Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Telomere Lengde og telomerase aktivitet; En Yin og Yang av Cell Senescence

Published: May 22, 2013 doi: 10.3791/50246
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Diabetes Research and Training Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Summary

En nøyaktig, kort, sofistikert og billig metode er beskrevet som vurderer telomere lengde i flere vev og arter ved hjelp QRT-PCR. I tillegg vil vi beskrive en enkel analyse for å vurdere telomeraseaktivitet som en komplementær ryggrad test for telomer-lengde.

Abstract

Telomerer gjentar DNA-sekvenser på spissen ender av kromosomene som er forskjellige i lengde, og i mennesker kan nå en lengde på 15 000 basepar. Den telomere tjener som en mekanisme Biobeskyttende av kromosom slitasje ved hver celledeling. I en viss lengde, telomerer blir for kort til å tillate replikasjon, en prosess som kan føre til ustabilitet kromosom eller celledød. Telomerlengde er regulert av to motstridende mekanismer: avgang og tøyelighet. Slitasje oppstår som hver celle deler seg. I motsetning, er forlengelsen delvis modulert av enzymet telomerase, som legger gjentatte sekvenser til endene av kromosomene. På denne måten kan telomerase muligens reversere en aldrende mekanisme og forynger celle levedyktighet. Dette er viktige elementer i å opprettholde celle liv og brukes til å vurdere cellulær aldring. I dette manuskriptet vil vi beskrive en nøyaktig, kort, sofistikert og billig metode for å vurdere telomere lengde i flere vevs og arter. Denne metoden tar fordel av to hovedelementer, tandem gjentagelse av den telomer-sekvens og følsomheten av QRT-PCR for å påvise differensielle kopi antall testede prøver. I tillegg vil vi beskrive en enkel analyse for å vurdere telomeraseaktivitet som en komplementær ryggrad test for telomer-lengde.

Introduction

Telomerer er å gjenta DNA hexamer (TTAGGG) sekvenser funnet på endene av kromosomene. I hver celle replikasjon, er disse kromosom ender forkortet. Hvis de blir for kort, kan kromosomer gjennomgå telomere end fusjoner, avvikende rekombinasjon, og nedbrytning. Dermed tilstrekkelig telomerlengde vedlikehold spiller en stor rolle i kromosom stabilitet og cellebeskyttelse 38. Telomerlengde vedlikehold er også avgjørende for gener funnet nær endene av kromosomene, siden DNA replikering ikke kan fortsette helt til enden av kromosomene 1-2. Følgelig kan forebygging av telomerer forkortes forbedre celle stabilitet.

Tallrike studier har rapportert at telomer-lengden er korrelert med en organisme lange levetid og tilstand av sykdom, slik som kreft i 3-4, diabetes 5, og kardiovaskulær sykdom 6,7. I tillegg har forkortet telomerer blitt assosiert med overdreven belastning eller enusunn livsstil åtte, kanskje ved å fremme tidlig celle aldring og død 9. På den annen side har enkelte studier funnet at det er ingen signifikant forskjell mellom telomerlengde og lang levetid og aldersrelatert 39 sykdom, 40, 41.

En av cellens iboende mekanismer av beskyttelse fra telomerer forkortes er ved å aktivere dens eget enzym telomerase revers transkriptase (tert). Dette enzymet og dens subenhet, telomerase RNA (TERC), en ikke-kodende RNA, bruker telomere som en mal for å legge telomere gjentar til kromosom ender 10. Selv telomeraseaktivitet er fraværende fra flere typer av celler og andre mekanismer som er involvert i telomerlengde vedlikehold, er økt telomeraseaktivitet korrelert med økt telomer-lengde. Telomerase aktivering er etablert som en av mekanismene ved hvilke celler reagerer på skade og stress og unngå for tidlig senescens og død. For eksempel lenger telomeres ble demonstrert i en populasjon av askenasiske jøder med eksepsjonell levetid 11, har mutasjoner i TERC eller tert vist seg å bidra til dødelig sykdom 12, og epigenetisk regulering av telomerase har vist seg å ha en effekt på aldersrelatert sykdom 13. Siden oppdaget, har telomerlengde blitt foreslått som en biomarkør for helsetilstanden i forskjellige dyremodeller, samt hos mennesker, men disse tidlige studiene var vanskelige å allment replikere fordi den metode som ble brukt var langtekkelig, lang og kostbar. I 2002 og videre innstilt i 2009 foreslo Cawthon og demonstrert en ny, nøyaktig, rask og enkel PCR-basert protokoll for å vurdere telomerlengde og videre undersøke dens rolle i ulike aspekter av cellebiologi, aldring og sykdom 19.

Velge riktig telomere målemetode for en studie er viktig. For tiden er det ulike metoder som brukes for å måle telomerlengde, hver med sin egenfordeler og ulemper. Tradisjonelt er telomerlengde målt ved hjelp av Southern blot-analyse av restriksjons-terminale fragmenter (TRFs), som omfatter: et. fordøye DNA med restriksjonsenzymer som ikke kutte i telomere gjentar for å få TRFs, f.. Southern blot av disse TRFs gjøres ved bestemmelse av den midlere TRF lengde ved hjelp av en sonde telomeric 14, 37.. Selv om denne metoden er meget nøyaktig med en liten variasjonskoeffisient, er et direkte mål, og kan være en fordel for lengdemåling fordeling, er TRF analyse kostbar, arbeidskrevende og krever minst 3 ug DNA. Denne metoden er også følsom for korte telomerer og lengde besluttsomhet kan bli gjort til skamme ved subtelomeric DNA, som kan oppdages ved sonden på grunn av (TTAGGG) n som sekvenser de inneholder 15, 42.

En annen svært nøyaktig metode å måle telomerlengde er Single Telomere Forlengelse Lengde Analysis (STELA), en single molekyl PCR-basert metode som bare krever en liten mengde DNA. I denne metoden, blir primere laget for å gjenkjenne den G-rike overheng ved enden av kromosomer og til å binde til et unikt subtelomeric sekvens på ett kromosom, som forsterker den telomere av en spesifikk kromosom. Den resulterende forsterkning er så visualisert ved Southern Blot. Denne metoden har fordelen av å være svært nøyaktig og er i stand til å gjenkjenne korte avvikende telomerer 16. Dessverre, siden ikke alle kromosomene har G-rike ender og en brukbar subtelomeric sekvens, kan telomerlengde bare måles på bestemte kromosomer og disse målingene kan ikke representere lengden på alle telomerer i cellen 15.

En annen metode som har vært praktisert er bruken av Peptide Nucleic Acid (PNA) prober for å detektere telomerlengde. Kvantitativ Florescence in situ hybridisering (Q-FISH) tillater oss å visualisere telomerer under metafasen, der staining av telomerer med en PNA sonde i forhold til deres størrelse tillater sammenligning av telomerer mellom spesifikke kromosomer. Selv om denne metoden kan også benyttes for celler i interfase, her den telomer-lengde for forskjellige kromosomer ikke kan avleses, noe som innfører en begrensning ved måling av telomer-lengde i senescent eller sjelden delende celler 17. Flow FISH bruker i stedet flowcytometri og er i dag den mest sensitive metoden for måling telomerlengde av blodceller i klinisk setting, men krever høyt kvalifiserte teknikere 18.

Foreløpig tar standard metode for å måle gjennomsnittlig telomere lengde i vårt laboratorium nytte av presisjon, følsomhet, og enkel kvantitativ real-time PCR. Denne metoden ble gjort mulig for måling telomerlengde ved utvikling av nye primere som unngår syntese av primer dimer avledede produkter, som ellers ville ha blitt produsert i såtandard analysen på grunn av den gjentatte natur av telomerer. For denne analyse er måling av telomer-lengde representert ved T / S-forhold, telomere gjentatt kopiering nummer til enkelt-kopi-genet nummer. Siden det er et direkte proporsjonalt forhold mellom det telomerlengde og antallet av merkede primere telomere binding til DNA under de innledende stadier av PCR, er T / S-forhold direkte proporsjonal med telomerlengde. T / S ratio måles ved å sammenligne forskjellen i Ct, krysser brøk syklus nummer der prøven er akkumulert florescence en terskel som er flere standardavvik over baseline florescence, mellom prøver med telomere primere og SCG primere 19. Denne metoden har blitt kritisert for indirekte måling av telomer-lengde, noe som kan føre til unøyaktige målinger, for eksempel, i tilfellet av kromosom duplikasjoner eller kopitall variasjoner 15. Dessuten er sammenligning mellom studier ofte difficult, men standard oligomers har blitt utviklet for å måle absolutte telomerlengde 20. Denne metoden ble fremmet forbedres ved Cawthon, ved hjelp av en monokrom multiplex qPCR analysen. I denne analyse ble den PCR drives ved lavere temperaturer for de første sykluser for å unngå primer-dimer binding og den telomere og kontroll-genet ble analysert i den samme PCR-røret for å unngå ytterligere feil. Den resulterende telomere lengdemålingene sterkt korrelert med telomere lengde målt ved Southern blot analyse av TRFs og hadde høyere nøyaktighet 15, 19, 36. For øyeblikket er QRT-PCR den eneste praktiske metoden tilgjengelig for testing store utvalgsstørrelser og krever bare en liten mengde DNA til å gjennomføre. En viktig del av denne metoden er omfattende kvalitetskontroll tiltak, slik at når det er gjort riktig, kan denne metoden gi verdifull komparativ informasjon om telomerlengde. I tillegg hadde denne metode blitt tilpasset for bruk som går ut leukocytter for å måletelomere lengde i en rekke forskjellige vev 42..

I tillegg, for videre å forstå biologi bak telomerlengde vedlikehold og interaksjoner mellom de to motsatte effekter (dvs. telomerer forkortes under replikasjonen og forlengelse av telomerase-enzym), ledsaget vi den telomerlengde-metoden med en ytterligere metode som måler telomeraseaktivitet.

For dette formålet, brukte vi en Telomeric Gjenta Amplification Protocol, en in vitro-analysen. Kort, lysert, bevares, enzymatisk aktive celler syntetisert telomeric gjentar på en oligonucleotide underlaget med telomerase, og produktene ble forsterket ved hjelp av PCR i nærvær av SYBR Grønn. Resultatene ble deretter analysert ved å sammenligne prøve og kontroll-Ct-terskelverdier. Siden telomerase er en varme-sensitive enzym, er en ekstra varmebehandlet kontroll kjøre sammen hver prøve 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Telomerlengde Protokoll 19

  1. DNA isolering

De fleste DNA isolering metoder kan benyttes. Vår Lab foretrekker Qiagen DNeasy Kit (# 69506) for blod kilder. Avhengig av kilden til DNA, for eksempel buccal eller andre kilder, kan en annen metode for isolering brukes.

  1. Grunning:

Alle primere er fortynnet til en konsentrasjon på lager 100pmoles/μl i PCR kvalitetsbestemt vann og lagret ved -20 ° C inntil behov. Working bestander av primere er laget og lagres ved 20 ° C for en kort periode (noen måneder.) Standard primere ble brukt for telomerer og β-globin, SCG, som beskrevet i O'Callaghan et al. 20. .

Primer sekvenser:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Merk: Grunning er fortynnet til en fungerende konsentrasjon av 10pmoles/μl, før du legger til reaksjon mix.

  1. Seriefortynning genomisk DNA:

Serielle fortynninger av genomisk DNA for Telo og Single Copy Gene (SCG) er opprettet for å generere en standard Ct verdi kurve for analysen. Det genomiske DNA som ble brukt var ekstrahert fra lymfocytter fra blodprøver. Disse fortynninger blir laget ved å fortynne DNA med PCR klasse H 2 0 til hver konsentrasjon med en faktor på 1,68 for å gi de to sett av seriefortynninger bruker samme genomiske DNA. Utgangspunktene konsentrasjoner har blitt optimalisert basert på prøving og feiling, og kan være nødvendig å justere når du bruker forskjellige reagenser, instrumenter, DNA fra andre arter, celletyper og SCG brukt.

Merk: Seriell fortynning ved hjelp av genomisk DNA blir laget ved å blande forsiktig og venter i minst 15 minutter til en time føre tar DNA for den neste fortynning. Hver fortynning krever tid for genomisk DNA for å distansere. For langtidsoppbevaring delmengde seriefortynning til PCR-strips for lagring ved -80 ° C. Hver PCR stripen er tint og brukt en gang for å unngå fryse tine sykler som kan skade DNA.

  1. Reaksjon oppsett for RT-PCR

Instrument som brukes: Roche480 Lett Cycler

Reagens: Roche Lett cycler SYBR-grønn

Fortynn test DNA-prøvene til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / mL. Vi tester konsentrasjonen ved hjelp NanoDrop eller Qubit. Vi ytterligere fortynne DNA fra 10ng/μl til endelig 5ng/μl. Vi tester ikke konsentrasjonen igjen.

Reaction komponenter:

TELO 1x SCG 1x
H 2 0 </ Td> 6 ul H20 6 ul
Telo 1 0.2 ul SCG 1 0.6 ul
Telo 2 1.8 ul SCG 2 1.4 ul
Rxn mix 10 pl Rxn mix 10 pl
DNA eller seriell fortynning 2 ul DNA eller seriell fortynning 2 ul

Merk: Master Mix fremstilles uten DNA og med et overskudd av 5% til 10%.

Både Telo og SCG kjøres samtidig på samme plate ved hjelp av følgende program. For å teste for presisjon, minst tre replikater av hver prøve og kontroll skal kjøres. Variasjoner i Primere som brukes kan påvirke resultatet. Vår protokollen har blitt optimalisert for å fungere slik på Roche480 Lett Cycler og våre primere.

Ibake til det grunnleggende denature
10 min denaturerer 95 ° C
Sykling
95 ° C 10 sek hold
60 ° C 5 sek hold
72 ° C 11 sek hold og enkelt oppkjøp
Gjenta 45-55 ganger som nødvendig

2. Kvantitativ telomerase Detection (QTD) Protocol (Basert på QTD Kit av Allied Biotech, Inc. Cat. No MT3012)

Pakk Forberedelse

  1. Pellet celler eller vev.
  2. Vask en gang med 1x PBS.
  3. Repellet og fjerne 1x PBS. *
  4. Resuspender cellepelleten i 200 ul av 1 x lysebuffer for hver 10 5 -10 6 celler eller 40-100 mg vev.
  5. Inkuber på is i 30 min.
  6. Spinn ned prøven ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C.
  7. Overfør 160 ul av supernatanten til et nytt rør, og bestemme proteinkonsentrasjonen.
  8. Delmengde og quick-fryse de resterende ekstrakt på tørris / etanol, oppbevar ved -80 ° C.

* I thans tilstand, er telomerase i frosne celler eller vev stabil i minst ett år. Når opptines for bruk, resuspender cellene umiddelbart i 1 x lysebuffer.

2.1. Analyseresultatene Controls

Termisk inaktivering kontroll: For hver prøve varme behandle en ytterligere kontroll-ekstrakt ved inkubering ved 85 ° C i 10 min før telomeraseaktivitet assay.

Standardkurve for TSR kontroll mal: Utfør Kvantitativ Real-Time PCR bruker fortynninger av TSR, en oligonucleotide med en lignende sekvens for å telomere primere som følger med settet for å generere en standard kurve.

  1. Forbered 01:05 serielle fortynninger av aksjen TSR konsentrasjon (0,5 amoles / mikroliter) med lysebuffer
  2. Utfør telomerase deteksjon standard assay ved å bruke 1 pl av hver fortynning TSR, inkludert lager konsentrasjon. Disse fortynninger kan lagres ved 4 ° C i minst 2 uker.

2.2. Telomerase aktivitet Assayhjelp QTD Real-Time PCR

  1. For hver prøve, legg følgende til en PCR rør eller tynn vegg PCR plate (totalt volum 25,0 mL):
    • 12,5 pl 2 x QTD Premix
    • 1,0 ul celle-eller vevekstrakt
    • 11,5 mL av PCR Kvalifisert Water
  2. Bland grundig
  3. Program Real-Time PCR Detection Systems ifølge den under programmet:
    - 25 ° C i 20 min (telomerase reaksjon)
    - 95 ° C i 10 min (PCR innledende aktiveringstrinn)
    35-40 sykluser av:
    - 95 ° C i 30 sekunder (denaturering)
    - 60 ° C i 30 sek (annealing)
    - 72 ° C i 30 sek (forlengelse)
  4. Plasser PCR-rør i termosykleren og start sykkel program.
  5. Samle terskelen sykle eller C T verdi etter sykluser finish. Terskelen syklus er syklusen ved hvilken en statistisk signifikant økning av ΔRn det registreres.

2.3. Data Analysis

  1. Generatea standard kurve ved hjelp av C T opplesninger og sammenligne telomerase aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på et telomerlengde QRT-PCR-analyse er vist i figur 1.. På venstre panel, prøver merket i rødt og grønt representerer plasseringen av de testede fagene på 96-brønners plate. På den øvre høyre panelet er amplifikasjonskurve demonstrert. Hvert motiv er testet av to analysene (Telomere og Single Copy Gene), som er gjort i triplicates. På grunn av forskjellige DNA-kopi tall som produseres i de to analyser av utvalgte individer, når antallet av sykluser inntil florescence deteksjon dens eksponentiell kurve varierer mellom assayer. I høyere Kopier nummer rør (dvs. Telomere analyse), når mengden av fluorescensdeteksjon sin eksponensiell kurve etter 27 sykluser. Det andre settet med linjer representerer én kopi Gene (SCG) som bare har ett eksemplar i genomet, og dermed har mye mindre eksemplarer enn de telomere prøver og når sitt eksponensiell kurve bare etter 31 sykluser. Den brune linjer representerer standardkurve som er basert på en seriell fortynning kjente eksempler konsentrasjoner. Den nederste høyre panel representerer log-konsentrasjon av standardkurven punkter (en rett linje viser en optimal seriell fortynning). Denne lineære kurve blir brukt til å beregne konsentrasjonen av de testede rør (venstre panel). De QRT-PCR-resultater, i første omgang i Cawthon hender 19, og gjentatt av oss og andre, har blitt vist å være korrelert med de som oppnås ved terminalen begrensning fragment lengde analysen. En T / S ratio enhet (QRT-PCR-sykluser av telomere kjøre løpet QRT-PCR-sykluser av SCG run) tilsvarer en gjennomsnittlig telomere lengde på 4270 bp i leukocytter 42. Dele QRT-PCR-sykluser for Telomere analysen av SCG analysen i vårt eksempel resultert i et forhold på 0,87, noe som tilsvarer et gjennomsnitt på 3715 bp. Denne målingen består av telomerlengde alene og inkluderer ikke subtelomeric regioner.

Den QRT-PCR demonstrert her involvert svært lite prøveopparbeidelse. I dette eksempelet (figur 1), ble det kvalitative og kvantitative forskjeller (representert ved seriefortynning og samsvarsfilen mellom triplicates) observert mellom de to analyser. Resultatene beregnet ut fra denne testen viser mellomliggende telomere lengde for en 65 år gammel gjenstand.

Et eksempel på telomeraseaktivitet analyseresultatene og den mulig sammenheng mellom telomeraseaktivitet og telomerlengde er demonstrert av figur 2. Våre foreløpige resultater viser at en lengre telomerlengde kan være assosiert med øket telomeraseaktivitet.

Figur 1
Figur 1.. Figur 1 representerer en vanlig utgang fra aqRT-PCR-analyse for Telomere lengde. Det øvre venstre hjørne viser prøvene arrangert i en 96-brønns plate, in triplo. Den nedre venstre hjørne viser de beregnede konsentrasjoner og Ct-verdiene for hver prøve, som blir brukt til å beregne T / S-verdier. Den øvre høyre er en graf av amplifikasjonskurve (antall sykluser versus florescence detekteres fra CYBR grønt), brukt for å visualisere resultatene. Nederst til høyre, er standard kurve for loggen konsentrasjon versus CT verdien av seriefortynning kontroll grafisk. En rett linje bekrefter at seriefortynning ble nøyaktig målt og lastet. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Ved hjelp av foreløpige resultater fra QRT-PCR-analyse for telomerase aktivitet og telomerase lengde, <sterk> Fig. 2 viser en direkte, signifikant sammenheng (p = 0,008) mellom telomerlengde, målt ved T / S-forhold, og telomerase-aktivitet, målt ved Ct-verdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Telomerlengde gir en unik mobilnettet markør for å studere stresset og aldrende celle og gir innsikt i mekanismene for aldring. Siden sin rolle i aldring først hadde blitt foreslått, har en rekke studier er gjort om telomerlengde til alder, lang levetid, aldersrelaterte sykdommer, kreft, og stress. I flere tiår var gullstandarden av telomere lengdemålingene terminal begrensning fragment analyse ved hjelp av Southern hybridisering. Men nylig en rimelig, rask og enkel å utføre metoden ved Cawthon har utviklet seg. Ved hjelp av Kvantitativ Real-Time PCR, tilbød Cawthon et nyttig alternativ til å måle telomerlengde, noe som gjør studier for store utvalgsstørrelser mulig.

Ved hjelp QRT-PCR, har mange studier er gjort for å undersøke forholdet mellom telomere lengde og en rekke utfall, spesielt aldersrelaterte sykdommer. Mer spesielt har denne metode tillates forskere til å utføre store epidemiologiske studør på bestander som demonstrerer eller avkrefte en sammenheng mellom telomere lengde og en rekke sykdommer. For å nevne noen, iskemisk hjertesykdom 7, Alzheimers sykdom 22, osteocarcoma hos kvinner 23, lungekreft blant røykere 24, familiær tyreoideakreft 25, har fem diabetes, blodtrykk 26, aldring 27 og 28 demens blitt korrelert med kortere telomerlengde , mens aldersrelatert makuladegenerasjon 7, tykktarmskreft 43, og død av smittsom sykdom, kreft, hjerte-eller cerebrovaskulær sykdom 44 har vist seg å ha noen signifikant sammenheng med telomerlengde. I tillegg er visse påkjenninger vist seg å falle sammen med kortere telomerlengde, for eksempel en økt mengde av inflammatoriske markører, TNF-α og IL-6, er blitt korrelert med kortere telomere lengder i 29 leukocytter. Også stressende LIFestyles grunn av tidkrevende arbeid tidsplaner, skiftarbeid, eller innholdet i arbeidet, særlig en vaktmester posisjon for et kronisk sykt barn, har blitt assosiert med forskjeller i telomerlengde. Dette tyder på at stress kan føre til tidlig aldring i form av telomerer forkortes uten tilstrekkelig utvinning 30, 31. I en fersk undersøkelse, er å ha færre sosiale relasjoner også assosiert med kortere telomerer 32. Forebygging av telomerlengde matfettet er også blitt vist å korrelere med sunt liv valg, for eksempel å ta en daglig multivitamin og ikke røyking 24, 33. I tillegg avslørte disse studiene mulige kliniske bruksområder for måling telomerer, for eksempel, som en ikke-invasiv screening test for mulig utvikling av skrumplever 34. I andre tilfeller der lignende studier har vist noen signifikant korrelasjon (eller en beskjeden korrelasjon) mellom en sykdom og telomerlengde har forskerne blitt oppfordret til å stUdy andre nye mekanismer for cellulær nedgang og den syke tilstand 7.

Disse studiene har styrke i antall, og har vist nytten av å måle telomerlengde som en av de første trinnene i å tyde den aldrende prosessen. Cawthon sin QRT-PCR-metoden var nyttig for dette formål, fordi det kan sammenligne et stort antall mennesker, krever minimal DNA, og kan gi pålitelig bevis mot et forhold mellom telomerlengde og celle helse. Disse studiene bidra til å styre fremtidige aldring forskningsinnsatsen til visse gener, vev og cellulære prosesser.

Uunngåelig, etter en betydelig forskjell i telomerlengde er kjent, er en forklaring spørres. Til svar på disse spørsmålene, studier på telomerase, har enzymet involvert i telomere vedlikehold og regulering, er etablert. PCR baserte telomerase aktivitet protokoller har blitt tilbudt, noe som gir ytterligere informasjon mot: en. bestemme fortsributions av nedbrytning av telomerer, og b. svikt i vellykket telomerlengde vedlikehold av telomerase, og dermed gi et nytt kapittel til historien om aldring som en helhet, spesielt celle senescence.

Selv QRT-PCR oppdager gjennomsnittlig telomere lengde, og ikke på individuell kromosom basis, er denne metoden et kraftig verktøy for bevis mot hvordan cellen reagerer på aldring og stress og gir en innledning til historien om hvordan vi eldes. Interessant nok har denne informasjonen allerede ført til telomerlengde måling i klinikken for å estimere biologiske alder og vil videreutvikle vår forståelse av aldringsprosessen og uunngåelig føre til forebygging eller forsinkelse og screening av aldring og aldersrelaterte sykdommer.

Navnet på reagens Selskapet Katalognummer
Kvantitativ telomerase Detection Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Grønn I Master, klar til bruk hot start reaksjon mix for SYBR Grønn I-basert real-time PCR med LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantitative Telomerase Detection Allied Biotech MT3012
Qiagen DNeasy Kit Qiagen 69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
  2. Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
  3. Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
  4. Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
  5. Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
  6. Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
  7. Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
  8. Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
  9. Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , In Press (2012).
  10. Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
  11. Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
  12. Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
  13. Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
  14. Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  15. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  16. Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
  17. O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
  18. Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
  20. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
  21. Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
  22. Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
  23. Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
  24. Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
  25. Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
  26. Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
  27. Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
  28. Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
  29. O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
  30. Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
  31. Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
  32. Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. , In Press (2012).
  33. Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
  34. Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , In Press (2012).
  35. Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , In Press (2012).
  36. Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
  37. Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
  38. Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
  39. Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
  40. Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
  41. Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
  42. Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
  43. Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
  44. Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).

Tags

Genetikk molekylærbiologi cellebiologi medisin Biomedical Engineering Genomics Telomere lengde telomerase aktivitet telomerase telomerer telomere DNA PCR polymerase chain reaction QRT-PCR sekvensering aldring telomerase analysen
Telomere Lengde og telomerase aktivitet; En Yin og Yang av Cell Senescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, … More

Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence. J. Vis. Exp. (75), e50246, doi:10.3791/50246 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter