에 대한 파리 다수의 수집 (통계 견고성에 대한 중요한)와 고품질 생물 소재의 정화를위한 일관성있는 절차를 개발로 구성되어 있습니다. 여기, 우리는 유전자 표현과 신진 대사의 글로벌 변화가 neurodegenerative 질병에 기여하는 방법을 이해하기 위해 플라이 헤드 및 성적 증명서의 추출 및 metabolites 수천 수집을위한 절차를 설명합니다. 이러한 절차는 쉽게 확장하고 질병에 proteomic 및 epigenomic 공헌 연구에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
지난 세기에 Drosophila는 특히 개발에 깊은 생물 질문, 세포 생물학, 유전학 및 신경 생물학 1 조사를위한 귀중한 실험실 도구로 입증되었습니다. 이러한 성공의 이유는 과일 파리가 조작 끊임없이 확장 도구 상자 18, 21, 31가 쉽게한다는 점입니다, 고품질 주석 26와 비교적 간단 게놈을 보유하고 있습니다. 세 노벨상 상금의 수여 (1933, 1995, 2011)에 의해 그림과 같이 플라이 지역 사회에서 창의력과 지속적인 혁신과 함께 이러한 기술 장점은, 광범위한 과학적 공헌으로 이어 왔습니다. 최근 Drosophila 인간 maladies, 주로 발달 장애, 타고난 면역, 암, 그리고 neurodegeneration 2 공부와 관련된 모델로 등장했다. 우리는 특히 neurodegenerative 질병의 세포와 분자 기초를 잠복 근무에 관심이 있습니다. 이러한 복잡하고 다양한 공동nditions가 비정상적으로 접혀 단백질의 어셈블리, 가능성이 용해 oligomers에 연결되어 있으며, 따라서 쉽게 파리에서 모델로하고 있습니다. 주요 neurodegenerative 알츠하이머, 파킨슨 등의 질병, 그리고 헌팅턴의 질병, amyotrophic 측면 경화증, 여러 ataxias, tauopathies, prion 질환 및 기타 희귀 질환의 모든, 지난 십오년 23 파리에서 모델로되었습니다. 플라이 연구소는 주로 병원성 단백질의 neurotoxicity에 연루 새로운 유전자를 식별 할 수 Drosophila 유전학의 떡의 세계를 탐험 이용하여 이러한 질병을 이해에 기여. 신경성 폭포에 관련된 새로운 유전자가 발견되면, 그들의 효과는 일반적으로 비정상적인 단백질 conformations의 양 및 유형을 평가하는 단백질을 배포하고 세포 병리을 확인할 수 immunofluorescence 조직학 변성의 규명 패턴 등의 전통 접근, 그리고 생화학 분석에 의해 분석 . 마지막으로, behavioral 분석은 질병 결과의 기능 표시 장치 역할을합니다. 이 잘 구축 된 기술이 산화 스트레스와 mitochondrial 장애 13, 전사 dysregulation 9, 27, 30, 비정상 axonal 교통 및 시냅스 활동 14 이상 RNA를 포함하여 질병 과정에 하나의 기여 또는 몇 후보 유전자를 검사하기 위해 악용 된 생물학 9 dysregulated 세포 신호 29, ER의 dyshomeostasis 6, 휴대 proteostasis 33, 그리고 많은 다른 23 방해. 그러나,이 독성 단백질이 여러 상호 연결 경로를 동시에 영향을 줄 수 있습니다 방법을 확실하지 않습니다, 무슨 일이 변경의 시간 순서이며, pathogenesis 각 경로의 상대적 기여은 무엇입니까. 몇 십년 동안 연구 한 유전자에 초점을 맞추고, 인간과 동물 모델 모두에서 가설 중심의 접근 방법의 원인이되는 세포 메커니즘의 불완전, 수수께끼 사진에 이르게neurodegeneration. 이러한 독성 단백질 어셈블리 neuropathology의 원인이되는하여 정확한 메커니즘의 현재 가난한 이해가 질병 수정 요법의 발전에 중요한 제한 사항입니다.
우리는 지금 이러한 병원성 단백질 글로벌 세포 섭동를 유도하는 방법 이해하는 새로운 접근의 응용에 관심이 있습니다. omics 시대의 등장은 가까운 장래에 효과적인 질병 치료로 이어질 수 있습니다 정교한 높은 처리량 기술을 사용하여 복잡한 생물학적 문제의 프로빙 깊은 수 있습니다. 유전자 발현 (transcriptomics) 연구는 높은 품질의 특수 효과를 가장 성적 증명서를 예측할 수 있기 때문에 여러 게놈 시퀀스의 완료에 따라 설립되었다. 스크립트 분석 (RNA-seq)에 차세대 시퀀싱의 최근 응용 프로그램은 편견 접근, 개선 양적 범위 및 비용 절감 32을 포함 microarrays,에 비해 새로운 장점과 기회를 제공하고 있습니다.우리는 더 나은 dominantly 상속 운동 장애의 가장 일반적인 형태, Spinocerebellar 운동 장애 유형 3 (SCA3) 또는 마차도 - 조셉 질환을 이해하는 RNA-seq의 장점을 이용하고 싶습니다. SCA3는 Ataxin3 유전자 (ATXN3) 16 편대의 편대장 trinucleotide 확장으로 인한 전체 penetrance와 monogenic, 지배적 인 질병입니다. 이 변이는 통합하는 것이 쉬운 만드는 긴 polyglutamine (polyQ) 트랙 Atxn3 단백질의 생산에 연결됩니다. 돌연변이 Atxn3 모든 질병 관련 섭동에 대한 책임 SCA3의 신경성 에이전트이기 때문에,이 새로운 omic 방법을 적용하기위한 이상적인 병입니다. 또한, SCA3는 파리 34 모델 초기 neurodegenerative 질병 중 하나입니다.
장소에 넣어 동안 RNA-seq를 위해 비행을 머리에 다수의 수집을위한 절차, 우리는 우리가 다른 정보 분자의 글로벌 연구를 수행하기위한 동일한 자료를 사용할 수 있다는 것을 알았습니다. 다른 신흥 discip 중선, 단백질 체학, epigenomics 및 metabolomics는 아니지만 도전하지 않고, 이전에 달성하지 깊이에서 세포 병리학의 검사를 할 수 있습니다. 으로 mRNA에 비해 단백질과 metabolites의 카탈로그는 가능한 모든 접합 변형 및 모든 정상과 병원성 metabolites의 더 많은 수수께끼의 출처를 예측의 증가 어려움으로 인해이 시간에 매우 불완전하다. 대형 노력은 현재 많은 생물과 질병 조건에서 단백질을 카탈로그에 진행되고 있습니다. 이를 위해, 우리는 Drosophila와 같은 간단한 유기체를 사용 SCA3 pathogenesis에 변경된 metabolites의 기여에 초점을 싶었어요. 이 특히 높은 재현성을 제공하고 샘플 5, 24 파괴하지 않는 핵 자기 공명의 최근 도입 (NMR)로, 비교적 새로운 유망 분야입니다. 우리는 신진 대사 프로파일이 neurodegenerati에 연루 식별 생체과 질병 메커니즘에 기여할 수있는 제안있습니다.
이 omic 프로젝트 하나 중요한 고려 사항들은 크고 균일 한 샘플 (200 플라이 헤드)뿐만 아니라 정확한 정화 기술을 실험 편차를 최소화하기 위해 필요한 것입니다. 우리는 microarrays 이전에 사용하고 또한 RNA-seq 12 최근에 사용했던 절차에 따라 파리를 수집하기 시작했다. 하지만 우리는 곧 SCA3 구조를 misexpressing에 관련된 문제가 발생했습니다. 첫째, 우리는 분석을위한 대상 조직은 뇌했다 이러한 실험 4에 대한 Gal4 드라이버를 선택했습니다. SCA3은 뇌 질환이기 때문에 명백한 선택은 범 신경 드라이버 것입니다. 우리가 전체 머리의 mRNA와 metabolites를 수집하고자 있기 때문에,이 옵션은 조직의 구조를 표현하고 비 표현의 혼합 물질을 생산합니다. 모든 세포 구조를 표현 균일 한 샘플을 생성하기 위해, 우리는 약 하긴하지만 유비쿼터스 드라이버 라인, daughterless (다) - Gal4를 사용하기로 결정했습니다. Interes간지러운, ATXN3 20을 포함 neurodegenerative 질병,에 연루 유전자의 대부분은 유비쿼터스 표현의 선택이 적절한 만들고 폭 넓은 분포되어 있습니다. 병원성 Atxn3-78Q의 유비쿼터스 표현 개발 중에 lethality을 야기 그런 다음, 우리는 두 번째 문제가 발생했습니다. 이 lethality를 무시하기 위해, 우리는 Gal4 19의 시간 활성화를 제어 할 수 Gal80 TS를 통합. 이것은 우리가 20 일 동안 실험 파리, 나이를 수집를 동결하고, RNA (TRIzol) 또는 대사 (메탄올 - 클로로포름) 추출 (그림 1) 중 위해 동결 건조 된 머리를 처리 할 수있었습니다. 우리는 이미 transcriptomic 및 metabolomic 분석을위한 샘플을 얻기 위해이 프로토콜을 사용했지만,이 기술에 대한 다른 명백한 응용 프로그램 (예 : proteomic 또는 신경 peptidomic 분석)가 있습니다.
실험 개요 :이 프로토콜의 전반적인 목표는 consi의 컬렉션을 지원하는 것입니다성적 증명서와 metabolites의 추출을위한 플라이 헤드의 스텐트 샘플. 이러한 절차의 구체적인 목표는 Atxn3-27Q 및 Atxn3-78Q을 (비 병원성 및 병원성 실험 구조) 표현 파리뿐만 아니라 하나의 샘플이 200 플라이 헤드로 구성되어 있습니다 LacZ (제어 구조)를 취득하는 것입니다. 현재의 기술은 단일 세포 28 등의 매우 작은 샘플의 분석을 할 수 있지만, 우리는 따라서 우리는 높은 통계 자신감과 질병 과정과 관련된 세포 변경 사항을 식별 할 수 있도록, 실험 생물 및 기술 변화를 제거하기 위해 200 헤드를 풀링. 이 접근 방식은 퇴행을 유도하는 가장 중요한 경로를 향해 우리를 연결해 인구에 일관성을 유전자 발현의 만 변화를 감지하도록 설계되었습니다. 우리가 이러한 파리의 머리에 나이 의존 변화에 관심이 있기 때문에, 각 유전자형은 1, 10에 획득하고, 나이 이십일되었습니다.
이들의 근본적인 측면글로벌 분석은 생물의 생산을 지원에게 강력한 통계 분석을 복제합니다. microarrays와 RNA-seq과의 이전 경험은 세중의에 생물학적 샘플의 분석 데이터를 11, 12의 강력한 통계적 유의미성을 제공합니다 제안합니다. 우리는 각 유전자형과 시간 지점에 대한 하나의 생물 복제 (담당자 1) 생성하는 방법) 제 1 항에 대해 설명합니다. 이러한 절차는 담당자 2, 3을 생성하는 반복, 또는 긴 각 담당자가 제대로 식별되기 때문에, 병렬로 수행 할 수 있습니다. 세 담당자가 설정 목표이지만 사분의 일 (또는 다섯째) 담당자가 높은 하나 이상에 노화 동안 파리의 낮은 수율, 분실에 관한 문제 나 자료의 우발적 인 손실을 (파리, 헤드, 또는 RNA) 충당하기 위해 권장합니다 샘플.
우린 10 십자가는 (문자 AJ에 의해 식별 병) 200 헤드 / 유전자형 / 시간 지점을 얻기에 충분한 자손을 생산 것으로 나타났습니다. 익스트림주의 병 많은 수의 때문에, 혼동을 방지하기 위해 적용되어야합니다다시 한 담당자 (10 병 × 3 genotypes × 3 시간 포인트 = 90 병) 얻기 위해 필요합니다. 이를 위해, 우리는 유전자형, 시간 가리킨 병 편지를 사용하여 각 병을 지정. 예를 들어, SCA3-27Q 20E는 20 일 세 Atxn3-27Q을 표현 파리의 다섯 번째 병 (10의)를 의미합니다. 자손의 eclose되면 파리는 고유 한 식별자로 표시된 별도의 시험관에 보관됩니다.
우리는 각 샘플, 병, Excel 스프레드 시트에서 수집 포인트 (아침 저녁)에 얻은 파리의 번호를 유지하고있다. 우리는 이전에 계정 lethality 및 escapees로 가져 동결에 유리 병 당 파리의 수를 개정. 그 마지막 카운트에서 200 파리를 추가 병을 쉽게 따라서 샘플의 보존에 기여, 냉장고를 열기 전에 찾을 수 있습니다. 한 병에서 수집 한 파리는 하나의 공화국에서 사용할 수 있기 때문에 모든 담당자가 여러 병에서 파리를 포함하고 있지만, 우리는 생물 복제 당 자신의 기여를 극대화. 우리는 보유교체 샘플과 같은, 또는 기타 관련 실험 (서쪽 얼룩, qPCR)를 다른 담당자에 대한 자신의 계획 담당자에 사용하지 병에서 파리.
Protocol
1. 복제를 생성 및 파리 (주의, 액체 질소를) 얼어 죽을
목표 : 최소한 200 유전자형 / 시간 포인트 당 여성, 그리고 플래시 동결을 수집합니다.
- Genotypes : Gal80 TS, 다 - Gal4, daughterless 규제 지역과 온도에 민감한 Gal80의 통제하에 Gal4의 유비쿼터스 표현 변형. 제어 라인으로, 우리는 이전에 더 해로운 효과를 유도 없다고 표시되어있는 UAS-LacZ를 사용했습니다. UAS-Atxn3-27Q와 UAS-Atxn3-78Q, 비 병원성 및 병원성 실험 구조, 각각. (Y, HS-숨 건설이 처녀의 여성의보다 효율적인 수집을 위해 이전에 사용하지만, 때문에 Gal80 TS와 Y, HS-숨을 소개하는 데 필요한 추가 시간에 대항하여 결정되었습니다, 다 - Gal4 염색체 II와 III.)
- 병에 10 여성 5 남성을 결합하여 모든 주식을 확장s은 (는) 인구 과잉되지 않도록 할 수 있습니다. 모든 실험은 준비가 용이하며 진드기와 빠른 Drosophila의 성장과 낮은 침입을 촉진 재즈 믹스 플라이 미디어에서 실시되었다.
- 때마다 포인트 다 - Gal4 남성, 100 UAS-Atxn3-78Q 처녀 (한 UAS 라인을 예로 들어 사용됩니다), 50 Gal80 TS를 수집합니다.
- 유전자형 / 시간 포인트 당 10 십자가를합니다. 이산화탄소의 남성과 여성 (CO 2) 침대 / 패드를 마취. 장소 십 버진 UAS-Atxn3-78Q 파리 (5 일 이상 없음 이상) 다섯 남자 Gal80 TS, 다 - Gal4 각 대형 병으로는 효모 붙여 넣기 (rehydrated 건조 효모)를 타서. genotypes, 시간 점, 병 식별자 (문자 AJ)로 병을 라벨 및 25 ° C.에 그들을 배치
- 이일 후, 병에서 성인을 취소 건조 효모의 뿌려 최적의 애벌레의 성장을 장려하는 물 물총을 추가하고 18 ° C (Gal80 활성화에 병을 배치억압 Gal4). 이 처녀의 여성 비해 수정 된에서 파생 자손의 실험 다양성을 소개 할 수 있으므로, 십자가를 복사하지 마십시오. 또한, 각 병의 자손은 독립적 인 생물 복제 (각 병이 고유의 자손을 생산) 대표하지만, 이전 십자가 (부) (같은 유전 헌법에 대한 추가 자손) 복제 기술이 될 것입니다.
- 친구들이 18 ecloses 때 ° C가, CO 2 침대 / 패드에 마취 원하는 genotypes의 처녀를 수집, 그리고 (유리 병 당 2-12 파리)와 작은 병에 넣습니다. 병 식별자를 갖는 레이블 병. 수영장은 다른 병에서 날아하지 마십시오. 24 시간에 18 ° C에서 다시 튜브를 놓습니다. 자손을 극대화하기 위해 연속 아침 저녁에 계속 수집.
- 각 유리 병은 18 ° C에서 24 시간을 완료하면, 29 ° C (Gal80 비활성, Gal4 활성화)로 이동. 이 일 0 실험의 시작 지점, t이다그는 자신의 표현을 시작 transgenes.
- 그들은 일 10, 20에 도달 할 때까지 파리는 매 2 일마다 튜브를 청소 전송합니다.
- 파리가 원하는 세 (1, 10, 20 일)에 도달하면, 작은 유입 경로를 사용하여 미리 표시 cryovials에 음식 병에서 계산하고 전송할 수 있습니다. 파리를 마취하지 마십시오. 벤치에 튜브를 반전.
- 파리의 전송 (스트레스)에서 복구 할 수 있도록 30 분을 기다려야 다음에 액체 질소와 저장소에 빠져 튜브를 플래시 고정 미리 표시, 사전 차가운 냉동고 상자 기억 :. 동일한 순서로 파리 고정 그들은 샘플에서 cryovial 제복에서 보낸 시간을 만들어 cryovial로 전송되었습니다.
2. 플라이 헤드의 수집 및 Lyophilization (콜드 룸, 사전 냉기를 느낀 모든 장비,주의, 액체 질소와 드라이 아이스의 수행)
목표 : 빠른 분리, 수집하고, 조직의 동결 - 건조.
- Assem경 체 (몸을 수집하는 상부 챔버에서 가장 큰 메쉬, 헤드를 수집하는 하부 챔버에서 두 번째로 큰, 작은 부품을 수집 할 수있는 바닥에 뚜껑)와 -80에서 사전 냉기 적어도 30 분에 ° C.주세요
- 같은 병에서 유래 파리의 기여를 극대화하여 cryovials에서 200 파리를 수집합니다. 아침이나 저녁에 수집 파리 사이의 차이를 보상하기 위해, 모든 예제는 동일 아침 / 저녁 비율 (우리는 아침 47 % 사용 / 53% 저녁)를 사용하도록주의 :. 2 100 머리 샘플에서 발생하는 RNA가 결합 할 수 있습니다 나중에 하나의 복제 200 파리의 동등한를 생성합니다.
- 5 분에 드라이 아이스를 parafilm (~ 9 X 14cm)의 조각을 죽일거야.
- parafilm, 한 번에 몇로 전체 파리와 cryovials을 비우, 개수는 100 파리에 도달 할 때까지 붓, 그리고 드라이 아이스의 다른 cryovial에 저장을 사용하여 이동합니다.
- 액체 질소에 체 수영, 상단 chamb에 100 파리 추가어. 1 분에 적극적으로 체를 흔들어. 다시 액체 질소에 몸을 담그고, 1 분 동안 흔들.
- -80에서 체, microtube에있는 하부 챔버에서 고개를 수집하고, 장소를 열고 ° C.
- , microtubes를 열고 parafilm의 정상을 포장하고, 작은 구멍을합니다.
- 이일의 최소 lyophilizer에서 샘플을 놓습니다.
3. 총 RNA 추출 및 mRNA 정화 (RNaseZap있는 모든 표면 취급, 자주 변경 장갑)을
목표 : 수율을 극대화하기 위해 조직을 균질화, 총 RNA를 추출하고, mRNA를 정화.
- 동결 건조기에서 샘플을 제거하고 각 microtube에 세 작은 살균, 철강 연삭 공을 추가 할 수 있습니다. 제노 / 그라인더의 장소, 1 분에 1,500 스트로크 / 분에서 실행합니다.
- , 튜브를 열고 1 ML의 TRIzol을 추가하고 parafilm으로 튜브를 밀봉. 1 분을 부러, 필요한 경우 철강 공을 제거합니다 거꾸로 튜브를 누릅니다. 1 분을 부러.
- 마이 시점에서 튜브를 원심 분리기 (튜브 부서지기 쉬운 것입니다.) 새로운 RNase 무료 microtube에 혼합물을 (철강 공 제외) 전송합니다. 펠렛 4 번 테이블 microcentrifuge에있는 세포 잔해 ° C 12,000 X g에서 10 분에.
- 새로운 microtube에 표면에 뜨는을 전송합니다. 1 - 브로 모-3-chloropropane (BCP)의 0.1 볼륨을 추가, 15 초에 힘차게 흔든다. 3 분 동안 실온에서 알을 품다. 4에 microcentrifuge에 스핀 ° 12,000 X g 주에 15 분에 C : 많은 RNA 추출 프로토콜이 단계에서 클로로포름을 사용하여, BCP는 상 분리의 효율을 증가하여 RNA 수율을 극대화하기위한 것입니다.. 원심 분리 단계에서 4 O C에서 샘플을 유지하면 위상 분리의 효율성을 향상시키고 수성 단계로 단백질과 게놈 DNA의 오염을 줄일 수 있습니다.
- 새로운 microtube에 상단 수성 레이어를 전송합니다. 얼음처럼 차가운 이소프로판올의 0.5 볼륨을 추가하여 RNA를 침전, 여섯 번 반전 마일에X. 10 분 동안 실온에서 알을 품다. 4에 microcentrifuge에 스핀 ° C를 10 분에 12,000 X에서 g.
참고 : RNA를 복구하는 것 외에, 단백질도 TRIzol의 유기 층과 계면에서 추출 할 수 있으므로 두 단백질 체학 및 transcriptomics 분석이 동일한 샘플에 수행 할 수 있습니다. 우리는 분석이 단계를 수행하지 않았습니다 만, TRIzol 추출 수용성 단백질의 훌륭한 표현 가장 버퍼 / 세제 extractions보다 막과 핵 단백질의 높은 표현을 산출. 리 및 소호 17 2-D 젤 및 LC-MS/MS를 포함한 단백질 체학 분석을위한 적절한 TRIzol 사용 단백질을 추출 할 수있는 절차를 설명합니다.
- 표면에 뜨는을 제거합니다. 한 ML 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 (DEPC 처리 된 물을 사용), 그리고 짧은 소용돌이와 혼합을 추가하여 RNA를 씻으십시오. 4에 microcentrifuge에 스핀 ° C를 12,000 X g에서 5 분을 위해.
- 표면에 뜨는을 제거합니다. 에어 건조를위한 펠릿t 적어도 15 분. RNA 펠렛에 DEPC 물 80 μl를 추가하고 10 분 동안 55 ° C에서 넣습니다. 4 ° C 하룻밤에 둡니다.
- NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 결정합니다. 260 nm/280 나노 미터의 흡광도의 비율은 2.1 최적거든요, 1.8 및 2.1 사이 여야합니다.
- 100 μl의 총 볼륨을 가지고 4 U DNase I, 60 U RNasin, 10 μl 10X 반응 완충액 및 DEPC - 처리 물을 추가, 30 μg 일괄 RNA보십시오. 20 분에 37 ° C에서 알을 품다.
- RNeasy 미니 키트를 사용하여 RNA를 정화. 30 초에 대한 모든 centrifugations을 수행하고 모든 "선택"단계를 포함 제외하고 제조업체의 지침을 따르십시오.
- NanoDrop를 사용하여 RNA 농도를 결정하고, BioAnalyzer의 "총 RNA의 피코"분석을 사용하여 RNA의 품질을 신고 할 수 있습니다.
- mRNA 정화를 들어, RNase 무료 microfuge 관으로 30 μl Dynabeads를 전송할 수 있습니다.
- 1-2 분을위한 자석에 튜브를 놓고 표면에 뜨는 제거합니다. 에 구슬을 Resuspend바인딩 버퍼 15 μl. 반복합니다.
- 총 RNA의 5 μg를 시작으로, DEPC 물을 사용하여 15 μl에 볼륨을 조정합니다. 65 열 ° 얼음에 2 분, 장소에 대한 C.
- 15 μl 사전 씻은 구슬로 총 RNA의 15 μl를 추가합니다. 구슬로 RNA를 단련하기 위해 30 분마다 5 분 pipetting하여 철저하게 섞는다. 1-2 분을위한 자석에 장소와 표면에 뜨는 모두 제거합니다.
- 주의 pipetting하여 세탁 버퍼 B. 믹스의 35 μl를 추가합니다. 자석에 놓고 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 빨래 두번 반복합니다.
- 2 분에 80 ° C에 15 μl 추운 10 MM 트리스 - HCL (산도 7.5)과 난방을 추가하여 mRNA를 Elute. 즉시 -80 ° C.에서 자석에 튜브를 삽입 RNase 무료 튜브로 표면에 뜨는을 전송하고, 고정 ) 3.8에서와 같이 정량화. 항복 총 RNA의 ~ 1~5%해야합니다.
metabolomic 분석의 경우, 프로토콜 1과 2)를 수행하고 아래) 4 진행 :
4. 메탄올 - 클로로포름 추가Metabolites의 ction
목표 : 별도의 극성과 비 극 metabolites.
- 0.1 MG / 빼낼 때 지질의 자동 산화를 방지하기 위해 ML의 농도에 클로로포름에 hydroxytoluene (BHT)를 butylated 항산화을 추가합니다. 이후의 모든 단계에 대해이 BHT-클로로포름을 사용합니다.
- 에 전송 200 머리를 차가운, 원추형 나사 캡 폴리 프로필렌 튜브, -80에서 동결 ° C를 사전 무게, 그리고 lyophilize. 건조 중량을 확인합니다.
- 튜브에 5-7 지르코니아의 구슬을 넣고 800 Hz에서 20 초마다 두 사이클을위한 비즈 - 패는에서 균질화.
- 무거운 시료의 건조 중량에 따라 다음 비율에 물, 메탄올 및 클로로포름을 추가 11.74 X 메탄올, 10.59 X 물, 11.74 X 클로로포름을 x는 g와 제품의 무거운 샘플의 무게입니다되어있는가 ML의 볼륨입니다. 동결 건조 된 헤드가 포함 된 구슬 패는 관에 모든 계산으로 메탄올과 전체의 물 45 % 추가 할 수 있습니다.
- Homogeni20 초 각각의 두 사이클의 구슬 - 패는에서 ZE.
- 클로로포름의 볼륨 (100 %)과 얼음에 원추형 유리 병에 물의 나머지 (55 %)를 결합합니다. 그런 다음, 유리관에 (비즈 포함) 조직 혼합물을 전송할 수 있습니다. 10 분 동안 흔들어. 얼음에 10 분에 품다.
- 4에서 원심 분리기에 돌려 ° C를 2000 X g에서 5 분을 위해. 파스퇴르 피펫 (플라스틱을 피)와 두 번째 microcentrifuge 관 장소에서 극성 (위쪽) 단계를 제거합니다.
- -80의 작은 유리관 및 동결의 비 극지 (아래) 단계 ° C.를 저장 질소 가스의 흐름에 따라 건조, 질소 탱크에서 실행하는 튜브가 추출물에 plasticizers을 방지하기 위해 고순도의 Tygon인지 확인합니다.
- 620 μl 진정제를 맞았을 클로로포름과 비 극지 단계를 Rehydrate. 표시 NMR 튜브에 600 μl를 전송합니다. 폭발 방지 -80 ° C의 냉동고에 저장합니다.
- Centrivap에 극성 위상을 놓고 관이 30에서 완전히 건조 될 때까지 실행 ° C (~ 7 시간).
- Reh[- (trimethylsilyl) propionic-2 ,2,3,3-D4 산 3] 내부 표준으로 1 ㎜ TMSP와 중수소 산화에 620 μl 0.1 M의 인산 나트륨 버퍼 (산도 7.3)과 북극 단계를 ydrate. 30 초에 소용돌이. 4에 microcentrifuge에 스핀 ° C를 NMR의 스펙트럼을 방해 하는것 석출물 안료 및 기타 대형 분자에 10,000 RPM에서 5 분을 위해. 표시 NMR 튜브에 표면에 뜨는 600 μl를 전송합니다.
Representative Results
DA-Gal4의 통제하에 확장 Atxn3의 유비쿼터스 표현에 의해 유도 lethality을 우회하기 위해, 우리는 Gal80 TS와 Gal4의 시간적 규정을 도입했다. 그러나 수집 및 파리 다수의 동결하기 전에, 우리는 Gal80 TS와 다 - Gal4의 통제하에 우리 transgene의 표현 역학을 결정하기 위해 싶었어요. 이 작업을 수행하려면, 우리는 십자가를 생성 18 ° C에서 자손을 떠난, 성인 파리를 수집, 18에서 24 시간을 위해를 유지 ° C. 그런 다음, 우리는 제한 온도 (29 ° C)에서 파리를 삽입하고 0, 6을 incubated, 12, 24, 36, 48, 72 시간. 다음, 우리는 출판 프로토콜 10 다음 단일 파리에서 서쪽 얼룩에 의해 확장 된 polyQ의 allele의 축적을 발견했습니다. 표현이 처음 발견하지만, 희미한 6 온도 변화 후 시간과는 채도 수준을 (그림 2A)에 도달하면, 48 시간까지 증가 계속되었다. Interes간지러운, 불용성 polyQ의 높은 분자량 밴드는 큰 응집체를 형성하기 위해 단백질 걸리는 시간을 신호, 48 시간 이후에 나타났다. 우리는 또한 immunofluorescence (그림 2B)에 의해 확장 된 polyQ의 allele의 분포를 결정하는 각 시점에서 즉시 뇌를 해부. 단백질 먼저, 온도 변화 후 24 시간을 감지 한 불규칙적 분포로해도 말이죠. 24 및 48 시간 사이에 단백질의 수치는 antennal 엽과 버섯 몸 예상 (그림 2B)를 포함 명확하게 볼 수 센터를 여러 뇌를 만드는 상승을 계속했습니다. 48 72 시간 사이에 확장 된 polyQ의 allele의 표현은 Gal4 시스템이 완전히 활성화 된 것을 제안, 최대 수준에 도달했습니다. 이러한 결과를 바탕으로, 우리는 후속 실험에 대한 첫 번째 시간 점 (1 일) 등의 온도 변화 후 24 시간을 선택했습니다. 10, 20 일이 지나면 파리 컬렉션은 또한 온도 변화 (TI부터 측정 하였다실험 병원성 및 제어 transgenes의 새로운 표현으로 시작 시간 내 0).
일단 Atxn3가 29에서 Gal80 TS와 다 - Gal4 ° C의 통제하에 24 시간 이후에 감지 된 것을 확인, 우리는 이러한 파리 20 일 동안 neurodegeneration의 흔적을 보여 것인지 궁금했다. 이 파리는 성인 병원성 단백질을 표현 시작하기 때문에, 우리는 사람들이 neurodegenerative phenotypes를 보여주기 위해 긴 배양 시간이 필요합니다 수 있다는 두려워했다. 이러한 조건에서 Atxn3-78Q의 독성을 결정하기 위해, 우리는 LacZ, Atxn3-27Q, 그리고 Atxn3-78Q을 표현 파리를 수집하고 장수를 기록했다. LacZ, 20 일 후에 90 % 생존 위에 표시 Atxn3-27Q을 표현 파리는 표현 날아 반면 Atxn3-78Q는 (그림 3) 일 20 (30 %)에서 낮은 생존을 보여 주었다. 사실, Atxn3-78Q 파리 손실 지난 5 D에 가속하는 (20 %) 중요한했습니다 10 일 (7 % 사망률)와 일 15 죽기 시작ays. 따라서, 이러한 결과는 병원성 유전자의 성인 표현식이 단축 수명, Atxn3-78Q에 의해 유도 neurodegenerative phenotypes의 주요 사인으로 이어진 지적했다.
이 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 추출 된 자료의 품질을 보장하기 위해 동결 한 후 표본의 취급 및 보존했다. 우리는 NanoDrop에 따라 DNase 처리하기 전에 200 헤드 (나이, 유전자형에 따라 다름) 당 총 RNA의 15-80 μg 사이에 추출. 약 삼분의 일 (6-25 μg)은 260 nm/280 nm의에서 흡광도의 비율에 의한 DNase 처리 한 후 매우 순수한 RNA로 회복되었다. 그러나, 우리는 RNA-seq에 대한 cDNA 라이브러리의 준비를 위해 RNA의 품질을 결정하는 가장 좋은 방법은 BioAnalyzer에 총 RNA를 분석하는 것으로 나타났습니다. 다행히도, RNA (5 NG) 만 작은 금액은 BioAnalyzer에 사용 된, 그래서 샘플 당 몇 가지 라이브러리를 생성 할 수있는 능력에 영향을주지 않았다. 예를 들어, 우리는 총 두 가지 샘플을 실행RNA는 BioAnalyzer 칩에 DNase 처리하기 전에, 그 중 하나는 (그림 4A-C) 저하되는 의심. 고품질의 RNA (샘플 1) ribosomal RNAs (그림 4A)를 나타내는 세 날카로운 RNA 밴드, 200 NT 아래의 크기와 작은 밴드에 불과 2,000 세포핵 아래 두 (NT)를 제작했다. NT 2000 주위에 두 밴드가 18S rRNA (작은 피크)와 Drosophila의 rRNA 생물학 (그림 4B 참조)의 독특한 측면이다 28S rRNA (큰 피크)에서 두 조각에 해당합니다. 이러한 자질은 또한 BioAnalyzer 트레이스 (그림 4B)에서 관찰되었다. 반면에 성능이 저하 RNA 샘플 (샘플 2) ribosomal RNAs의 날카로운 봉우리를 생산하고, 500m 미만의 NT (그림 4A)의 여러 대역을 축적 없습니다. 이 크기 분포가 쉽게 짧은 크기의 넓은 봉우리가 언급 된의 BioAnalyzer 트레이스 (그림 4C)에서 구별되었다. w에 유의하는 것도 중요저하 샘플이 덜 RNA 있다고 보여 두 RNA 샘플 사이의 y 축의 단위의 차이 있습니다. 만 라이브러리의 생성에 사용됩니다 (2.1 최적되고, 프로토콜 단계 3.8를 참조과 1.8 및 2.1 사이 260 nm/280 nm의에서 흡광도의 NanoDrop 비율) 최대 품질을 표시 RNA.
metabolites의 추출을 위해, 우리는 고전적인 물 / 메탄올 / 클로로포름 (2.0:2.0:1.8) 극과 비 극을 모두 metabolites 35 추출을 극대화하는 방법은 두 단계로 추출 절차 3 분할을 따라 갔다. 극성 및 비 극지 단계를 분리 한 후, 우리는 진정제를 맞았을 물에 재구성하거나 각각 클로로포름을 진정제를 맞았을, 그리고 NMR에 의해 분석을위한 내부 기준을 추가했습니다. NMR 스펙트럼이 추출 방법을 잘 대사 프로파일 모두에 적합, 고품질 추출물의 정화를 나타내는 평면 baselines과 좁은 라인 (그림 5)에서 해결되었습니다 사용하여 수득d는 metabolites 다수의 식별. 그림 5는 문학 7의 화학 변화에 따르면,이 같은 포도당과 자당, 그리고 두 가지 핵심 신진 대사 산, 젖산과 초산 등 매우 풍부한 metabolites에 해당하는 몇 가지 눈에 띄는 봉우리의 식별을 보여줍니다. 화학 변화 (백만 당 부분)를 표준 분자 (TMS, 오른쪽에서 첫번째 피크)에 상대적으로 분자의 차폐 전자기를 나타냅니다. 더 shieldedmolecules는 핵 주위에 높은 전자 밀도를 가지고 alkyls을 포함하여 스펙트럼의 오른쪽에 나타납니다. 이러한 아미드과 아로마 hydrogens 등 Deshielded 분자 스펙트럼의 왼쪽에 나타납니다. 바쁜 중간 섹션 (3-4 ppm으로)는 설탕 분자에 대한 풍부합니다.
그림 2. 표현 속도론 (A) 서양 얼룩은 (Gal80 TS, 다 - Gal4 / UAS-Atxn3-78Q) Atxn3-78Q 표현을 보여줍니다. 29에서 incubated 파리에 0에서 72 시간까지 ° C. 희미한 밴드가 처음 6 시간에서 감지 및 채도가 유도 후 48 시간에 도달합니다. (B) 같은 파리에서 전체 뇌의 Immunofluorescence. 뇌는, 고정, 해부했다d는 확장 된 polyQ 단백질을 인식 항체 물들. 단백질 먼저 버섯 몸 (MB) 투영 및 antennal 엽 (AL)에 검출된다. 48 72 시간 사이에, 그 표현은 최대 수준에 도달 풍부한 innervation과 뇌 센터의 높은 볼 수 있습니다. OL와 중앙 뇌 사이에 몇 가지 큰 뉴런 제외 광 엽 (OL)에서 보는 뉴런 당 표현 수준은 약합니다. 
그림 3. Atxn3-78Q는 수명을 줄일 성인 단계 (Gal80 TS, 다 - Gal4)에 LacZ, Atxn3-27Q, 그리고 ubiquitously Atxn3-78Q을 표현 이동합니다. 29 ° C.에서 자신의 장수에 대한 모니터링 된 LacZ (파란색)와 Atxn3-27Q (녹색)를 표현하는 것은 일 20 사망률의 낮은 수준을 보여 주었다 이동합니다. 반면, Atxn3-78Q (빨간색) 표시를 표현 날아10 일에 시작 발음 사망. 일 15 사람들은 하루에 30로 70 %의 사망률에 도달, 다음 5 일 동안 가속 가능성에 20 %의 감소를 보여 주었다. 
4 그림. RNA의 품질 평가. RNA 높은 품질과 성능이 저하 샘플에서는 BioAnalyzer 칩에서 실행되었습니다. (A) BioAnalyzer는 고품질의 RNA (예제 1)과 저하 RNA (샘플 2) 크기 마커 (왼쪽 차선) 옆에 실행합니다. 중앙 차선에서 ribosomal RNA에 해당하는 세 개의 날카로운 봉우리 있습니다. (B) BioAnalyzer는 2000 NT와 200 아래 또 다른 밑에 두 특성 강한 봉우리로, 샘플 1 추적. (C) BioAnalyzer은 대부분 성능이 저하 RNA로 구성되어 샘플 2에 대한 추적. 패널 B와 C 사이의 y 축에 대한 단위의 차이를 확인합니다.
그림 5. 극지 metabolites 대표 1D NMR의 스펙트럼. Drosophila와 보완 2D 아늑한 (상관 분광법)과 HSQC (헤테로 핵 단일 양자 상관 관계) 최대 임무 실험의 극 metabolites 대표 1D의 양자의 NMR 스펙트럼. 포도당, 3 : 베타 알라닌, 4 : 아세테이트, 5 락 테이트, 2 자당 : Metabolites 알려진 화학 물질 교대-1에 따라 확인.
Discussion
transcriptomics 11, 12, 신진 대사 15, neurodegenerative 질병 6, 8에서의 이전 경험을 바탕으로, 우리는 여기에 병원성 유전자의 성인 특정 표현과 플라이 헤드의 수천을 수집하기 위해 새로운 프로토콜 등에 대한 정화 mRNA와 metabolites 제시 RNA를 각각 seq와 NMR 분광법. 이 실험의 성격은 유비쿼터스 Gal4 라인과 유전자 표현의 시간적 규제의 사용의 선택을 포함 전에 플라이 컬렉션에 여러 혁신의 결합을 필요합니다. transgenes의 Gal4, 유비쿼터스 표현에 관한 것은 두 가지 이유에 대한 중요한했습니다. 첫째, 다른 사람 사이에 ATXN3, Huntingtin, 아밀로이드 전구체 단백질과 초과 산화물 dismutase 1을 포함 neurodegenerative 질병, 관련 유전자의 큰 번호가 널리 neuronal와 glial 세포에서뿐만 아니라 신경계 외부의 다른 세포 유형에 표현됩니다. 우리가 원올바르게 유비쿼터스 식의 결과를 분석하기보다는에만 신경 표현에 초점을 맞춤으로써 이러한 병원성 유전자의 생물학의 측면을 모델링. 둘째, 대형 숫자 플라이 두뇌를 수집 할 적합하지 않을 수 있지만 우리는 플라이 헤드 (조건에 따라 세중의 200 이상) 11, 12로 할 수 있습니다. 전체 헤드의 균질화는 신경 및 비 신경 조직이 조화를 이루고 있기 때문에 유비쿼터스 transgene 표현은 동일한 transgenes을 표현 세포의 인구에서 균일 한 RNA와 metabolites를위한 중요한된다. 그것은 최근 보고서 다 - Gal4 25 완전히 유비쿼터스되지 않을 수 있습니다 것을 제안하지만, 다 - Gal4가 있기 때문에 높은 표현 수준의, 그 공정도 배포하지 않기로 한 점에 유의하는 것이 중요합니다. 우리는 이전에 팔 -, 욕조 -, 그리고 법 - Ga4 등 다른 유비쿼터스 Gal4 라인을 고려했지만, 그들은 모두 적은 만드는 성인 CNS와 근육에 복잡한 표현 패턴을 보여 주었다이 연구에 dequate. 사실, 성인 뇌의 immunofluorescence는 다 - Gal4 만 몇 천 axons로 구성된 뇌 센터와 몇 대형 뉴런에서 높은 수준의 (그림 2)에서 축적 된 광범위한 약한 표현을 유도 것으로 나타났다. 구조의 표현 수준이 낮은했지만, 이러한 조건은 극적으로 polyQ에 의존 방식으로 생존을 감소. 신경성 단백질에 의해 유도 천천히, 점진적 세포 변경을 관찰을 위해 중요하다고 낮은 표현 수준을 유지하면서이 표현 역학은 우리의 요구 사항을 충족.
신경성 단백질의 유비쿼터스 표현을 유도의 예측 결과는 성인 eclosion 이전 lethality을 야기 것이 었습니다. 다행히,이 합병증은 Gal80 TS의 사용과 무시했다. 위에서 설명한 바와 같이, 유전자 발현의 시간 FRA와 잘 맞는있는 약 48 시간의 온도 변화 후 최대 수준에 도달실험의 나. Gal80 TS를 사용하는 또 다른 장점은 신경성 단백질이 constitutively 범 neurally 표현 실험에 대조적으로, 더 표현이 신경계의 개발 기간 동안 없었습니다, 것이 었습니다. 따라서, Gal80 TS의 사용은 신경 시스템이 중요한 발달 단계에서 이러한 신경성 단백질의 독성 활동에 노출되지 않은 "깨끗한"배경을 만들었습니다. 우리의보기에서, 성인의 유전자 표현의 활성화 성인 발병 pathologies의 클래스에 대한 더 나은 모델되었습니다. 그러나, Gal80 TS는 또한 온도 변화와 관련된 몇 가지 합병증을 소개했다. 하나는 낮은 온도 (18-20 ° C)에서 성장 파리는 실험 상당히 이상하고, 생활주기를 지연 것이 었습니다. 또한, 이곳은 높은 온도 (29-31 ° C)에서 성장 파리로 25 세 파리에 비해 단축 수명에 의해 도시의 신진 대사, ° C.을 가속화하는 알려져 있습니다 시전사 및 신진 대사 연구는 고온에서 세 파리에서 수행됩니다 nce, 우리는 세포 스트레스 경로 및 에너지 대사에서 중요한 변경 사항을보기를 기대 할 수 있습니다. 이 실험 비 병원성 Atnx3-27Q와 LacZ를 표현 무관 제어 1-2 컨트롤을 소개하는 정말 중요 이유입니다. 우리가 직접 독성 Atxn3의 표현에 연결된 해당 변경 사항을 확인할 수 있도록 이러한 컨트롤은 유전자 발현과 높은 온도와 연관된 신진 대사 변경에 대한 기준을 제공합니다. 성인 발병, 진보적 인 질병을 공부에 - 그리고 몇 가지 단점 (온도 문제 및 다음 단락) - 전반적으로, 우리는 많은 장점을 제공 파리 컬렉션에 여러 수정 사항을 도입했습니다.
Gal80 TS와 시간적 규제가 도움이 외에도했지만, 또한 예상치 못한 합병증을 소개했다. Gal80 TS를 모두 들고 파리를 생성하는 동안안정적인 재고 차 다 - Gal4 구조, 우리는 두 구조는 가능한하지만 무균했다에 대한 이중 homozygous 날아 것으로 나타났습니다. homozygous Gal80 TS와 다 - Gal4 변종이 가능한하고 자신의 비옥하고 있기 때문에, 그 조합이 저출산 표시 왜 확실하지 않습니다. 그것은 Gal4은 Drosophila 조직 22 약간 독성이있는 몇 시간 동안 알려져있다. 그것은 효모 전사 억제 Gal80의 heterologous 표현이 내생 전사 기계와 함께, 잠재적으로 방해하여 Gal4의 독성에 기여하는 다음, 수 있습니다. 이 독성은 다 조기 개발 및 성적 결정에 중요한 역할을 유전자의 통제하에 Gal4의 유비쿼터스 유통에 의해 악화 될 수 있습니다. 에 관계없이 불임의 기본 원인, 우리는 Gal80 TS를 확대하고, 호를 유지하면서 다 - Gal4을 통해 균형의 염색체를 유지하여 다 - Gal4 파리Gal80 t s에 대한 mozygosity은 Gal4은 불임에 더 중요한 비만 제안. 우리가 UAS의 transgenes의 각으로 건너 매주마다 이러한 남성의 수백을 사용했기 때문에이 솔루션은 열쇠였습니다. 그러나, 해당 자손의 선택시 추가 작업을 만들어 균형을 들고 경계에 있습니다. 자손 만 사분의 일 (25 %)가, 선택 시간을 추가하는 (여성, 비 균형) 수집 병 당 수확량을 감소하고, 유전자형 당 최소한 200 파리를 얻을 / 시간 / 복제하는 데 필요한 병의 수를 증가되었다 포인트. 파리의 수집에 필요한 대형 세트로 인해 소요되는 시간이되었다하지만 전반적으로, 우리는 몇 시간 병원성 유전자의 표현에 설정 한 후 세포 변화를 공부하는 것은 ubiquitously 진보적 인 neuronal 손실에 연루 소설 재미있는 프로세스를 식별하는 것으로 확신합니다.
유전자 디자인은 장소에 있던되면, 우리는에 특별한주의를 기울생물 다양성을 소개 할 수 실험 조작. 이 남성을 멀리 던지는하고 하루에 두 번 자손을 확인 의미하지만 먼저 우리는, 샘플의 동질성을 보장하기 위해 처녀의 여자를 모았습니다. 노화 동안, 더 이상 12 이상의 파리는 인구 과잉과 스트레스를 방지하기 위해 같은 유리 병에 보관되었다. 또한, 냉동 전에 파리는 마취없이 cryovials로 전송 된 30 분의 전송을 복구 할 수 있었다. 이러한 겉보기에 사소한 요소는 실험 관련이없는 것입니다 최종 분석에 변화를 소개, 유전자 발현 및 신진 대사에 영향을 줄 수 있습니다.
냉동 재료 (머리, RNA, 그리고 metabolites)의 품질을 보장하기 위해, 우리는 조직 저하에 공헌 할 수 각 세부 사항에 특별한주의를 지불. 파리는 작은 숫자 cryovials (유리 병 당 최대 12 파리)로 전송되기 때문에, 우리는 200 헤드의 컬렉션에 대한 많은 병을 검색했습니다. 이러한 조작은 D 있었다드라이 아이스 및 액체 질소로 차가운 방에서 잘 관리 하나. 파리, 헤드의 분리, 그리고 정보 분자의 정화의 컬렉션도 소재가 긴 과정의 끝에 저하이라고 발견 할 수 소모 시간입니다. 자료가 품질을 유지 수 있도록하는 것 외에도,이 프로토콜은 냉동 건조 및 구슬 뛰는 등의 RNA와 metabolites의 수율을 극대화 할 몇 가지 단계를 설명합니다. 이 단계는 RT-PCR 또는 전체 파리에서 정량 PCR을위한 일반 extractions 필요하지만 이러한 플라이 헤드와 같은 작은 샘플에서 일관된 정화에 중요한되지 않습니다. 우리는 다른 단계가 RNA의 수율에 영향을 미칠 것으로 판단. 예를 들어, 나이가 파리에 관계없이 유전자형의, 젊은 파리보다 훨씬 적은 RNA를 생산. 이 관찰 높은 온도에서 노화하는 극적인 변화를 유도하는 것이 좋습니다. 또한, 100 헤드에서 RNA를 추출하는 것은 실제로 200 헤드에서보다 효율적이었다, 그래서 우리는 두 B의 정화 진행샘플 당 100 atches는 만 BioAnalyzer과 품질 확인 후 그들을 결합합니다. 또한, mRNA 정화에 대한 열이 너무 열을 당 사용 총 RNA의 양이 최적화 할 필요가 쉽게 포화하는 듯했다.
Metabolites 작은 분자의 다양한 혼합하므로 품질 관리는 DNA, RNA, 또는 단백질보다 더 어렵습니다. 질량 분광법 (- 불행하게도, 현재 동물 모델에 대한 metabolites 대한 완전한 카탈로그, NMR 분광법 및 액체 크로마토 그래피의 확장 된 사용을 포함한 여러 기술 혁신의 응용 프로그램에 다음 몇 년 동안 덕분에 변경 될 수 있습니다 무슨 일이 없습니다 LC-MS). NMR은 MS보다 덜 민감하지만, 아무 샘플 파괴, 바이어스 (LC)를 소개없이 분석 절차 및 담당자와 여러 실험 조건 (24)의 통계 비교를 할 수 있습니다 높은 재현성이없는 등 많은 유망 장점을 보여줍니다. 따라서, 샘플 수필적는 관측을 확인하거나 LC-MS는 NMR 데이터의 유효성을 검사하여 다시 분석합니다. 여기, 우리는 Drosophila의 metabolites의 목록을 컴파일하는 데 사용하는 파리에서 예비 NMR 데이터를 보여 주었다. 이 정보는 neurodegenerative 질병을 근간 세포 메커니즘을 이해 촉진 할 수있는 새로운 창을 열고, 병원성 유전자의 표현이 정상 신진 대사를 변경하는 방법 결정에 중요합니다.
새로 신흥 omic 기술은 이전에 달성하지 세부 사항의 수준에 neurodegenerative 질병을 연구하는 가장 좋은 기회를 제공합니다. 아마도 이러한 높은 처리량 연구에 극복 할 수있는 가장 큰 장애물은 매우 민감한 방법으로 분석 할 수 재현 샘플 충실한 모음입니다. 절차는 일관성을 달성하는 방법을 제공합니다 여기에서 소개, 쉽게 데이터 세트에 걸쳐 비교할 수 있습니다 결과로 이어질 것입니다. 우리의 주요 관심 연구 분야로는 유전자 표현의 검토 사항을 포함하지만이온과 metabolites는 생성 된 파리는 proteomic 또는 epigenomic 분석의 대상이 될 수 있습니다. neurodegeneration 동안 발생 Proteomic과 epigenomic 변화는 또한 질병 과정에 파라마운트 중요성 될 가능성이 있습니다. 과학 커뮤니티가 궁극적으로 질병 과정에 영향을 미치는 분자 변경의 전체 스펙트럼을 식별하는 경우, 질병의 진정한 시스템 수준의 이해가 가능합니다. 이 단계에서 질병 수정 요법이 마침내 현실로 등장합니다.
Disclosures
저자는 경쟁 재정 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 제니스 산티아고, 가브리엘 피구에 로아, 기술 지원 및 플라이 주식에 대한 인디애나 대학에서 블루밍턴 Drosophila 증권 센터의 호세 에레라에 감사합니다. DH와 CW가 NSF-IOS-1051890의 자금에 의해 지원되었다. PF-F와 LMM은 플로리다 대학에서 기회 종자 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32" grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 | |
References
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