Telomere लंबाई और टेलोमिरेज गतिविधि, सेल बुढ़ापा की एक यिन और यांग
Summary
एक सटीक, कम परिष्कृत और सस्ती विधि कई ऊतकों और QRT-पीसीआर का उपयोग प्रजातियों में telomere लंबाई का आकलन है कि वर्णित है. इसके अलावा, हम telomere लंबाई के लिए एक पूरक रीढ़ परीक्षण के रूप में टेलोमिरेज गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सरल परख का वर्णन करेंगे.
Abstract
Telomeres सिरे पर डीएनए अनुक्रम दोहरा रहे हैं लंबाई में और मानव में विविध रहे हैं कि क्रोमोसोम के 15,000 आधार जोड़े की लंबाई तक पहुँच सकते हैं समाप्त होता है. telomere प्रत्येक कोशिका विभाजन में गुणसूत्र संघर्षण की एक bioprotective तंत्र के रूप में कार्य करता है. एक निश्चित अवधि में, telomeres के प्रतिकृति, गुणसूत्र अस्थिरता या कोशिका मृत्यु का कारण हो सकता है कि एक प्रक्रिया की अनुमति के लिए भी कम हो गया. उदासीनता और बढ़ाव: telomere लंबाई दो परस्पर विरोधी तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है. प्रत्येक कोशिका विभाजित के रूप में उदासीनता होता है. इसके विपरीत, बढ़ाव क्रोमोसोम के सिरों को दोहरा दृश्यों को कहते हैं जो एंजाइम टेलोमिरेज, द्वारा आंशिक रूप से संग्राहक है. इस तरह, टेलोमिरेज संभवतः एक बूढ़ा तंत्र रिवर्स और सेल व्यवहार्यता rejuvenates सकता है. ये सेल जीवन को बनाए रखने में महत्वपूर्ण तत्व हैं और सेलुलर उम्र बढ़ने का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. इस पांडुलिपि में हम कई ऊतकों में telomere लंबाई का आकलन करने के लिए एक सटीक, कम, परिष्कृत और सस्ती विधि का वर्णन करेंगेएस और प्रजातियों. इस विधि telomere अनुक्रम का मिलकर दोहराने और परीक्षण नमूनों का अंतर प्रतिलिपि संख्या का पता लगाने के लिए QRT-पीसीआर की संवेदनशीलता, दो प्रमुख तत्वों का लाभ लेता है. इसके अलावा, हम telomere लंबाई के लिए एक पूरक रीढ़ परीक्षण के रूप में टेलोमिरेज गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सरल परख का वर्णन करेंगे.
Introduction
Telomeres क्रोमोसोम के सिरों पर पाया डीएनए hexamer (TTAGGG) दृश्यों को दोहरा रहे हैं. प्रत्येक सेल प्रतिकृति में, इन गुणसूत्र सिरों छोटा कर रहे हैं. वे भी कम हो जाते हैं, गुणसूत्रों telomere अंत fusions, न्यायपालिका पुनर्संयोजन, और गिरावट से गुजरना कर सकते हैं. इस प्रकार पर्याप्त telomere लंबाई रखरखाव गुणसूत्र स्थिरता और सेल संरक्षण 38 में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. Telomere लंबाई रखरखाव भी क्रोमोसोम के सिरों के पास पाया जीनों के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि डीएनए प्रतिकृति गुणसूत्रों 1-2 की बहुत अंत तक जारी नहीं रख सकते. नतीजतन, telomere छोटा की रोकथाम सेल स्थिरता में सुधार हो सकता है.
कई अध्ययनों से telomere लंबाई ऐसे 3-4, मधुमेह 5, और हृदय रोग 6,7 कैंसर के रूप में एक जीव की दीर्घायु और रोगग्रस्त राज्य, साथ जोड़ा जाता है कि सूचना है. इसके अतिरिक्त, छोटा telomeres अत्यधिक तनाव या एक के साथ संबद्ध किया गया हैशायद समय से पहले सेल बुढ़ापे और मृत्यु 9 को बढ़ावा देने से अस्वस्थ जीवन शैली 8. दूसरी ओर, कुछ अध्ययनों रोग 39, 40, 41 संबंधित telomere लंबाई और लंबी उम्र और उम्र के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर है कि मिल गया है.
Telomere छोटा से सुरक्षा की सेल की सहज तंत्रों में से एक अपने स्वयं के एंजाइम टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (tert) को सक्रिय करने के द्वारा होता है. इस एंजाइम और इसके सबयूनिट, टेलोमिरेज आरएनए (TERC), एक गैर कोडन आरएनए, 10 समाप्त होता गुणसूत्र को टेलोमेर दोहराता जोड़ने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में telomere का उपयोग करें. टेलोमिरेज गतिविधि कोशिकाओं और अन्य तंत्र के कई प्रकार के telomere लंबाई रखरखाव में शामिल रहे हैं से अनुपस्थित है, वृद्धि हुई टेलोमिरेज गतिविधि बढ़ा telomere लंबाई के साथ जोड़ा जाता है. टेलोमिरेज सक्रियण कोशिकाओं की क्षति का जवाब और तनाव और समय से पहले बुढ़ापा और मौत से बचने के लिए जो व्यवस्था के द्वारा के रूप में स्थापित कर दिया गया है. उदाहरण के लिए, अब तेlomeres असाधारण उम्र 11 से Ashkenazi यहूदियों की आबादी में प्रदर्शन कर रहे थे, TERC या Tert में परिवर्तन उम्र से संबंधित बीमारी 13 पर एक प्रभाव है दिखाया गया है घातक बीमारी 12, और टेलोमिरेज की epigenetic विनियमन के लिए योगदान करने के लिए दिखाया गया है. इसकी खोज के बाद से, telomere लंबाई विभिन्न पशु मॉडल में और साथ ही मानव में स्वास्थ्य की स्थिति के लिए एक biomarker के रूप में प्रस्तावित किया, लेकिन विधि का इस्तेमाल किया, थकाऊ लंबा और महंगा था क्योंकि इन प्रारंभिक अध्ययन व्यापक रूप से दोहराने के लिए मुश्किल थे किया गया है. 2002 और आगे 2009 में देखते में, Cawthon प्रस्तावित और telomere लंबाई का आकलन और आगे उम्र बढ़ने और रोग के 19, कोशिका जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं में अपनी भूमिका की जांच के लिए एक नया, सटीक, तेजी से और सरल पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया.
एक अध्ययन के लिए सही telomere मापने विधि का चयन आवश्यक है. वर्तमान में, telomere लंबाई मापने के लिए इस्तेमाल विभिन्न तरीकों अपने स्वयं के साथ प्रत्येक रहे हैंफायदे और नुकसान. एक: परंपरागत रूप से, telomere लंबाई शामिल है जो टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़े के दक्षिणी धब्बा विश्लेषण (TRFs), का उपयोग कर मापा जाता है. ख, TRFs प्राप्त करने के क्रम में telomere दोहराता में कटौती नहीं है कि प्रतिबंध एंजाइमों के साथ डीएनए पचाने. इन TRFs के दक्षिणी ब्लाट एक telomeric जांच 14, 37 का उपयोग कर मतलब टीआरएफ लंबाई का निर्धारण किया जाता है. इस विधि के बदलाव का एक छोटा सा गुणांक के साथ बेहद सटीक है, एक सीधा उपाय है, और लंबाई के वितरण को मापने के लिए फायदेमंद हो सकता है, टीआरएफ विश्लेषण, गहन श्रम महंगा है और डीएनए के कम से कम 3 ग्राम की आवश्यकता है. इस विधि की जांच की वजह से (TTAGGG) एन वे, 42 15 होते दृश्यों की तरह पता लगाया जा सकता है जो subtelomeric डीएनए से चकित किया जा सकता भी कम telomeres और लंबाई के दृढ़ संकल्प के प्रति असंवेदनशील है.
Telomere लंबाई मापने में एक और बेहद सटीक विधि एकल Telomere बढ़ाव लंबाई विश्लेषण (Stela), एक singl हैकेवल डीएनए की एक छोटी राशि की आवश्यकता है कि ई अणु पीसीआर आधारित विधि. इस विधि में, प्राइमरों गुणसूत्रों के अंत में जी अमीर अधिकता पहचान करने के लिए और एक विशिष्ट गुणसूत्र के टेलोमेर amplifies जो एक गुणसूत्र पर एक अद्वितीय subtelomeric अनुक्रम करने के लिए बाध्य किया जाता है. परिणामस्वरूप प्रवर्धन फिर दक्षिणी ब्लाट द्वारा कल्पना है. यह विधि बहुत सटीक होने का लाभ है और कम ग़ैर telomeres के 16 पता लगाने में सक्षम है. नहीं सभी गुणसूत्रों जी युक्त समाप्त होता है और एक प्रयोग करने योग्य subtelomeric अनुक्रम के बाद दुर्भाग्य से,, telomere लंबाई केवल विशिष्ट गुणसूत्रों पर मापा जा सकता है और इन मापों सेल 15 में सभी telomeres की लंबाई का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं.
अभ्यास किया गया है कि एक अन्य विधि telomere लंबाई का पता लगाने के लिए पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (PNA) जांच का इस्तेमाल होता है. बगल में संकरण में मात्रात्मक पुष्पन (क्यू मछली) हमें जहां सेंट मेटाफ़ेज़, दौरान telomeres के कल्पना करने के लिए अनुमति देता हैउनके आकार के अनुपात में एक PNA जांच के साथ telomeres की aining विशिष्ट गुणसूत्रों के बीच telomeres की तुलना परमिट. इस विधि भी अंतरावस्था में कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यहाँ अलग क्रोमोसोम के लिए telomere लंबाई 17 वृद्ध होनेवाला या कभी कभी कोशिकाओं को विभाजित में telomere लंबाई मापने जब एक सीमा का परिचय है, जो पता नहीं किया जा सकता है. फ्लो मछली के बजाय प्रवाह का उपयोग करता है और वर्तमान में नैदानिक सेटिंग में रक्त कोशिकाओं की telomere लंबाई मापने के लिए सबसे संवेदनशील तरीका है, लेकिन अत्यधिक कुशल तकनीशियनों 18 की आवश्यकता है.
वर्तमान में, हमारी प्रयोगशाला में औसत telomere लंबाई मापने के लिए मानक विधि परिशुद्धता, संवेदनशीलता का लाभ लेता है, और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर में आसानी. इस विधि अन्यथा रूप में निर्मित किया गया है, जो होगा प्राइमर डिमर व्युत्पन्न उत्पादों का संश्लेषण, बचने कि उपन्यास प्राइमरों के विकास से telomere लंबाई मापने के लिए किया गया था संभवtelomeres की दोहरा प्रकृति के कारण tandard परख. इस परख के लिए, telomere लंबाई की माप एकल प्रतिलिपि जीन संख्या को टी / एस अनुपात, telomere दोहराने की नकल संख्या का प्रतिनिधित्व करती है. Telomere लंबाई और पीसीआर की शुरुआत चरणों के दौरान डीएनए के लिए बाध्य लेबल telomere प्राइमरों की संख्या के बीच एक सीधा आनुपातिक रिश्ता है, टी / एस अनुपात telomere लंबाई के लिए आनुपातिक है. टी / एस अनुपात सीटी में अंतर की तुलना द्वारा मापा जाता है, नमूना पुष्पन संचित है, जिस पर आंशिक चक्र संख्या telomere प्राइमरों के साथ नमूने और प्राइमरों 19 एससीजी के बीच, आधारभूत पुष्पन ऊपर कई मानक विचलन है कि एक सीमा को पार करती है. इस विधि गुणसूत्र दोहराव या नकल संख्या विविधताओं 15 के मामले में गलत माप के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो telomere लंबाई की अपनी अप्रत्यक्ष माप, उदाहरण के लिए के लिए आलोचना की गई है. इसके अलावा, अध्ययनों के बीच तुलना अक्सर दी हैfficult, लेकिन मानक oligomers पूर्ण telomere लंबाई 20 को मापने के लिए विकसित किया गया है. यह विधि एक मोनोक्रोम मल्टीप्लेक्स qPCR परख का उपयोग, Cawthon द्वारा पर सुधार को आगे बढ़ाया गया था. इस परख में, पीसीआर प्राइमर डिमर बंधन से बचने के लिए पहले कुछ चक्र के लिए कम तापमान पर चलाया गया था और telomere और नियंत्रण जीन आगे त्रुटि से बचने के लिए एक ही पीसीआर ट्यूब में विश्लेषण किया गया. परिणामस्वरूप telomere लंबाई माप जोरदार TRFs के दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा मापा telomere लंबाई के साथ सहसंबद्ध और उच्च सटीकता के 15, 19, 36 की थी. फिलहाल, QRT-पीसीआर बड़े आकार के नमूनों के परीक्षण के लिए उपलब्ध ही सुविधाजनक तरीका है और केवल बाहर ले जाने के लिए डीएनए की एक छोटी राशि की आवश्यकता है. इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है कि यह ठीक से किया है, इस विधि telomere लंबाई के बारे में महत्वपूर्ण तुलनात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है, ताकि व्यापक गुणवत्ता नियंत्रण उपायों है. इसके अतिरिक्त, इस विधि को मापने के लिए ल्यूकोसाइट्स परे इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया थाविभिन्न ऊतकों की एक किस्म के 42 में telomere लंबाई.
इसके अतिरिक्त, आगे telomere लंबाई रखरखाव और दो परस्पर विरोधी प्रभाव (टेलोमिरेज एंजाइम द्वारा प्रतिकृति और बढ़ाव के दौरान यानी telomere छोटा) के बीच बातचीत के पीछे जीव विज्ञान को समझने के क्रम में, हम टेलोमिरेज गतिविधि उपाय है कि एक अतिरिक्त परख के साथ telomere लंबाई विधि के साथ थे.
इस प्रयोजन के लिए, हम एक telomeric दोहराएँ प्रवर्धन प्रोटोकॉल, एक में इन विट्रो परख इस्तेमाल किया. संक्षेप में, lysed, संरक्षित, enzymatically सक्रिय कोशिकाओं टेलोमिरेज का उपयोग कर एक oligonucleotide सब्सट्रेट telomeric दोहराता संश्लेषित, और उत्पादों SYBR ग्रीन की उपस्थिति में पीसीआर का उपयोग परिलक्षित किया गया. परिणाम तो नमूना तुलना और नियंत्रण सीटी दहलीज मूल्यों से विश्लेषण किया गया. टेलोमिरेज एक गर्मी के प्रति संवेदनशील एंजाइम है, एक अतिरिक्त गर्मी नियंत्रण इलाज प्रत्येक नमूना 21 के साथ चलाया जाता है.
<p class="Jove_content"> telomere लंबाई मापने के बुढ़ापे और बीमारी के pathophysiology में telomere लंबाई की संभावित भूमिका में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, telomere लंबाई एक स्थिर संपत्ति और अधिक जानकारी नहीं है telomere समारोह को समझने की जरूरत है. टेलोमिरेज गतिविधि पढ़ाई telomere लंबाई नियमन तंत्र के बारे में जानकारी जोड़ सकते हैं. उदाहरण के लिए, टेलोमिरेज की नियंत्रित सक्रियण telomere लंबाई और सेल प्रसार को बनाए रख सकते हैं, लेकिन टेलोमिरेज की अनियंत्रित सक्रियण कैंसर में परिणाम कर सकते हैं. संयुक्त इन दोनों सस्ती और सीधे आगे तरीकों telomere लंबाई और सेल स्थिरता के बीच एक संबंध की दिशा में मजबूत सबूत है, लेकिन यह भी telomere छोटा और वसूली के संभावित तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि के साथ न केवल हमें प्रदान की है. इन तरीकों के साथ हम आगे केंद्रीय mechanis की एक बेहतर समझ के अंतिम लक्ष्य के साथ उम्र बढ़ने और सेल प्रसार के विभिन्न राज्यों के लिए सेल की प्रतिक्रिया को स्पष्ट करने की उम्मीदकोशिका जीव विज्ञान के एमएस.Protocol
1. Telomere लंबाई प्रोटोकॉल 19
- डीएनए अलगाव
सबसे डीएनए अलगाव तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी लैब रक्त स्रोतों के लिए क्विएज़न DNeasy किट (# 69506) पसंद करती हैं. ऐसे मुख या अन्य स्रोतों के रूप में डीएनए के स्रोत पर निर्भर करता है, एक अलग अलगाव विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्राइमर:
सभी प्राइमरों पीसीआर ग्रेड पानी में 100pmoles/μl के एक शेयर की एकाग्रता को पतला और जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है. प्राइमरों के कार्य शेयरों समय की एक छोटी अवधि के लिए नए सिरे से बना रहे हैं और 20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है (कुछ महीने.) मानक प्राइमरों रूप O'Callaghan एट अल में वर्णित है, telomeres और β-ग्लोबिन, एससीजी के लिए इस्तेमाल किया गया. 20 .
प्राइमर दृश्यों:
TELO 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT -3 '
TELO 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT -3 '
एससीजी 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC -3 '
एससीजी 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-एसीसी -3 '
नोट: प्राइमर पूर्व प्रतिक्रिया मिश्रण को जोड़ने के लिए, 10pmoles/μl के एक काम एकाग्रता को पतला कर रहे हैं.
- जीनोमिक डीएनए के धारावाहिक कमजोर पड़ने:
TELO और सिंगल कॉपी जीन (एससीजी) के लिए जीनोमिक डीएनए के धारावाहिक dilutions परख के लिए एक मानक सीटी मूल्य वक्र उत्पन्न करने के लिए बनाया जाता है. इस्तेमाल किया जीनोमिक डीएनए रक्त के नमूनों से लिम्फोसाइटों से निकाला गया था. ये dilutions के ही जीनोमिक डीएनए का उपयोग धारावाहिक dilutions के दो सेट उपज के लिए 1.68 का एक पहलू से प्रत्येक एकाग्रता के लिए पीसीआर ग्रेड 2 एच 0 के साथ डीएनए गिराए द्वारा बनाई गई हैं. शुरू सांद्रता परीक्षण और त्रुटि के आधार पर अनुकूलित किया गया है और विभिन्न अभिकर्मकों, यंत्र, अन्य प्रजातियों से डीएनए, सेल प्रकार, और उपयोग एससीजी का उपयोग करते समय समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
नोट: जीनोमिक डीएनए का उपयोग सीरियल कमजोर पड़ने धीरे मिश्रण और एक घंटे befo के लिए कम से कम 15 मिनट इंतज़ार कर रही द्वारा किया जाता हैअगले कमजोर पड़ने के लिए डीएनए ले जा रहे हैं. प्रत्येक कमजोर पड़ने से अलग कर देना जीनोमिक डीएनए के लिए समय की आवश्यकता है. -80 में भंडारण के लिए पीसीआर स्ट्रिप्स डिग्री सेल्सियस में लंबी अवधि के भंडारण, विभाज्य धारावाहिक dilutions के लिए प्रत्येक पीसीआर पट्टी thawed और डीएनए को नुकसान हो सकता है कि फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए एक बार प्रयोग किया जाता है.
- RT-पीसीआर के लिए रिएक्शन सेटअप
इस्तेमाल किया साधन: Roche480 लाइट Cycler
अभिकर्मक: रॉश लाइट cycler SYBR हरी
10 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए परीक्षण डीएनए नमूने पतला. हम Nanodrop या Qubit उपयोग कर एकाग्रता का परीक्षण. हम आगे 10ng/μl से अंतिम 5ng/μl को डीएनए पतला. हम फिर से एकाग्रता परीक्षण नहीं है.
रिएक्शन घटक:
| TELO | 1x | एससीजी | 1x | |
| एच 2 0 </ P> | 6 μl | H20 | 6 μl | |
| TELO 1 | 0.2 μl | 1 एससीजी | 0.6 μl | |
| TELO 2 | 1.8 μl | 2 एससीजी | 1.4 μl | |
| Rxn मिश्रण | 10 μl | Rxn मिश्रण | 10 μl | |
| डीएनए या धारावाहिक कमजोर पड़ने | 2 μl | डीएनए या धारावाहिक कमजोर पड़ने | 2 μl |
नोट: मास्टर मिक्स डीएनए बिना और 5% से 10% की एक अतिरिक्त के साथ किया जाता है.
TELO और एससीजी दोनों निम्न प्रोग्राम का उपयोग कर एक ही थाली पर एक साथ चलाए जा रहे हैं. , शुद्धता के लिए परीक्षण करने के लिए कम से कम तीन प्रत्येक नमूने की replicates और नियंत्रण चलाया जाना चाहिए. इस्तेमाल किया प्राइमरों में बदलाव के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. हमारे प्रोटोकॉल Roche480 लाइट Cycler और हमारे प्राइमरों पर इस प्रकार के रूप में काम करने के लिए अनुकूलित किया गया है.
मेंitial denature
10 मिनट denature 95 डिग्री सेल्सियस
साइकल चलाना
95 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड पकड़
60 डिग्री सेल्सियस 5 सेकंड पकड़
72 डिग्री सेल्सियस 11 सेकंड पकड़ और एकल अधिग्रहण
आवश्यकता के रूप में 45 से 55 बार दोहराएँ
2. मात्रात्मक टेलोमिरेज जांच (QTD) प्रोटोकॉल (एलाइड बायोटेक, Inc बिल्ली. सं MT3012 द्वारा QTD किट के आधार पर)
तैयारी निकालें
- गोली कोशिकाओं या ऊतकों.
- 1x पीबीएस के साथ एक बार धोएं.
- Repellet और हटायें 1x पीबीएस. *
- हर 10 में 5 -10 6 कोशिकाओं या ऊतकों के 40-100 मिलीग्राम के लिए 1 एक्स lysis बफर के 200 μl में सेल गोली Resuspend.
- 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूना स्पिन
- एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 160 μl स्थानांतरण और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
- विभाज्य और -80 पर सूखी बर्फ / इथेनॉल पर जल्दी फ्रीज शेष निकालने, दुकान डिग्री सेल्सियस
* टी मेंउसकी हालत, जमे हुए कोशिकाओं या ऊतकों में टेलोमिरेज कम से कम एक साल के लिए स्थिर है. उपयोग के लिए thawed जब, 1 एक्स lysis बफर में तुरंत कोशिकाओं resuspend.
2.1. परख नियंत्रण
गर्मी निष्क्रियता नियंत्रण: प्रत्येक नमूना के लिए, पहले टेलोमिरेज गतिविधि परख के लिए 10 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा एक अतिरिक्त नियंत्रण निकालने का इलाज गर्मी.
टीएसआर नियंत्रण टेम्पलेट के लिए मानक वक्र: एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए किट के साथ शामिल telomere प्राइमरों के लिए एक समान दृश्य के साथ टीएसआर, एक oligonucleotide के dilutions उपयोग कर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन करना.
- Lysis बफर के साथ शेयर टीएसआर एकाग्रता के 1:05 धारावाहिक dilutions (0.5 amoles / μl) तैयार करें
- शेयर एकाग्रता सहित, प्रत्येक टीएसआर छूट के 1 μl का उपयोग कर टेलोमिरेज का पता लगाने के मानक परख प्रदर्शन. ये dilutions के कम से कम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
2.2. टेलोमिरेज गतिविधि परखQTD रियल टाइम पीसीआर का उपयोग
- प्रत्येक नमूना के लिए, एक पीसीआर ट्यूब या पतली दीवार पीसीआर प्लेट (कुल मात्रा 25.0 μl) में निम्नलिखित जोड़ें:
- 2 एक्स QTD Premix की 12.5 μl
- सेल या ऊतक निकालने के 1.0 μl
- पीसीआर योग्य जल की 11.5 μl
- अच्छी तरह मिक्स
- नीचे दिए गए कार्यक्रम के अनुसार कार्यक्रम रियल टाइम पीसीआर जांच सिस्टम:
– 25 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट (टेलोमिरेज प्रतिक्रिया) के लिए
– 95 10 मिनट (पीसीआर प्रारंभिक सक्रियण कदम) के लिए डिग्री सेल्सियस
के 35-40 चक्र:
– 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड (विकृतीकरण)
– 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड (annealing)
– 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड (विस्तार) - थर्मल cycler में पीसीआर ट्यूब प्लेस और साइकिल कार्यक्रम शुरू करते हैं.
- चक्र खत्म होने के बाद सीमा चक्र या सी टी मान लीजिए. सीमा चक्र ΔRn की एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि पहली बार पता चला है, जिस पर चक्र है.
2.3. डेटा विश्लेषण
- Generatईए मानक वक्र सी टी रीडिंग का उपयोग करते हुए और टेलोमिरेज गतिविधि की तुलना करें.
Representative Results
Discussion
Telomere लंबाई पर बल दिया और उम्र बढ़ने सेल अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय सेलुलर मार्कर प्रदान करता है और उम्र बढ़ने के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. बुढ़ापे में अपनी भूमिका पहले सुझाव दिया गया था, अध्ययन की एक भीड़ उम्र के telomere लंबाई संबंध में किया गया है, दीर्घायु, उम्र से संबंधित रोग, कैंसर, और तनाव. दशकों के लिए, telomere लंबाई माप के सोने के मानक दक्षिणी संकरण का उपयोग कर टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा विश्लेषण था. हालांकि, हाल ही में Cawthon द्वारा एक सस्ती, त्वरित, और प्रदर्शन करने के लिए आसान तरीका विकसित किया गया है. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का प्रयोग, Cawthon संभव नमूना बड़े आकार के लिए पढ़ाई कर रही है, telomere लंबाई को मापने के लिए एक उपयोगी विकल्प की पेशकश की.
QRT-पीसीआर का प्रयोग, कई अध्ययनों telomere लंबाई और परिणामों की एक किस्म, विशेष रूप से उम्र से संबंधित बीमारियों के बीच संबंधों की जांच करने के लिए किया गया है. अधिक विशेष रूप से, इस विधि शोधकर्ताओं बड़ी महामारी विज्ञान के छात्र प्रदर्शन करने के लिए अनुमति दी गई हैtelomere लंबाई और रोगों की एक किस्म के बीच एक संबंध का प्रदर्शन या इनकार करते हैं कि आबादी पर मर जाता है. कुछ, इस्कीमिक हृदय रोग के 7, अल्जाइमर रोग के 22, महिलाएं 23, धूम्रपान करने वालों के 24 में फेफड़ों के कैंसर, पारिवारिक थायराइड कैंसर के 25 में osteocarcoma नाम करने के लिए, मधुमेह 5, रक्त 27 उम्र बढ़ने दबाव 26, और पागलपन के 28 छोटे telomere लंबाई के साथ सहसंबद्ध किया गया है , उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन 7, कोलोरेक्टल कैंसर के 43, और संक्रामक रोग, कैंसर, हृदय या cerebrovascular रोग 44 से मौत telomere लंबाई के साथ कोई महत्वपूर्ण संबंध है दिखाया गया है, जबकि. इसके अतिरिक्त, कुछ तनाव उदाहरण के लिए कम telomere लंबाई, भड़काऊ मार्करों की एक वृद्धि की राशि, TNF-α और आईएल -6 के साथ मेल खाना करने के लिए दिखाया गया है, ल्यूकोसाइट्स 29 में कम telomere लंबाई के साथ सहसंबद्ध किया गया है. इसके अलावा, तनावपूर्ण lifसमय लेने का काम अनुसूचियां, पाली काम, या काम की प्रकृति के कारण estyles, एक लंबे समय से बीमार बच्चे के लिए विशेष रूप से एक कार्यवाहक स्थिति में, telomere लंबाई में अंतर के साथ संबद्ध किया गया है. इसका मतलब है कि तनाव पर्याप्त वसूली 30, 31 बिना telomere छोटा के माध्यम से समय से पहले बूढ़ा हो सकता है पता चलता है. हाल ही में एक अध्ययन में, कम सामाजिक रिश्तों होने भी कम telomeres के 32 के साथ जुड़ा हुआ है. Telomere लंबाई को छोटा करने का निवारण भी इस तरह के एक दैनिक मल्टीविटामिन और नहीं धूम्रपान 24, 33 लेने के रूप में स्वस्थ जीवन विकल्प के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है. इसके अतिरिक्त, इन अध्ययनों सिरोसिस 34 के संभावित विकास के लिए एक गैर इनवेसिव स्क्रीनिंग परीक्षा के रूप में, उदाहरण के लिए, मापने telomeres के लिए संभव चिकित्सीय उपयोग करता है पता चला. अन्य मामलों में, जहां इसी तरह के अध्ययन में एक बीमारी और telomere लंबाई के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध (या एक मामूली सहसंबंध) से पता चला है, शोधकर्ताओं ने सेंट करने के लिए प्रोत्साहित किया गया हैसेलुलर गिरावट और रोगग्रस्त राज्य 7 Udy अन्य उपन्यास तंत्र है.
इन अध्ययनों संख्या में ताकत है और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया का गूढ़ रहस्य में पहले कदम के रूप में telomere लंबाई मापने की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है. Cawthon के QRT-पीसीआर विधि यह है कि लोगों की बड़ी संख्या की तुलना कर सकते हैं, क्योंकि इस उद्देश्य के लिए उपयोगी था न्यूनतम डीएनए की आवश्यकता है, और telomere लंबाई और सेल स्वास्थ्य के बीच एक संबंध की दिशा में विश्वसनीय सबूत दे सकते हैं. इन अध्ययनों से कुछ जीन, ऊतकों, और सेलुलर प्रक्रियाओं को भविष्य उम्र बढ़ने अनुसंधान प्रयासों को बधिया करने के लिए मदद करते हैं.
Telomere लंबाई में एक महत्वपूर्ण अंतर का उल्लेख किया जाता है, के बाद अनिवार्य रूप से,, एक स्पष्टीकरण प्रश्न किया जाता है. जवाब के लिए इन सवालों, टेलोमिरेज पर पढ़ाई, telomere रखरखाव और इसके नियमन में शामिल एंजाइम, स्थापित किया गया है. पीसीआर आधारित टेलोमिरेज गतिविधि प्रोटोकॉल के प्रति अतिरिक्त जानकारी देने की पेशकश की गई है: एक. आगे का निर्धारणtelomeres की गिरावट, और ख की ributions. टेलोमिरेज द्वारा सफल telomere लंबाई रखरखाव की विफलता है, इस प्रकार विशेष सेल जीर्णता में, एक पूरे के रूप में उम्र बढ़ने पर कहानी को एक और अध्याय प्रदान करते हैं.
QRT-पीसीआर एक व्यक्ति गुणसूत्र आधार पर औसत telomere लंबाई, और नहीं पता लगाता है, यह विधि उम्र बढ़ने और तनाव को सेल प्रतिक्रिया की ओर सबूत के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और कैसे हम उम्र की कहानी के लिए एक प्रस्तावना प्रदान करता है. दिलचस्प है, यह जानकारी पहले से ही जैविक उम्र का आकलन करने के लिए क्लिनिक में telomere लंबाई की माप के लिए प्रेरित किया है और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ को आगे और अनिवार्य रूप से रोकथाम या देरी और उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारी की स्क्रीनिंग को बढ़ावा मिलेगा.
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | सूची संख्या |
| मात्रात्मक टेलोमिरेज जांच </tघ> | मित्र देशों बायोटेक | MT3012 |
| क्विएज़न DNeasy किट | क्विएज़न | 69506 |
| LightCycler 480 SYBR ग्रीन मैं मास्टर, LightCycler 480 साधन का उपयोग कर SYBR ग्रीन मैं आधारित वास्तविक समय पीसीआर के लिए तैयार करने के लिए उपयोग गर्म शुरू प्रतिक्रिया मिश्रण | रॉश निदान | 4707516 |
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
- Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
- Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
- Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
- Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
- Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
- Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , (2012).
- Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
- Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
- Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
- Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer’s Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
- Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
- Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
- O’Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
- Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
- Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
- O’Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
- Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
- Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
- Mirabello, L., Richards, e. g., Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
- Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D., Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
- Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
- Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
- Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
- Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
- O’Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
- Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
- Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres?. Health Psychology. , (2012).
- Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
- Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , (2012).
- Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , (2012).
- Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S., Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
- Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
- Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -. C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -. H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
- Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
- Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -. L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
- Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
- Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -. C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -. H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).
