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Biology

La longitud del telómero y la actividad de la telomerasa, una Yin y Yang de la senescencia celular

Published: May 22, 2013 doi: 10.3791/50246
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Diabetes Research and Training Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Un método preciso, breve, sofisticado y barato se describe que evalúa la longitud del telómero en múltiples tejidos y especies utilizando QRT-PCR. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

Abstract

Los telómeros son secuencias repetidas de ADN en los extremos de punta de los cromosomas que son diferentes en longitud y en el ser humano puede alcanzar una longitud de 15.000 pares de bases. El telómero sirve como un mecanismo de bioprotectora del cromosoma desgaste en cada división celular. En una cierta longitud, los telómeros se vuelven demasiado cortos para permitir la replicación, un proceso que puede conducir a la inestabilidad cromosómica o la muerte celular. Longitud de los telómeros está regulada por dos mecanismos opuestos: deserción y el alargamiento. Desgaste se produce a medida que cada célula se divide. En contraste, el alargamiento es parcialmente modulada por la enzima telomerasa, que añade secuencias de repetición de los extremos de los cromosomas. De esta manera, la telomerasa podría invertir posiblemente un mecanismo de envejecimiento y rejuvenece la viabilidad celular. Estos son elementos cruciales en el mantenimiento de la vida celular y se utilizan para evaluar el envejecimiento celular. En este manuscrito se describirá un método preciso, breve, sofisticado y barato para evaluar la longitud del telómero en múltiples tejidoss y especies. Este método se aprovecha de dos elementos clave, la repetición en tándem de la secuencia de los telómeros y la sensibilidad de la QRT-PCR para detectar el número de copias diferenciales de muestras ensayadas. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

Introduction

Los telómeros son secuencias repetidas de ADN hexámeros (TTAGGG) que se encuentran en los extremos de los cromosomas. En cada replicación celular, estos extremos de los cromosomas se acortan. Si se vuelven demasiado cortos, los cromosomas pueden sufrir fusiones telómero finales, recombinación aberrante y degradación. Por lo tanto suficiente mantenimiento de la longitud del telómero juega un papel importante en la estabilidad de los cromosomas y la protección de la célula 38. Mantenimiento de la longitud del telómero es también crucial para genes que se encuentran cerca de los extremos de los cromosomas, ya que la replicación del ADN no puede continuar hasta el final de los cromosomas 1-2. Por consiguiente, la prevención de acortamiento de los telómeros puede mejorar la estabilidad celular.

Numerosos estudios han informado de que la longitud de los telómeros se correlaciona con la longevidad de un organismo y el estado de enfermedad, tales como en el cáncer de 3-4, 5 la diabetes, y la enfermedad cardiovascular 6,7. Además, acortamiento de los telómeros se han asociado con el exceso de estrés o unestilo de vida poco saludable 8, tal vez mediante la promoción de un envejecimiento prematuro y muerte celular 9. Por otro lado, algunos estudios han encontrado que no hay diferencia significativa entre la longitud de los telómeros y la longevidad y la enfermedad relacionada con la edad 39, 40, 41.

Uno de los mecanismos innatos de la célula de protección de acortamiento de los telómeros es mediante la activación de su propia enzima telomerasa transcriptasa inversa (TERT). Esta enzima y su subunidad, ARN de telomerasa (TERC), un ARN no codificante, utilizan el telómero como una plantilla para añadir telómero se repite en el cromosoma termina 10. Aunque la actividad de la telomerasa está ausente de varios tipos de células y otros mecanismos están implicados en el mantenimiento de la longitud del telómero, el aumento de actividad de la telomerasa se correlaciona con el aumento de la longitud del telómero. Activación de la telomerasa se ha establecido como uno de los mecanismos por los que las células responden a daño y el estrés y evitar la senescencia y muerte prematura. Por ejemplo, ya TElomeres se demostraron en una población de Judios Ashkenazi con excepcional vida útil 11, las mutaciones en TERC o de TERT se han demostrado que contribuyen a la enfermedad fatal 12, y la regulación epigenética de la telomerasa se ​​ha demostrado que tienen un efecto sobre la enfermedad relacionada con la edad 13. Desde su descubrimiento, la longitud del telómero se ha propuesto como un biomarcador para el estado de salud en diversos modelos animales, así como en los seres humanos, pero estos primeros estudios eran difíciles de replicar ampliamente debido a que el método utilizado fue tedioso, largo y costoso. En 2002 y ajustado aún más en 2009, Cawthon propuso y demostró un nuevo protocolo, preciso, rápido y sencillo basado en la PCR para evaluar la longitud de los telómeros y de investigar más a fondo su papel en diversos aspectos de la biología celular, el envejecimiento y la enfermedad 19.

La elección del método de medición del telómero correcto para un estudio es esencial. Actualmente, existen varios métodos utilizados para medir la longitud de los telómeros, cada uno con su propiaventajas y desventajas. Tradicionalmente, la longitud de los telómeros se mide usando análisis de transferencia Southern de los fragmentos de restricción terminales (TRFs), que implica: a. la digestión del ADN con enzimas de restricción que no cortan en el telómero se repite con el fin de obtener los TRF, b. Southern Blot de estos TRF se realiza mediante la determinación de la longitud media TRF utilizando una sonda telomérica 14, 37. Aunque este método es muy preciso con un pequeño coeficiente de variación, es una medida directa, y puede ser ventajoso para la medición de distribución de la longitud, el análisis TRF es costoso, mano de obra intensiva y requiere al menos 3 g de ADN. Este método también es insensible a los telómeros cortos y determinación de la longitud puede ser confundida por ADN subtelomérico, que puede ser detectada por la sonda por la (TTAGGG) n igual que las secuencias que contienen 15, 42.

Otro método de alta precisión en la medición de la longitud del telómero es Individual telómeros Análisis Longitud Elongación (ESTELA), una singlMétodo E molécula basado en la PCR que sólo requiere una pequeña cantidad de ADN. En este método, se hacen cebadores para reconocer el G rico en voladizo en el extremo de los cromosomas y para unirse a una secuencia subtelomérico única en un cromosoma, que amplifica el telómero de un cromosoma específico. La amplificación resultante es entonces visualizado por Southern Blot. Este método tiene la ventaja de ser muy preciso y es capaz de detectar valores atípicos telómeros cortos 16. Por desgracia, ya que no todos los cromosomas tienen extremos G-ricos y una secuencia subtelomérica utilizable, longitud de los telómeros se puede medir sólo en los cromosomas específicos y estas medidas no puede representar la longitud de los telómeros en la celda 15.

Otro método que se ha practicado es el uso de ácido nucleico peptídico (PNA) sondas para detectar la longitud del telómero. Florescence cuantitativa hibridación in situ (Q-FISH) permite visualizar los telómeros durante la metafase, donde el staining de los telómeros con una sonda de ANP en proporción a su tamaño permite la comparación de los telómeros entre cromosomas específicos. Aunque este método también se puede utilizar para las células en interfase, aquí la longitud de los telómeros de los cromosomas distintos puede no ser detectado, lo que introduce una limitación en la medición de longitud de los telómeros en las células senescentes o con poca frecuencia dividiendo 17. PEZ de flujo en su lugar utiliza la citometría de flujo y es actualmente el método más sensible para la medición de la longitud del telómero de células de la sangre en el entorno clínico, pero requiere técnicos altamente cualificados 18.

Actualmente, el método estándar para medir la longitud media de los telómeros en nuestro laboratorio se aprovecha de la precisión, la sensibilidad, y la facilidad de PCR cuantitativa en tiempo real. Este método fue posible para la medición de la longitud del telómero por el desarrollo de cebadores novedosos que evitar la síntesis de productos de dímero de cebadores derivados, que de otro modo se han producido en comostándar ensayo debido a la naturaleza repetitiva de los telómeros. Para este ensayo, la medición de la longitud de los telómeros está representada por la relación T / S, el número de copia repetida de los telómeros para el número de genes de copia única. Puesto que existe una relación directamente proporcional entre la longitud de los telómeros y el número de cebadores telómero marcado que se une al ADN durante las etapas iniciales de la PCR, la relación T / S es directamente proporcional a la longitud de los telómeros. La relación T / S se mide mediante la comparación de la diferencia en el Ct, el número de ciclo fraccional al que la muestra ha acumulado fluorescencia cruza un umbral que es varias desviaciones estándar por encima de la línea de base de fluorescencia, entre las muestras con cebadores telómero y SCG cebadores 19. Este método ha sido criticado por su medición indirecta de la longitud de los telómeros, que puede conducir a mediciones inexactas, por ejemplo, en el caso del cromosoma duplicaciones o variaciones del número de copia 15. Además, la comparación entre estudios es a menudo difficult, pero estándar oligómeros han sido desarrollados para medir la longitud de los telómeros absoluta 20. Este método fue fomentada mejorado por Cawthon, utilizando un ensayo qPCR multiplex monocromo. En este ensayo, la PCR se realizó a temperaturas más bajas para los primeros pocos ciclos para evitar la unión del cebador-dímero y el gen de los telómeros y el control se analizaron en el mismo tubo de PCR para evitar un mayor error. Las mediciones de la longitud del telómero resultantes fuertemente correlacionada con la longitud de los telómeros se mide por análisis de transferencia Southern de los TRF y tenía una mayor precisión de 15, 19, 36. Por el momento, QRT-PCR es el único método práctico disponible para probar muestras de gran tamaño y sólo requiere una pequeña cantidad de ADN para llevar a cabo. Una parte fundamental de este método es medidas generales de control de calidad, por lo que cuando se hace correctamente, este método puede proporcionar una valiosa información comparativa acerca de la longitud del telómero. Además, este método ha sido adaptado para su uso más allá de los leucocitos para medirlongitud de los telómeros en una variedad de diferentes tejidos 42.

Además, con el fin de entender mejor la biología detrás de mantenimiento de la longitud del telómero y las interacciones entre los dos efectos opuestas (es decir, acortamiento de los telómeros durante la replicación y la elongación por la enzima telomerasa), acompañamos el método de longitud de los telómeros con un ensayo adicional que mide la actividad de la telomerasa.

Para este propósito, se utilizó un Protocolo de Amplificación de repetición telomérica, un ensayo in vitro. Brevemente, se lisaron, conserva, las células sintetizan enzimáticamente activas repeticiones teloméricas en un sustrato de oligonucleótido usando la telomerasa, y los productos se amplificaron mediante PCR en presencia de SYBR Green. Los resultados se analizaron a continuación mediante la comparación de la muestra y de control de los valores de umbral Ct. Dado que la telomerasa es una enzima sensible al calor, un calor adicional tratado de control se ejecuta junto a cada muestra 21.

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Protocol

1. Protocolo de la longitud del telómero 19

  1. Aislamiento de ADN

La mayoría de los métodos de aislamiento de ADN se pueden usar. Nuestro laboratorio prefiere Qiagen DNeasy kit (# 69506) para las fuentes de sangre. Dependiendo de la fuente de ADN, tales como bucales u otras fuentes, un método de aislamiento diferente puede ser utilizado.

  1. Los cebadores:

Todos los cebadores se diluyen a una concentración de stock de 100pmoles/μl en agua de grado PCR y se almacenaron a -20 ° C hasta que sea necesario. Las cepas de trabajo de cebadores están recién hechas y se almacenan a 20 ° C durante un corto período de tiempo (algunos meses.) Cebadores estándar se utilizaron para los telómeros y la β-globina, la SCG, como se describe en O'Callaghan et al. 20 .

Primer secuencias:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Nota: Los cebadores se diluyeron a una concentración de trabajo de 10pmoles/μl, antes de añadir a la mezcla de reacción.

  1. Diluciones seriadas de ADN genómico:

Diluciones seriadas de ADN genómico de Telo y copia única del gen (SCG) se crean para generar una curva de valor Ct estándar para el ensayo. El ADN genómico utilizado se extrajo a partir de linfocitos de muestras de sangre. Estas diluciones se crean mediante la dilución de ADN con PCR de grado 2 H 0 para cada concentración por un factor de 1,68 para producir las dos series de diluciones en serie utilizando el mismo ADN genómico. Las concentraciones de partida se han optimizado sobre la base de ensayo y error, y pueden necesitar ser ajustado cuando el uso de diferentes reactivos, instrumentos, el ADN de otras especies, tipos de células, y SCG utilizados.

Nota: La dilución en serie usando ADN genómico se hace mezclando suavemente y esperar al menos 15 minutos hasta una hora antvolver a tomar ADN para la siguiente dilución. Cada dilución requiere tiempo para el ADN genómico para disociar. Para almacenamiento, diluciones en serie a largo plazo alícuotas en tiras de PCR para el almacenamiento a -80 ° C. Cada tira de PCR se descongela y se usa una vez para evitar los ciclos de congelación y descongelación que pueden dañar el ADN.

  1. Configuración de reacción para RT-PCR

Instrumento utilizado: Roche480 Light termociclador

Reactivo: Roche Light termociclador SYBR verde-

Diluir las muestras de ADN de prueba a una concentración final de 10 ng / l. Probamos concentración utilizando Nanodrop o Qubit. Nos diluir el ADN de 10ng/μl a 5ng/μl final. No probamos la concentración de nuevo.

Componentes de reacción:

TELO 1x SCG 1x
H 2 0 </ Td> 6 l H20 6 l
Telo 1 0,2 l SCG 1 0,6 l
Telo 2 1,8 l SCG 2 1,4 l
Rxn mezcla 10 l Rxn mezcla 10 l
ADN o dilución en serie 2 l ADN o dilución en serie 2 l

Nota: Master Mix se hace sin ADN y con un exceso de 5% a 10%.

Tanto Telo y el CGS se ejecutan a la vez en la misma placa utilizando el siguiente programa. Para la prueba de precisión, al menos tres repeticiones de cada muestra y control se debe ejecutar. Las variaciones de los cebadores utilizados pueden afectar los resultados. El protocolo ha sido optimizado para trabajar como sigue en el Roche480 Light Cycler y nuestros cebadores.

Endesnaturalizan itial
10 min 95 ° C desnaturalizan
Ciclismo
95 ° C 10 seg bodega
60 ° C 5 sec bodega
72 ° C 11 seg retención y adquisición única
Repita 45 a 55 veces como sea necesario

2. Detección cuantitativa telomerasa (QTD) Protocolo (Basado en Kit QTD por Allied Biotech, Inc. gato. No. MT3012)

Extraer Preparación

  1. Precipitar las células o tejidos.
  2. Lavar una vez con PBS 1x.
  3. Repellet y eliminar 1x PBS. *
  4. Resuspender el sedimento celular en 200 l de 1 x tampón de lisis por cada 10 5 -10 6 células o 40-100 mg de tejido.
  5. Incubar en hielo durante 30 min.
  6. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
  7. Transferir 160 l del sobrenadante en un tubo nuevo y determinar la concentración de proteína.
  8. Alícuotas y congelar rápidamente el extracto remanente en hielo seco / etanol, almacenar a -80 ° C.

* En el tsu condición, la telomerasa en las células o tejidos congelados es estable durante al menos un año. Cuando se descongelan para su uso, volver a suspender las células inmediatamente en 1 x tampón de lisis.

2.1. Controles de Ensayo

Control de inactivación por calor: Para cada muestra, el tratamiento térmico de un extracto de control adicional mediante la incubación a 85 ° C durante 10 min antes del ensayo de actividad de la telomerasa.

Curva estándar para la plantilla de control TSR: Efectuar la PCR cuantitativa en tiempo real usando diluciones de TSR, un oligonucleótido con una secuencia similar a los telómeros cebadores incluidos en el kit para generar una curva estándar.

  1. Preparar diluciones seriadas 1:05 de la concentración TSR almacén (0,5 Amoles / l) con tampón de lisis
  2. Realice la telomerasa ensayo estándar de detección por medio de 1 l de cada dilución TSR, incluyendo la concentración de valores. Estas diluciones se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos 2 semanas.

2.2. Ensayo de actividad de la telomerasautilizando QTD PCR en tiempo real

  1. Para cada muestra, añada lo siguiente a un tubo de PCR o de pared delgada placa de PCR (volumen total de 25,0 l):
    • 12,5 l de 2 x Premix QTD
    • 1,0 l de células o extracto de tejido
    • 11,5 l de PCR Agua Calificado
  2. Mezclar bien
  3. Programa de Sistemas de Tiempo Real de detección PCR de acuerdo con el siguiente programa:
    - 25 ° C durante 20 min (reacción telomerasa)
    - 95 ° C durante 10 min (PCR paso de activación inicial)
    35-40 ciclos de:
    - 95 ° C durante 30 segundos (desnaturalización)
    - 60 ° C durante 30 segundos (hibridación)
    - 72 ° C durante 30 segundos (extensión)
  4. Coloque los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el programa de ciclismo.
  5. Recoger el ciclo umbral o valor C T después de terminar los ciclos. El ciclo umbral es el ciclo en el que se detecta un aumento estadísticamente significativo de ARn primero.

2.3. Análisis de Datos

  1. Generatea curva estándar usando las lecturas de T C y comparar la actividad telomerasa.

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Representative Results

Un ejemplo de un ensayo de QRT-PCR longitud de los telómeros se muestra en la Figura 1. En el panel superior izquierdo, muestras marcadas en rojo y verde representan la ubicación de los sujetos evaluados en la placa de 96 pocillos. En el panel superior derecho, se demuestra la curva de amplificación. Cada tema se analiza en dos ensayos (Telómeros y copia única del gen), que se realiza por triplicado. Debido a los diferentes números de copias de ADN producidos en los dos ensayos de los individuos seleccionados, el número de ciclos hasta que la detección de fluorescencia alcanza su curva exponencial difiere entre ensayos. En los tubos de mayor número de copias (es decir, ensayo de los telómeros), la cantidad de detección de fluorescencia alcanza su curva exponencial después de 27 ciclos. El segundo conjunto de líneas representa la copia del gen individual (SCG) que tiene una sola copia en el genoma, y ​​por lo tanto tiene mucho menos copias que las muestras de los telómeros y alcanza su curva exponencial sólo después de 31 ciclos. Las líneas marrones representan el estándarcurva que se basa en una dilución en serie de concentraciones de muestra conocidos. El panel inferior derecho representa el logaritmo de la concentración de los puntos de la curva estándar (una línea recta demuestra una serie de dilución óptima). Esta curva lineal se utiliza para calcular la concentración de los tubos de ensayos (panel inferior izquierdo). Los resultados de QRT-PCR, inicialmente en las manos de Cawthon 19, y repite por nosotros y otros, se ha demostrado que se correlaciona con los obtenidos por el ensayo de longitud de fragmentos de restricción terminales. Una T / S unidad de relación (ciclos de QRT-PCR de la carrera del telómero durante los ciclos de QRT-PCR de la carrera SCG) es equivalente a una longitud de los telómeros media de 4270 pb en los leucocitos 42. Dividiendo los ciclos de QRT-PCR para el ensayo de los telómeros mediante el ensayo de SCG en nuestro ejemplo resultó en una proporción de 0,87, lo que equivale a un promedio de 3.715 pb. Esta medición consiste de solo la longitud de los telómeros y no incluye las regiones subteloméricas.

La QRT-PCR demostrado aquí involucrado muy poca preparación de la muestra. En este ejemplo (Figura 1), se observaron diferencias cualitativas así como cuantitativas (representado por la dilución en serie y la concordancia entre los triplicados) entre los dos ensayos. Los resultados calculados a partir de esta prueba muestran la longitud del telómero intermedia para un sujeto de 65 años.

Un ejemplo de los resultados del ensayo de actividad de la telomerasa y la posible relación entre la actividad de la telomerasa y la longitud de los telómeros se demuestra en la Figura 2. Nuestros resultados preliminares muestran que una mayor longitud del telómero puede estar asociada con un aumento de actividad de la telomerasa.

Figura 1
Figura 1. Figura 1 representa la salida típica de AQEnsayo de RT-PCR para la longitud de los telómeros. La esquina superior izquierda muestra las muestras dispuestas en una placa de 96 pocillos, por triplicado. La esquina inferior izquierda muestra las concentraciones calculadas y los valores de Ct para cada muestra, que se utilizan para calcular los valores de T / S. El derecho superior es un gráfico de la curva de amplificación (número de ciclos frente a la fluorescencia detectada a partir de CYBR verde), que se utiliza para visualizar los resultados. En la parte inferior derecha, se representa la curva estándar para la concentración frente Iniciar valor CT del control de dilución en serie. Una línea recta confirma que la serie de dilución se mide y se carga correctamente. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Utilizando los resultados preliminares del ensayo de QRT-PCR para la actividad de la telomerasa y la longitud de la telomerasa, <fuerte> La figura 2 muestra una relación directa significativa (p = 0,008) entre la longitud de los telómeros, medido por T / S relación, y la actividad de la telomerasa, medido por el valor de Ct.

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Discussion

Longitud de los telómeros proporciona un marcador celular única para estudiar la célula estresada y el envejecimiento y ofrece una visión de los mecanismos de envejecimiento. Desde su papel en el envejecimiento de la primera se había sugerido, una multitud de estudios se han realizado sobre la longitud del telómero a la edad, la longevidad, las enfermedades relacionadas con la edad, el cáncer y el estrés. Durante décadas, el patrón oro de la medición de la longitud del telómero fue el análisis de los fragmentos de restricción terminal mediante hibridación Southern. Sin embargo, recientemente un método económico, rápido, y fácil de realizar por Cawthon ha evolucionado. Usando PCR cuantitativa en tiempo real, Cawthon ofreció una alternativa útil para medir la longitud de los telómeros, la realización de estudios de grandes muestras posibles.

Usando QRT-PCR, muchos estudios se han realizado para investigar la relación entre la longitud de los telómeros y una variedad de resultados, especialmente enfermedades relacionadas con la edad. Más específicamente, este método ha permitido a los investigadores a realizar grandes Stu epidemiológicamuere en las poblaciones que demuestran o niegan una correlación entre la longitud de los telómeros y una variedad de enfermedades. Para nombrar unos pocos, enfermedad isquémica del corazón 7, la enfermedad de Alzheimer 22, osteocarcoma en las hembras 23, cáncer de pulmón entre los fumadores 24, cáncer de tiroides familiar 25, la diabetes 5, la presión arterial 26, el envejecimiento 27, y la demencia 28 se han correlacionado con una menor longitud de los telómeros , mientras que la edad degeneración macular asociada a 7, el cáncer colorrectal 43, y la muerte por enfermedad infecciosa, cáncer, cardíaca o enfermedad cerebrovascular 44 se ha demostrado que no tienen ninguna relación significativa con la longitud de los telómeros. Además, ciertos tipos de estrés se ha demostrado que coincidir con la longitud del telómero más corto, por ejemplo, un aumento de la cantidad de marcadores de inflamación, el TNF-α e IL-6, se han correlacionado con la longitud de los telómeros más cortos en los leucocitos 29. Además, estresante lifEstyles debido a los horarios de consumo de trabajo, trabajo por turnos, o la naturaleza de la obra, en particular, una posición de cuidador de un niño enfermo crónico, se han asociado con las diferencias en la longitud del telómero. Esto sugiere que el estrés puede causar envejecimiento prematuro a través de acortamiento de los telómeros y sin la suficiente recuperación 30, 31. En un estudio reciente, que tiene un menor número de relaciones sociales también se asocia con telómeros más cortos 32. Prevención de la reducción de la longitud del telómero también se ha demostrado que son equivalentes a las opciones de vida saludables, tales como tomar una multivitamina diaria y no fumar 24, 33. Además, estos estudios revelaron posibles usos clínicos de los telómeros de medición, por ejemplo, como una prueba de detección no invasiva para el posible desarrollo de la cirrosis 34. En otros casos, en estudios similares han demostrado una correlación significativa (o una modesta correlación) entre una enfermedad y la longitud de los telómeros, los investigadores han sido alentados a stotros mecanismos novedosos para Udy disminución celular y el estado de enfermedad 7.

Estos estudios tienen fuerza en los números y han demostrado la utilidad de medir la longitud de los telómeros como uno de los primeros pasos para descifrar el proceso de envejecimiento. Método de QRT-PCR de Cawthon era útil para este propósito, ya que puede comparar un gran número de personas, requiere un mínimo de ADN, y puede dar evidencia fiable hacia una relación entre la longitud de los telómeros y la salud de las células. Estos estudios ayudan a dirigir los esfuerzos futuros de la investigación del envejecimiento a ciertos genes, tejidos y procesos celulares.

Inevitablemente, después de que se observó una diferencia significativa en la longitud de los telómeros, se consulta una explicación. Para respuestas a estas preguntas, los estudios sobre la telomerasa, se han establecido la enzima implicada en el mantenimiento de los telómeros y su regulación,. Protocolos actividad telomerasa basado en la PCR se han ofrecido, con información adicional a: a. la determinación de la contributions de la degradación de los telómeros, y b. fracaso de éxito mantenimiento longitud de los telómeros por la telomerasa, proporcionando así otro capítulo a la historia sobre el envejecimiento en su conjunto, en particular, la senescencia celular.

Aunque QRT-PCR detecta la longitud del telómero promedio, y no sobre una base cromosoma individual, este método es una poderosa herramienta para pruebas hacia cómo la célula reacciona con el envejecimiento y el estrés y proporciona un preámbulo a la historia de cómo envejecemos. Curiosamente, esta información ya ha dado lugar a la medida la longitud del telómero en la clínica para la estimación de la edad biológica y promoverá la comprensión del proceso de envejecimiento y conduce inevitablemente a la prevención o el retraso y la investigación del envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad.

Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo
Detección cuantitativa telomerasa Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use la mezcla de reacción de arranque en caliente para SYBR I-basada Verde PCR en tiempo real utilizando el LightCycler 480 Instrumento Roche Diagnostics 4707516

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantitative Telomerase Detection Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516

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Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence. J. Vis. Exp. (75), e50246, doi:10.3791/50246 (2013).

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