Summary
שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה מתוארת מעריך כי אורך הטלומרים ברקמות ומינים באמצעות qRT-PCR מרובים. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.
Abstract
הטלומרים הם רצפי דנ"א חוזרים בקצה קצוות של הכרומוזומים שהם מגוונים באורך ובבני האדם יכול להגיע לאורך של 15,000 זוגות בסיסים. הטלומרים משמש כמנגנון bioprotective התשה כרומוזום בכל חלוקת תא. באורך מסוים, הטלומרים להיות קצרים מדי כדי לאפשר לשכפול, תהליך שעלול להוביל לחוסר יציבות כרומוזום או מוות של תאים. אורך הטלומרים מוסדר על ידי שני מנגנונים מנוגדים: התשה והתארכות. ההתשה מתרחשת כמו כל תא מתחלק. בניגוד לכך, התארכות היא באופן חלקי מווסתת על ידי אנזים טלומראז, שמוסיף רצפים חוזרים בקצוות של הכרומוזומים. בדרך זו, יכול אולי להפוך את הטלומראז מנגנון הזדקנות וממריץ כדאיות תא. אלה הם אלמנטים קריטיים בשמירה על חיי תא ומשמשים כדי להעריך את הזדקנות תאים. בכתב היד הזה נתאר שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה להערכת אורך הטלומרים ברקמות מרובותים ומינים. השיטה זו מנצלת את שני מרכיבים עיקריים, בד בבד החוזרת של רצף הטלומרים והרגישות של qRT-PCR כדי לזהות להעתיק מספרי הפרשים של דגימות שנבדקו. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.
Introduction
הטלומרים הם חוזרים DNA hexamer (TTAGGG) רצפים שנמצאו בקצוות של הכרומוזומים. בכל שכפול של תא, קצוות הכרומוזומים אלה מקוצרים. אם הם הופכים לקצרים מדי, כרומוזומים יכולים לעבור התכת הטלומרים קצה, רקומבינציה החריגה, והשפלות. לכן תחזוקת אורך הטלומרים מספיק ממלאת תפקיד מרכזי ביציבות כרומוזום ותא הגנה 38. תחזוקת אורך הטלומרים היא קריטית גם לגנים שנמצאו בסמוך לקצוות הכרומוזומים, מאז שכפול הדנ"א אינו יכול להמשיך עד הסוף של כרומוזומים 1-2. כתוצאה מכך, מניעת ההתקצרות הטלומרים עשויה לשפר את יציבות תא.
מחקרים רבים דיווחו כי אורך הטלומרים הוא מתואם עם תוחלת חיים של האורגניזם ומצב חולה, כגון בסרטן 3-4, סוכרת 5, ומחלות לב וכלי דם 6,7. בנוסף, הטלומרים התקצרו כבר קשורים ללחץ מופרז אואורח חיים לא בריא 8, אולי על ידי קידום ההזדקנות המוקדם של תאים ומות 9. מצד השני, כמה מחקרים מצאו כי אין הבדל משמעותי בין אורך הטלומרים ואריכות ימים וגיל 39 קשור מחלה, 40, 41.
אחד מהמנגנונים המולדים של התא של הגנה מפני התקצרות הטלומרים הוא על ידי הפעלה משלה אנזים טלומראז ההפוך טרנסקריפטאז (טרט). אנזים זה והמקטע שלה, טלומראז RNA (TERC), RNA ללא קידוד, השתמשו הטלומרים כתבנית להוסיף הטלומרים חוזר לכרומוזום 10 מסתיים. למרות פעילות telomerase נעדר ממספר סוגים של תאים ומנגנונים אחרים מעורבים בתחזוקת אורך הטלומרים, פעילות telomerase גדלה מתואמת עם אורך הטלומרים מוגבר. הפעלת Telomerase כבר נקבע כאחד מהמנגנונים שבאמצעותם תאים מגיבים לנזק ולהדגיש ולמנוע הזדקנות ומוות בטרם עת. לדוגמה, כבר telomeres הודגם באוכלוסייה של יהודים אשכנזים יוצאי דופן עם 11 תוחלת חיים, מוטציות בTERC או טרט הוכחו לתרום למחלה קטלנית 12, ורגולציה epigenetic של הטלומראז הוכח יש השפעה על מחלות הקשורות לגיל 13. מאז גילויו, אורך הטלומרים הוצע כסמן ביולוגי למצב בריאות במודלים של בעלי חיים שונים, כמו גם בבני אדם, אך המחקרים המוקדמים הללו היו קשים לשכפל באופן נרחב, כי השיטה הייתה מייגע, ארוכה ויקרה. בשנת 2002, ועוד יותר מכוון בשינה 2009, הציע Cawthon והפגין פרוטוקול חדש, מדויק, מהיר ופשוט המבוסס על PCR להעריך אורך הטלומרים ועוד יותר לחקור את תפקידה בהיבטים שונים של ביולוגיה של תא, הזדקנות ומחלה 19.
בחירת שיטת מדידת הטלומרים הנכונה עבור מחקר היא חיונית. כיום, ישנן שיטות שונות המשמשות למדידת אורך הטלומרים, כל אחד עם עצמויתרונות וחסרונות. באופן מסורתי, אורך הטלומרים נמדד באמצעות ניתוח דרום כתם של שברי הגבלת מסוף (TRFs), הכולל: א. לעכל את ה-DNA עם אנזימי הגבלה שלא לקצץ בחזרות הטלומרים על מנת לקבל TRFs, ב. כתם דרומי של TRFs אלה נעשה על ידי קביעת אורך TRF הממוצע באמצעות בדיקה telomeric 14, 37. למרות ששיטה זו היא מאוד מדויקת עם מקדם קטן של וריאציה, הוא מדד ישיר, ויכול להיות יתרון למדידת אורך הפצה, ניתוח TRF הוא יקר, עבודה אינטנסיבית ודורש לפחות 3 מיקרוגרם של ה-DNA. שיטה זו היא גם רגישה לטלומרים קצרים וקביעת אורך יכול להיות מבולבלת על ידי דנ"א subtelomeric, אשר יכול להיות מזוהה על ידי הבדיקה נאותה (TTAGGG) n כמו רצפים שהם מכילים 15, 42.
שיטה נוספת מאוד מדויקת במדידת אורך הטלומרים היא ניתוח יחיד הטלומרים התארכות אורך (סטלה), Singlשיטת ה-PCR מולקולה מבוססת שדורשת כמות קטנה של DNA בלבד. בשיטה זו, פריימרים עשויים להכיר בסככה G-העשירה בסופו של הכרומוזומים ולהיקשר לרצף subtelomeric ייחודי על כרומוזום אחד, אשר מגביר את הטלומרים של כרומוזום מסוים. ההגברה המתקבלת היא אז דמיינו ידי כתם דרום. לשיטה זו יתרון של להיות מדויק מאוד והוא מסוגל לזהות טלומרים קצרים outlier 16. לרוע המזל, מכיוון שלא כל הכרומוזומים קצוות G-עשירים ורצף subtelomeric שמיש, אורך הטלומרים יכול להימדד רק על כרומוזומים ספציפיים ומדידות אלה עשויות שלא לייצג את אורכו של כל הטלומרים בתא 15.
שיטה נוספת שכבר מתורגלת היא השימוש בחומצות גרעין פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות לגילוי אורך הטלומרים. תפרחת כמותית הכלאה באתרו (Q-דגים) מאפשרת לנו לדמיין את הטלומרים במהלך metaphase, שם הרחובaining של הטלומרים עם בדיקה הרשות הפלסטינית באופן יחסי לגודל שלהם מאפשר השוואה של הטלומרים בין כרומוזומים ספציפיים. למרות ששיטה זו יכולה לשמש גם לתאים בשלבי ביניים, כאן לא יכול להיות מזוהה על אורך הטלומרים לכרומוזומים שונים, אשר מציג מגבלה בעת מדידת אורך הטלומרים בתאים מזדקנים או לעתים רחוקות חלוקת 17. דגים במקום זרימה משתמש cytometry זרימה, וכיום הוא השיטה רגישה ביותר למדידת אורך הטלומרים של תאי דם בסביבה הקלינית, אבל דורש טכנאים מיומנים מאוד 18.
נכון לעכשיו, השיטה הסטנדרטית למדידת אורך הטלומרים ממוצע במעבדה שלנו מנצלת את הדיוק, הרגישות, וקלות כמותי בזמן אמת PCR. שיטה זו התאפשרה למדידת אורך הטלומרים על ידי הפיתוח של פריימרים רומן למנוע את הסינתזה של מוצרי שמקורם בדימר פריימר, אשר במקרה אחר היה מיוצרת כבassay tandard בשל האופי החוזר של הטלומרים. עבור assay זה, מדידת אורך הטלומרים מיוצגת על ידי T / S היחס, מספר העותק חוזר הטלומרים למספר גני עותק יחיד. מאז יש קשר ישיר בין יחסי אורך הטלומרים ומספר פריימרים הטלומרים שכותרתו מחייב את ה-DNA בשלבי ההתחלה של ה-PCR, יחס T / S הוא ביחס ישר לאורך הטלומרים. יחס T / S נמדד על ידי השוואה את ההבדל ב-CT, מספר מחזור השבר שבמדגם של הצטברו תפרחת חוצה סף שהוא כמה סטיות תקן מעל תפרחת תחילת המחקר, בין דגימות עם פריימרים הטלומרים וSCG פריימרים 19. שיטה זו זכתה לביקורת על מדידתו העקיפה של אורך הטלומרים, אשר יכול להוביל למדידה לא מדויקת, למשל, במקרה של כפילויות כרומוזום או וריאציות של מספר עותקים 15. כמו כן, השוואה בין מחקרים היא לעתים קרובות דיfficult, אבל סטנדרטי oligomers פותחו כדי למדוד את אורך הטלומרים 20 מוחלט. שיטה זו קדמה משופרת על ידי Cawthon, באמצעות assay qPCR זמנית בצבע אחד. ב assay זה, ה-PCR הייתה לרוץ בטמפרטורות נמוכות יותר לכמה מחזורים הראשונים, כדי למנוע מחייב פריימר-dimer וגן הטלומרים ובקרה נותחו באותו הצינור PCR להימנע משגיאה נוספת. את מדידות אורך הטלומרים המתקבלות מתואמות חזקות עם אורך הטלומרים נמדד על ידי ניתוח כתם דרומי של TRFs ודיוק גבוה יותר היה 15, 19, 36. באותו הרגע, qRT-PCR היא השיטה הנוחה זמינה רק לבדיקת מדגמים גדולים ורק דורשת כמות קטנה של DNA לביצוע. חלק חיוני של שיטה זו הוא אמצעי בקרת איכות מקיפה, כך שכאשר עושה את זה כמו שצריך, בשיטה זו יכולה לספק מידע השוואתי רב ערך על אורך הטלומרים. בנוסף, בשיטה זו הייתה מותאמת לשימוש מעבר למדידת לויקוציטים אורך הטלומרים במגוון רחב של רקמות שונות 42.
בנוסף לכך, על מנת להבין את הביולוגיה מאחורי תחזוקת אורך הטלומרים ויחסי גומלין בין שתי תופעות המנוגדות (כלומר קיצור הטלומרים במהלך שכפול והתארכות על ידי אנזים טלומראז) נוסף, אנו מלווים את שיטת אורך הטלומרים עם assay נוסף שמודד את פעילות טלומראז.
לצורך כך, אנו משמשים פרוטוקול הגברה חזור Telomeric, assay במבחנה. בקצרה, lysed, נשמר, תאי enzymatically פעילים מסונתזים חוזר telomeric על גבי מצע oligonucleotide באמצעות הטלומראז, ואת המוצרים באמצעות PCR היו מוגבר בנוכחות SYBR הירוקה. התוצאות נותחו על ידי השוואת מדגם וערכי סף ה-CT בקרה. מאז הטלומראז הוא אנזים רגיש לחום, חום נוסף שטופל שליטה לרוץ לצד כל מדגם 21.
יש צורך "jove_content"> בעת מדידת אורך הטלומרים יכולה לספק תובנה חשובה התפקיד האפשרי של אורך הטלומרים בפתופיזיולוגיה של הזדקנות ומחלות, אורך הטלומרים אינו מאפיין סטטי ומידע נוסף כדי להבין פונקצית הטלומרים. מחקרי פעילות telomerase יכולים להוסיף מידע על מנגנוני רגולצית אורך הטלומרים. לדוגמה, ההפעלה המבוקרת של הטלומראז יכולה לשמור על אורך הטלומרים והתפשטות תאים, אך הפעלה בלתי מבוקרת של הטלומראז יכולה לגרום לסרטן. שתי שיטות קדימה זולות וישרות אלה בשילוב סיפק לנו לא רק עם ראיות חזקות יותר לכיוון קשר בין אורך הטלומרים ויציבות תא, אלא גם תובנה נוספת לתוך המנגנונים האפשריים של התקצרות הטלומרים והתאוששות. בעזרת שיטות אלה אנו מקווים להבהיר את התגובה של התא להזדקנות ומצבים שונים של התפשטות תאים נוספים עם המטרה הסופית של הבנה טובה יותר של mechanis המרכזיMS של ביולוגיה של תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פרוטוקול אורך הטלומרים 19
- בידוד ה-DNA
רוב שיטות בידוד DNA יכולה להיות בשימוש. המעבדה שלנו מעדיפה Qiagen DNeasy קיט (# 69,506) למקורות דם. בהתאם למקור של ה-DNA, כגון buccal או מקורות אחרים, ניתן להשתמש בשיטת בידוד שונה.
- פריימרים:
כל פריימרים הם מדוללים בריכוז של מניית 100pmoles/μl במי כיתה PCR ומאוחסנים ב -20 ° C עד הצורך. מניות עבודה של פריימרים נעשות טריות ומאוחסנות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה קצרה של זמן (כמה חודשים). פריימרים רגילים שמשו לטלומרים וβ-גלובין, SCG, כפי שתוארו בO'Callaghan et al. 20 .
רצפי פריימר:
1 Telo: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 "
Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 "
1 SCG: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 "
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '
הערה: צבעי יסוד הם מדוללים לריכוז עבודה של 10pmoles/μl, לפני הוספה לתערובת תגובה.
- דילול הסדרה של הדנ"א הגנומי:
דילולים סדרתי של הדנ"א הגנומי לTelo וג'ין עותק בודד (SCG) נוצרים כדי ליצור עקומת ערך Ct סטנדרטית עבור assay. הדנ"א הגנומי משמש היה שחולץ מן הלימפוציטים מדגימות דם. דילולים אלה נוצרים על ידי דילול PCR DNA עם כיתה H 2 0 לכל ריכוז בפקטור של 1.68 להניב שני הסטים של דילולים סדרתי שמשתמשים באותו הדנ"א הגנומי. הריכוזים המתחילים כבר מותאמים המבוססים על ניסוי וטעייה, וייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בעת שימוש בחומרים כימיים שונים, כלי נגינה, DNA ממינים אחרים, סוגי תאים, ומשמש SCG.
הערה: דילול סידורי באמצעות הדנ"א הגנומי נעשים על ידי ערבוב בעדינות ומחכה לפחות 15 דקות לשעה אחת befoלקיחה מחדש של DNA לדילול הבא. דילול כל דורש זמן להדנ"א הגנומי לנתק. לאחסון, aliquot דילולים סדרו לטווח ארוך לרצועות PCR לאחסון ב -80 ° C. כל רצועת PCR הוא הפשיר והשתמשה פעם אחת, כדי למנוע מחזורי ההפשרה הקפאה שעלול לגרום נזק לדנ"א.
- הגדרת תגובה לRT-PCR
מכשיר בשימוש: Cycler אור Roche480
מגיב: רוש האור Cycler SYBR הירוק
לדלל דגימות DNA בדיקה לריכוז סופי של 10 ng / μl. אנחנו בודקים באמצעות ריכוז Nanodrop או קיוביט. בנוסף, אנו לדלל את ה-DNA מ10ng/μl ל5ng/μl הסופי. אנחנו לא לבדוק את הריכוז שוב.
מרכיבי תגובה:
| Telo | 1x | SCG | 1x | |
| H 2 0 </ P> | 6 μl | H20 | 6 μl | |
| 1 Telo | 0.2 μl | SCG 1 | 0.6 μl | |
| Telo 2 | 1.8 μl | SCG 2 | 1.4 μl | |
| Rxn תמהיל | 10 μl | Rxn תמהיל | 10 μl | |
| DNA או דילול סדרתי | 2 μl | DNA או דילול סדרתי | 2 μl |
הערה: מיקס מאסטר נעשה ללא DNA ועם עודף של 5% עד 10%.
שניהם Telo וSCG מנוהלים יחד על אותה צלחת שימוש בתכנית הבאה. לבדיקת דיוק, לפחות שלושה משכפל של כל דגימה ובקרה יש להפעיל. וריאציות בפריימרים המשמשים עשויות להשפיע על התוצאות. הפרוטוקול שלנו כבר מותאם לעבודה באופן הבא את האור Cycler Roche480 ופריימרים שלנו.
בתוךלפגל itial
10 דקות לפגל 95 מעלות צלזיוס
רכיבה על אופניים
95 ° C 10 שניות אחיזה
60 ° C ההמתנה 5 שניות
72 מעלות צלזיוס ההמתנה 11 שניות ורכישה אחת
חזור על 45 עד 55 פעמים כנדרש
2. (QTD) איתור Telomerase כמותית פרוטוקול (בהתבסס על ערכת QTD על ידי בעלות הברית ביוטק, Inc חתול. מס MT3012)
לחלץ הכנה
- גלולה תאים או רקמות.
- שטפי פעם עם 1x PBS.
- Repellet ולהסיר 1x PBS. *
- Resuspend התא גלולה ב 200 μl של מאגר תמוגה x 1 לכל 10 -10 5 6 תאים או 40-100 מ"ג של רקמה.
- לדגור על קרח למשך 30 דקות.
- ספין למטה מדגם XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- להעביר 160 μl של supernatant לתוך צינור טרי ולקבוע את ריכוז חלבון.
- Aliquot ומהיר להקפיא את התמצית שנותרה על קרח / אתנול יבש, החנות ב -80 ° C.
* בtמצבו, הטלומראז בתאים או רקמות קפואים הוא יציב במשך לפחות שנה. כשהפשרת לשימוש, resuspend התאים באופן מיידי במאגר 1 X תמוגה.
2.1. בקרת assay
שליטת חום איון: לכל דגימה, לחמם טיפול תמצית שליטה נוספת על ידי דוגרים על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני assay פעילות טלומראז.
עקומת סטנדרט לתבנית שליטת TSR: בצע כמותי Real-Time PCR באמצעות דילולים של TSR, oligonucleotide עם רצף דומה לפריימרים הטלומרים כלולים בערכה כדי ליצור עקומה סטנדרטית.
- הכן דילולים סדרו 01:05 לריכוז TSR המניות (0.5 amoles / μl) עם מאגר תמוגה
- לבצע את assay סטנדרטי איתור הטלומראז באמצעות μl 1 של דילול כל TSR, כולל ריכוז המניות. ניתן לאחסן דילולים אלה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות.
2.2. Assay פעילות Telomeraseבאמצעות QTD Real-Time PCR
- עבור כל דגימה, להוסיף את הדברים הבאים לצינור PCR או קיר דק PCR צלחת (נפח כולל μl 25.0):
- 12.5 μl של Premix QTD 2 x
- 1.0 μl של תא או תמצית רקמות
- 11.5 μl של מים מוסמכים PCR
- מערבבים היטב
- תכנית בזמן אמת מערכות איתור PCR על פי התכנית שלהלן:
- 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (תגובת הטלומראז)
- 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (שלב הפעלה ראשוני PCR)
35-40 מחזורים של:
- שנייה 95 מעלות צלזיוס למשך 30 (denaturation)
- 60 שניות מעלות צלזיוס למשך 30 (חישול)
- 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (ארכה) - הנח צינורות PCR בCycler התרמית ולהפעיל את תכנית רכיבה על אופניים.
- לאסוף את מחזור הסף או C ערך T לאחר סיום מחזורים. מחזור הסף הוא המחזור שבו עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית של ΔRn הוא זוהה לראשונה.
2.3. ניתוח נתונים
- Generatעקומת סטנדרט EA באמצעות קריאות t C ולהשוות פעילות טלומראז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה של assay qRT-PCR אורך הטלומרים מוצגת באיור 1. בפנל השמאלי העליון, שכותרתו דגימות באדום וירוק מייצגות את מיקומם של נושאים שנבדקו על 96 גם הצלחת. בלוח הימני העליון, עקומת ההגברה הפגינה. כל נושא נבדק על ידי שני מבחני (ג'ין העתקת הטלומרים ויחיד), אשר נעשה בtriplicates. בשל להעתיק מספרי דנ"א שונים המיוצרים בשני מבחני של אנשים שנבחרו, מספר המחזורים עד לאיתור התפרחת מגיע לעקומת מעריכית שונה בין מבחני. בצינורות מספר עותק גבוהים יותר (כלומר assay הטלומרים), בסכום של גילוי הקרינה מגיע לעקומת מעריכית לאחר 27 מחזורים. הסט השני של קווים מייצג את ג'ין העותק בודד (SCG) שיש לו עותק אחד בלבד בגנום, ולכן יש הרבה פחות עותקים מאשר דגימות הטלומרים ומגיע לעקומת מעריכית רק לאחר 31 מחזורים. הקווים החומים מייצגים את התקןעקומה המבוססת על דילול סידורי של מדגם ריכוזים ידועים. הפנל הימני התחתון מייצג את ריכוז היומן מהנקודות העקומה הסטנדרטיות (קו ישר מדגים דילול סדרה אופטימלי). נמצא בשימוש עקומה ליניארית זה כדי לחשב את הריכוז של צינורות שנבדקו (פנל שמאלי תחתון). תוצאות qRT-PCR, תחילה בידיו של Cawthon 19, וחזר על ידינו ואחרים, הוכח להיות מתואמים עם אלה שהושגו על ידי assay אורך קטע הגבלת המסוף. יחידת יחס T / S אחד (מחזורי qRT-PCR של ריצת הטלומרים על מחזורי qRT-PCR של ריצת SCG) היא שווה ערך לאורך הטלומרים ממוצע של 4270 נ"ב בכדוריות דם לבנות 42. חלוקת מחזורי qRT-PCR עבור assay הטלומרים ידי assay SCG בדוגמא שלנו הביאה ליחס של 0.87, שהוא שווה ערך לממוצע של 3,715 נקודות בסיס. מדידה זו מורכבת מאורך הטלומרים לבד ואינה כוללת אזורי subtelomeric.
QRT-PCR הפגין כאן מעורב הכנת מדגם קטנה מאוד. בדוגמה זו (איור 1), הבדלים איכותיים והכמות כ( המיוצג על ידי דילול סדרתי והתאמה בין triplicates) נצפו בין שני מבחני. התוצאות שנמדדות במבחן זה מראה אורך הטלומרים ביניים לנושא בן 65.
דוגמה לתוצאות assay פעילות הטלומרז ואת הקשר האפשרי בין פעילות telomerase ואורך הטלומרים באה לידי ביטוי באיור 2. התוצאות הראשוניות שלנו מראות כי אורך הטלומרים עוד עשוי להיות קשור לפעילות telomerase מוגברת.
איור 1. איור 1 מייצג את הפלט הטיפוסי מא.ק.assay RT-PCR לאורך הטלומרים. הפינה השמאלית העליונה ניתן לראות את דוגמאות מסודרות בצלחת 96 היטב, בשלושה עותקים. הפינה השמאלית התחתונה מפרטת את הריכוזים שחושבו וערכי CT לכל מדגם, המשמשים לחישוב ערכי T / S. הימני העליון הוא גרף של עקומת ההגברה (מספר המחזורים לעומת התפרחת זוהתה מCYBR הירוק), המשמשת כדי לחזות את התוצאות. בצד ימין למטה, עקומת הסטנדרט לריכוז התחבר לעומת ערך CT של השליטה סידורי הדילול בגרף. קו ישר מאשר שדילול הסדרה נמדד במדויק וטעון. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. שימוש בתוצאות ראשוניות מassay qRT-PCR לפעילות טלומראז ואורך הטלומראז, <חזק> איור 2 מראה קשר ישיר, מובהק (p = 0.008) בין אורך הטלומרים, הנמדד על ידי T / S יחס, ופעילות טלומראז, שנמדד על ידי ערך CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אורך הטלומרים מספק סמן סלולרי ייחודי ללמוד תא לחוץ והזדקנות ומציע תובנות לתוך המנגנונים של הזדקנות. מאז תפקידה בהזדקנות היה ראשון הוצע, מספר רב של המחקרים נעשה נוגע אורך הטלומרים לגיל, תוחלת חיים, מחלות הקשורות לגיל, סרטן, ולחץ. במשך עשרות שנים, ברמה של מדידות אורך הטלומרים הזהב הייתה ניתוח שבר הגבלת מסוף באמצעות הכלאה דרום. עם זאת, לאחרונה שיטה זולה, מהירה, וקלה לביצוע על ידי Cawthon התפתחה. באמצעות PCR כמו בזמן אמת, Cawthon הציע חלופה שימושית למדידת אורך הטלומרים, מה שהופך את הלימודים למדגמים גדולים אפשריים.
שימוש qRT-PCR, נעשו מחקרים רבים כדי לחקור את הקשר בין אורך הטלומרים ומגוון של תוצאות, מחלות הקשורות לגיל במיוחד. באופן ספציפי יותר, שיטה זו אפשרה לחוקרים לבצע סטו אפידמיולוגיים גדולמת על אוכלוסיות הממחישות או להכחיש את קשר בין אורך הטלומרים ומגוון רחב של מחלות. עד כמה שם, מחלת לב איסכמית 7, מחלת אלצהיימר 22, osteocarcoma ב23 נשים, סרטן ריאות בקרב מעשנים 24, סרטן בלוטת התריס משפחתי 25, סוכרת 5, לחץ דם 26, הזדקנות 27, ודמנציה 28 כבר בקורלציה עם אורך הטלומרים קצר יותר , ואילו הקשורות לגיל ניוון מקולרי 7, סרטן המעי הגס 43, ומוות כתוצאה ממחלה זיהומית, סרטן, מחלות לב או כלי דם במוח 44 הוכחו שאין לו קשר משמעותי עם אורך הטלומרים. בנוסף, מדגיש מסוים הוכח בקנה אחד עם אורך קצר הטלומרים, למשל, כמות מוגברת של סמנים דלקתיים, TNF-α ו-IL-6, כבר בקורלציה עם אורכי הטלומרים קצרים יותר בלויקוציטים 29. כמו כן, מלחיץ lifestyles בשל לוח זמנים זמן רב עבודה, עבודה במשמרות, או את אופי העבודה, בעמדת שוער בפרט לילד חולה כרוני, קושרה עם הבדלים באורך הטלומרים. הדבר מצביע על המתח שעלול לגרום להזדקנות מוקדמת בדרך של התקצרות הטלומרים ללא התאוששות מספקת 30, 31. במחקר שנערך לאחרונה, שיש פחות קשרים חברתיים קשור גם טלומרים קצרים יותר 32. מניעת קיצור אורך הטלומרים גם הוכח לתאם עם אפשרויות בחירה בחיים בריאים, כגון לקיחת מולטי ויטמין יומי ולא 24 עישון, 33. בנוסף, מחקרים אלה גילו שימושים קליניים אפשריים למדידת הטלומרים, למשל, כמבחן מיון לא פולשנית להתפתחות האפשרית של שחמת 34. במקרים אחרים, שבו מחקרים דומים הראו שום קשר מובהק (או מתאם צנוע) בין מחלה ואורך הטלומרים, כבר עודדו את החוקרים לרחובמנגנוני רומן שניים ג'ודי לירידה סלולרית והמצב החולה 7.
יש מחקרים אלה כוח במספרים והדגימו את התועלת של מדידת אורך הטלומרים כאחד מצעדיו הראשונים בפענוח תהליך ההזדקנות. שיטת qRT-PCR של Cawthon הייתה שימושית למטרה זו משום שהיא יכולה להשוות את המספר גדול של אנשים, דורשת ה-DNA מינימאלי, והוא יכול לתת ראיות אמינות לכיוון קשר בין אורך הטלומרים ובריאות תא. מחקרים אלה מסייעים לכוון את מאמצי מחקר של הזדקנות עתידית לגנים מסוימים, רקמות, ותהליכים תאיים.
באופן בלתי נמנע, לאחר שהבדל משמעותי באורך הטלומרים יצוין, הסבר הוא שאל. לתשובות על שאלות אלה, מחקרים על טלומראז, האנזים המעורב בתחזוקה הטלומרים והרגולציה שלה, כבר הוקם. פרוטוקולי פעילות הטלומרז מבוססי PCR הוצעו, לתת מידע נוסף לכיוון: א. קביעת המשךributions של השפלה של הטלומרים, וכן ב. כישלון של תחזוקת אורך הטלומרים מוצלחת של הטלומראז, וכך לספק עוד פרק לסיפור על הזדקנות בכללותו, בהזדקנות תא מסוימת.
למרות qRT-PCR מזהה אורך הטלומרים ממוצע, ולא על בסיס אישי כרומוזום, שיטה זו היא כלי רב עוצמה לראיות כלפי איך התא מגיב להזדקנות ואת הלחץ ומספקת הקדמה לסיפור על איך שאנו מתבגרים. מעניין לציין, כי המידע הזה כבר הוביל למדידת אורך הטלומרים במרפאת להערכת גיל ביולוגי ולקדם את ההבנה של תהליך ההזדקנות שלנו ובסופו להוביל למניעה או עיכוב והקרנה של הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל.
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוג |
| איתור Telomerase כמותית בעלות הברית ביוטק | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy קיט | Qiagen | 69,506 |
| LightCycler 480 SYBR גרין מאסטר לי, מוכן לשימוש תערובת תגובה חמה לתחילת SYBR גרין המבוסס בזמן אמת PCR באמצעות מכשיר LightCycler 480 | אבחון רוש | 4707516 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
- Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
- Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
- Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
- Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
- Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
- Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , In Press (2012).
- Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
- Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
- Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
- Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
- Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
- Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
- O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
- Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
- Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
- O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
- Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
- Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
- Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
- Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
- Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
- Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
- Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
- Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
- O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
- Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
- Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. , In Press (2012).
- Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
- Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , In Press (2012).
- Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , In Press (2012).
- Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
- Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
- Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
- Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
- Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
- Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
- Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).
