Summary
يوصف أسلوبا دقيقا، قصيرة ومتطورة ورخيصة أن يقيم طول التيلومير في الأنسجة والأنواع باستخدام QRT-PCR متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.
Abstract
التيلوميرات يتم تكرار تسلسل الحمض النووي في الطرف ينتهي من الكروموسومات التي هي متنوعة في الطول والبشر يمكن أن تصل إلى طول 15،000 أزواج قاعدة. التيلومير بمثابة آلية السلامة البيولوجية الاستنزاف كروموسوم في كل انقسام الخلايا. في مدة معينة، تصبح التيلوميرات قصيرة جدا للسماح النسخ المتماثل، وهي العملية التي قد تؤدي إلى عدم الاستقرار كروموسوم أو موت الخلية. وينظم طول التيلومير من قبل اثنين من آليات معارضة: الاستنزاف واستطالة. يحدث الاستنزاف كما يقسم كل خلية. في المقابل، هو استطالة التضمين جزئيا من قبل التيلوميراز الانزيم، الذي يضيف تسلسل تكرار لنهايات الكروموسومات. في هذه الطريقة، يمكن تيلوميراز ربما عكس آلية الشيخوخة ويجدد بقاء الخلية. وهذه هي عناصر حاسمة في الحفاظ على حياة الخلية وتستخدم لتقييم الشيخوخة الخلوية. في هذه المخطوطة سنقوم بشرح طريقة دقيقة، قصيرة ومتطورة ورخيصة لتقييم طول التيلومير في أنسجة متعددةق والأنواع. هذا الأسلوب يستفيد من عنصرين رئيسيين، وتكرار جنبا إلى جنب من تسلسل التيلومير وحساسية QRT-PCR للكشف عن أرقام نسخة التفاضلية للعينات التي تم اختبارها. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.
Introduction
التيلوميرات يتم تكرار الحمض النووي مسدوس (TTAGGG) متواليات وجدت في نهايات الكروموسومات. في كل النسخ المتماثل الخلية، يتم تقصير هذه الغايات كروموسوم. إذا أصبحت قصيرة جدا، يمكن الخضوع لاندماج الكروموسومات التيلومير نهاية، إعادة التركيب الشاذة، وتدهور. وهكذا يكفي صيانة طول التيلومير تلعب دورا رئيسيا في استقرار كروموسوم وحماية الخلية 38. صيانة طول التيلومير هو أيضا حاسمة لجينات عثر عليها بالقرب من نهايات الكروموسومات، منذ تكرار الحمض النووي لا يمكن أن يستمر إلى نهاية جدا من الكروموسومات 1-2. ونتيجة لذلك، قد منع تقصير التيلومير تحسين الاستقرار الخلية.
وأفادت العديد من الدراسات أن طول التيلومير ويرتبط مع طول العمر للكائن والدولة المريضة، كما هو الحال في سرطان 3-4، مرض السكري 5، وأمراض القلب والأوعية الدموية 6،7. بالإضافة إلى ذلك، وقد ارتبطت التيلوميرات تقصر مع الإجهاد المفرط أونمط الحياة غير الصحي 8، ربما عن طريق تعزيز الشيخوخة المبكرة للخلايا وفاة 9. من ناحية أخرى، وقد وجدت بعض الدراسات أنه لا يوجد اختلاف كبير بين طول التيلومير وطول العمر والسن الأمراض ذات الصلة 39، 40، 41.
واحدة من الآليات الفطرية للخلية حماية من تقصير التيلومير هو عن طريق تفعيل الإنزيم تيلوميراز الخاصة الناسخ العكسي (TERT). هذا الانزيم والوحيدات لها، التيلوميراز الحمض النووي الريبي (TERC)، وهو الحمض النووي الريبي غير الترميز، استخدم التيلومير كقالب لإضافة يكرر التيلومير إلى كروموسوم ينتهي 10. على الرغم من أن النشاط تيلوميراز غائب من عدة أنواع من الخلايا وغيرها من الآليات التي تشارك في صيانة طول التيلومير، ويرتبط زيادة النشاط تيلوميراز مع زيادة طول التيلومير. وقد أنشئت تفعيل تيلوميراز باعتبارها واحدة من الآليات التي تستجيب الخلايا للتلف والتوتر وتجنب الشيخوخة المبكرة والموت. على سبيل المثال، تعد الشركة المصرية للاتصالاتوقد أثبتت lomeres في عدد سكانها اليهود الأشكناز مع استثنائية العمر 11، وقد تبين أن الطفرات في TERC أو TERT لتساهم في الإصابة بأمراض مميتة 12، وتنظيم جينية من تيلوميراز وقد تبين أن يكون لها تأثير على الأمراض ذات الصلة سن ال 13. منذ اكتشافه، وقد اقترح طول التيلومير والعلامات البيولوجية للحالة الصحية في مختلف النماذج الحيوانية، وكذلك في البشر، ولكن هذه الدراسات في وقت مبكر الصعب تكرار على نطاق واسع بسبب الطريقة المستخدمة كانت شاقة وطويلة ومكلفة. في عام 2002 ومواصلة ضبطها في عام 2009، اقترح Cawthon وأظهرت ودقيقة بروتوكول جديد وسريع وبسيط PCR مقرها لتقييم طول التيلومير ومواصلة التحقيق دورها في مختلف جوانب بيولوجيا الخلية، والشيخوخة والمرض 19.
اختيار طريقة القياس الصحيح التيلومير لدراسة أمر ضروري. حاليا، هناك العديد من الأساليب المستخدمة لقياس طول التيلومير، كل مع تلقاء نفسهامزايا وعيوب. تقليديا، يتم قياس طول التيلومير باستخدام تحليل لطخة الجنوبية من شظايا تقييد محطة (TRFs)، الذي ينطوي على: أ. هضم الحمض النووي مع إنزيمات التقييد أن لا قطع في تكرار التيلومير من أجل الحصول على TRFs، ب. ويتم ذلك وصمة عار الجنوبي من هذه TRFs عن طريق تحديد طول TRF يعني باستخدام مسبار telomeric 14، 37. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو درجة عالية من الدقة مع معامل صغيرة من الاختلاف، هو مقياس مباشر، ويمكن أن تكون مفيدة لقياس توزيع طول، تحليل TRF هو أمر مكلف، ويتطلب عمالة كثيفة لا يقل عن 3 ميكروغرام من الحمض النووي. هذا الأسلوب هو أيضا حساسة للالتيلوميرات قصيرة والتصميم يمكن أن يكون طول مرتبك بواسطة الحمض النووي subtelomeric، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة لجنة التحقيق بسبب هذا (TTAGGG) ن مثل متواليات أنها تحتوي على 15، 42.
آخر طريقة دقيقة للغاية في قياس طول التيلومير واحد التيلومير الاستطالة تحليل طول (STELA)، وهو سينغله جزيء PCR الأسلوب على أساس أن يتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي. في هذه الطريقة، يتم إجراء الاشعال الاعتراف عبء G الغنية في نهاية الصبغيات (الكروموسومات) وربط تسلسل subtelomeric فريدة من نوعها على كروموسوم واحد، مما يزيد من التيلومير كروموسوم معين. التضخيم الناتج ثم تصور من قبل جنوب لطخة. هذا الأسلوب له ميزة كونها دقيقة للغاية وغير قادرة على الكشف التيلوميرات قصيرة النموذجية 16. للأسف، منذ ليس كل الكروموسومات يكون إنتهاء G الغنية وتسلسل subtelomeric صالحة للاستعمال، لا يمكن إلا أن يقاس طول التيلومير على الكروموسومات محددة، وربما لا تمثل هذه القياسات طول التيلوميرات في كل خلية 15.
طريقة أخرى التي مورست هو استخدام حمض النووي الببتيد (PNA) تحقيقات للكشف عن طول التيلومير. التنوير الكمي في الموقع التهجين (Q-FISH) يتيح لنا أن تصور التيلوميرات خلال الطورية، حيث القديسaining من التيلوميرات مع التحقيق الذي تجريه السلطة الوطنية الفلسطينية بما يتناسب مع حجمها يسمح للمقارنة بين التيلوميرات الكروموسومات محددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا للخلايا في الطور البيني، وهنا طول التيلومير لالكروموسومات واضحة لا يمكن الكشف، الأمر الذي يضفي وجود قيود عند قياس طول التيلومير في خلايا هرمة أو تقسيم نادرا 17. FISH تدفق بدلا من ذلك يستخدم التدفق الخلوي ويشغل حاليا منصب الأسلوب الأكثر حساسية لقياس طول التيلومير من خلايا الدم في إعداد سريرية، ولكن يتطلب الفنيين ذوي المهارات العالية 18.
حاليا، الطريقة المعيارية لقياس متوسط طول التيلومير في المختبر لدينا يستفيد من الدقة والحساسية، وسهولة الكمية في الوقت الحقيقي PCR. وقدم هذه الطريقة ممكنة لقياس طول التيلومير من خلال تطوير الاشعال الرواية التي تجنب تركيب التمهيدي المنتجات ديمر المشتقة، والتي كانت على خلاف ذلك كما تم إنتاجها فيمقايسة نظرا لطبيعة تكرار التيلوميرات tandard. لهذا الاختبار، يتم تمثيل قياس طول التيلومير من قبل T / S نسبة، التيلومير في عدد النسخ تكرار لعدد الجينات نسخة واحدة. لأنه ليس هناك علاقة طردية مباشرة بين طول التيلومير وعدد من المشارع التيلومير المسمى ملزم على الحمض النووي خلال المراحل الأولى من PCR، نسبة T / S يتناسب طرديا مع طول التيلومير. يتم قياس نسبة T / S بمقارنة الفرق في التصوير المقطعي، وعدد دورة كسري الذي المتراكم العينة الإزهار يعبر عتبة هذا هو عدة انحرافات معيارية فوق الإزهار خط الأساس، بين العينات مع الاشعال التيلومير وSCG الاشعال 19. وقد انتقدت هذه الطريقة لقياس غير المباشرة من طول شريط الحامض النووي، الذي يمكن أن يؤدي إلى قياسات غير دقيقة، على سبيل المثال، في حالة من الازدواجية كروموسوم أو الاختلافات في عدد النسخ 15. أيضا، المقارنة بين الدراسات في كثير من الأحيان ديوقد وضعت fficult، ولكن معيار الأوليغومرات لقياس طول التيلومير المطلقة 20. وقد تم تعزيز هذه الطريقة تحسن عليها Cawthon، وذلك باستخدام أحادية اللون متعددة مقايسة QPCR. في هذا الاختبار، تم تشغيل PCR في درجات حرارة منخفضة للدورات القليلة الأولى لتجنب ملزم التمهيدي-ديمر وتم تحليل التيلومير والتحكم الجيني في نفس أنبوب PCR لمزيد من تجنب الخطأ. الناتجة قياسات طول التيلومير مرتبطة ارتباطا قويا مع طول التيلومير تقاس تحليل لطخة الجنوبية من TRFs وكان أعلى دقة 15 و 19 و 36. في هذه اللحظة، QRT-PCR هو الأسلوب الوحيد المتاح مريحة لاختبار أحجام عينة كبيرة ويتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي للقيام بها. جزء حاسم من هذا الأسلوب هو اتخاذ تدابير شاملة لمراقبة الجودة، بحيث عندما يكون القيام به بشكل صحيح، وهذه الطريقة يمكن أن توفر معلومات مقارنة قيمة عن طول التيلومير. بالإضافة إلى ذلك، قد تم تكييف هذه الطريقة للاستخدام خارج الكريات البيض لقياس طول التيلومير في مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة 42.
بالإضافة إلى ذلك، من أجل مزيد من فهم البيولوجيا وراء صيانة طول التيلومير والتفاعلات بين اثنين من آثار معارضة (أي تقصير التيلومير أثناء النسخ المتماثل واستطالة بواسطة انزيم تيلوميراز)، ونحن رافق طريقة طول التيلومير مع فحص إضافي الذي يقيس النشاط تيلوميراز.
لهذا الغرض، استخدمنا Telomeric بروتوكول التضخيم كرر، وهو فحص في المختبر. لفترة وجيزة، هي lysed، والحفاظ عليها، وخلايا نشطة إنزيمي توليفها يكرر telomeric على ركيزة قليل النوكليوتيد باستخدام تيلوميراز، وتم تضخيم PCR المنتجات التي تستخدم في وجود SYBR الأخضر. ثم تم تحليل النتائج من خلال مقارنة العينة وسيطرة القيم عتبة ط. منذ تيلوميراز هو انزيم حساسة للحرارة، يتم تشغيل حرارة إضافية تعامل التحكم جنبا إلى جنب مع كل عينة 21.
هناك حاجة إلى "jove_content"> بينما قياس طول التيلومير يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الدور الذي يمكن أن طول التيلومير في الفيزيولوجيا المرضية من الشيخوخة والمرض، وطول التيلومير هو ليس خاصية ثابتة ومزيد من المعلومات لفهم وظيفة التيلومير. يمكن أن دراسات النشاط تيلوميراز إضافة معلومات حول آليات تنظيم طول التيلومير. على سبيل المثال، يمكن تفعيل رقابة من تيلوميراز الحفاظ على طول التيلومير وتكاثر الخلايا، ولكن التنشيط غير المنضبط للتيلوميراز يمكن أن يؤدي إلى السرطان. هذه الأساليب إلى الأمام مباشرة وغير مكلفة والجمع بين اثنين وفرت لنا ليس فقط مع أدلة أقوى نحو علاقة بين طول التيلومير والاستقرار الخلية، ولكن أيضا مزيد من التبصر في الآليات الممكنة من تقصير التيلومير والانتعاش. مع هذه الأساليب ونأمل في مزيد من توضيح استجابة الخلية إلى الشيخوخة ومختلف الدول من انتشار الخلايا مع الهدف النهائي المتمثل في التوصل إلى فهم أفضل للوسط mechanisMS بيولوجيا الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التيلومير بروتوكول طول 19
- عزل الحمض النووي
يمكن استخدام معظم وسائل عزل الحمض النووي. مختبرنا يفضل QIAGEN DNeasy كيت (# 69506) عن مصادر في الدم. اعتمادا على مصدر من الحمض النووي، مثل مصادر الشدق أو غيرها، ويمكن استخدام طريقة العزل المختلفة.
- الاشعال:
مخففة جميع الاشعال إلى تركيز الأسهم من 100pmoles/μl في PCR المياه الصف وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة. مصنوعة مخزونات عمل الاشعال الطازجة ويتم تخزينها عند 20 درجة مئوية لفترة قصيرة من الوقت (بضعة أشهر). استخدمت الاشعال القياسية لالتيلوميرات وβ غلوبين، وSCG، كما هو موضح في أوكاالهان وآخرون. 20 .
تسلسل التمهيدي:
TELO 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '
TELO 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '
ملاحظة: يتم تخفيفه الاشعال إلى تركيز العمل من 10pmoles/μl، قبل إضافة إلى مزيج التفاعل.
- التخفيف المسلسل من الحمض النووي الجيني:
يتم إنشاء التخفيفات المسلسل من الحمض النووي الجيني لTELO واحدة نسخ الجينات (SCG) لإنشاء منحنى قيمة ط م القياسية للمقايسة. تم استخراج الحمض النووي الجيني المستخدمة من الخلايا الليمفاوية من عينات الدم. يتم إنشاء هذه التخفيفات عن طريق تمييع DNA PCR مع الصف H 2 0 إلى كل تركيز من قبل عامل من 1.68 إلى تسفر عن مجموعتين من التخفيفات المتسلسلة باستخدام نفس الحمض النووي الجيني. وقد تم تحسين تركيزات بدءا يعتمد على التجربة والخطأ، وربما تحتاج إلى تعديل عند استخدام الكواشف المختلفة، والصكوك، الحمض النووي من الأنواع الأخرى، أنواع الخلايا، وSCG المستخدمة.
ملاحظة: يتم إجراء التخفيف المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني عن طريق خلط بلطف والانتظار على الأقل 15 دقيقة إلى ساعة واحدة befoإعادة أخذ الحمض النووي لتخفيف المقبل. كل تخفيف يتطلب وقتا لفصل الحمض النووي الجيني ل. للتخزين، قسامة التخفيفات المتسلسلة على المدى الطويل إلى شرائح PCR للتخزين في -80 درجة مئوية. يتم إذابة كل قطاع PCR وتستخدم مرة واحدة لتجنب ذوبان تجميد دورات التي قد تؤدي إلى تلف الحمض النووي.
- إعداد رد فعل لRT-PCR
الأداة المستخدمة: Roche480 ضوء Cycler
الكاشف: روش ضوء cycler SYBR الخضراء
تمييع عينات من الحمض النووي اختبار لتركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر. نحن اختبار تركيز باستخدام معمل NanoDrop أو و qubit. نحن تمييع مزيد من الحمض النووي من 10ng/μl إلى 5ng/μl النهائي. نحن لا اختبار تركيز مرة أخرى.
مكونات التفاعل:
| TELO | 1X | SCG | 1X | |
| H 2 0 </ TD> | 6 ميكرولتر | H20 | 6 ميكرولتر | |
| TELO 1 | 0.2 ميكرولتر | SCG 1 | 0.6 ميكرولتر | |
| TELO 2 | 1.8 ميكرولتر | SCG 2 | 1.4 ميكرولتر | |
| RXN مزيج | 10 ميكرولتر | RXN مزيج | 10 ميكرولتر | |
| الحمض النووي أو التخفيف المتسلسل | 2 ميكرولتر | الحمض النووي أو التخفيف المتسلسل | 2 ميكرولتر |
ملاحظة: يرصد ماستر مزيج من دون الحمض النووي ومع وجود فائض من 5٪ إلى 10٪.
يتم تشغيل كلا TELO وSCG معا على نفس لوحة باستخدام البرنامج التالي. لاختبار دقة، على الأقل ثلاث مكررات من كل عينة ويجب تشغيل التحكم. الاختلافات في الاشعال المستخدمة قد يؤثر على النتائج. وقد تم تحسين بروتوكول لدينا للعمل على النحو التالي على Roche480 ضوء Cycler والاشعال لدينا.
فيتفسد itial
10 دقيقة تفسد 95 ° C
ركوب الدراجات
95 ° C 10 عقد ثوانى
60 ° C 5 ثوانى الانتظار
72 ° C 11 ثوانى الانتظار واقتناء واحد
تكرار 45-55 مرات كما هو مطلوب
2. كشف تيلوميراز الكمي (QTD) بروتوكول (بناء على عدة QTD من قبل الحلفاء في مجال التكنولوجيا الحيوية، وشركة كات. رقم MT3012)
استخراج التحضير
- بيليه الخلايا أو الأنسجة.
- يغسل مرة واحدة مع 1X PBS.
- Repellet وإزالة 1X PBS. *
- Resuspend وبيليه الخلية في 200 ميكرولتر من 1 × الاحتياطي تحلل لكل 10 5 -10 6 خلايا أو 40-100 ملغ من الأنسجة.
- احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- تدور باستمرار العينة في 12،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل 160 ميكرولتر من طاف في أنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين.
- قسامة وسريعة تجميد استخراج المتبقية على الثلج الجاف / الإيثانول، مخزن في -80 درجة مئوية.
* في رحالته، تيلوميراز في الخلايا أو الأنسجة المجمدة ثابت لمدة سنة على الأقل. عندما إذابة للاستخدام، resuspend الخلايا مباشرة في 1 × الاحتياطي تحلل.
2.1. تحكم مقايسة
التحكم تعطيل الحرارة: لكل عينة، تسخين علاج مستخرج تحكم إضافية التي يحتضنها في 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل تيلوميراز فحص النشاط.
منحنى القياسية لقالب التحكم TSR: إجراء الكمي في الوقت الحقيقي PCR باستخدام التخفيفات من TSR، وهو قليل النوكليوتيد مع تسلسل مماثلة لالاشعال التيلومير المتضمنة عدة لتوليد منحنى القياسية.
- إعداد 1:05 التخفيفات التسلسلي للتركيز TSR الأسهم (0.5 amoles / ميكرولتر) مع العازلة تحلل
- إجراء كشف فحص مستوى تيلوميراز باستخدام 1 ميكرولتر من كل تخفيف TSR، بما في ذلك تركيز الأسهم. ويمكن تخزين هذه التخفيفات في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع على الأقل.
2.2. تيلوميراز نشاط الفحصباستخدام QTD في الوقت الحقيقي PCR
- لكل عينة، إضافة ما يلي إلى أنبوب PCR أو رقيقة الجدار لوحة PCR (إجمالي حجم 25.0 ميكرولتر):
- 12.5 ميكرولتر من 2 بريمكس QTD X
- 1.0 ميكرولتر من الخلايا أو الأنسجة استخراج
- 11.5 ميكرولتر من PCR المياه مؤهل
- تخلط جيدا
- برنامج في الوقت الحقيقي أنظمة كشف PCR وفقا للبرنامج التالي:
- 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (رد فعل تيلوميراز)
- 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (PCR خطوة التنشيط الأولي)
35-40 دورات:
- 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (تمسخ)
- 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (الصلب)
- 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (ملحق) - وضع أنابيب PCR في cycler الحرارية وبدء برنامج ركوب الدراجات.
- جمع دورة عتبة أو C T قيمة بعد الانتهاء من الدورات. دورة عتبة هو دورة في التي تم الكشف عنها زيادة ذات دلالة إحصائية من ΔRn الأول.
2.3. تحليل البيانات
- Generatعصام منحنى قياسي باستخدام T قراءات C والمقارنة النشاط تيلوميراز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مثال على طول التيلومير QRT-PCR مقايسة في الشكل 1. على لوحة أعلى اليسار، وعينات صفت باللون الأحمر والأخضر يمثل الموقع من الموضوعات اختبارها على لوحة 96 جيدا. على لوحة أعلى اليمين، ويتجلى منحنى التضخيم. يتم اختبار كل مادة من قبل اثنين من المقايسات (التيلومير واحدة نسخ الجينات)، والتي تتم في ثلاث مكرارت. نتيجة لإختلاف الأرقام نسخة الحمض النووي ينتج في اثنين من المقايسات من أفراد مختارين، وعدد من دورات حتى كشف الإزهار يصل يختلف منحنى الأسي بين المقايسات. في أعلى أنابيب في عدد النسخ (أي التيلومير مقايسة)، وكمية من الكشف عن مضان يصل منحنى أسي لها بعد 27 دورات. المجموعة الثانية من خطوط تمثل نسخة جين واحد (SCG) الذي يحتوي على نسخة واحدة فقط في الجينوم، وبالتالي لديه نسخ أقل بكثير من العينات التيلومير ويصل منحنى أسي إلا بعد 31 دورات. خطوط البني تمثل المعيارمنحنى يستند على التخفيف المتسلسل من تركيزات عينة معروفة. تمثل اللوحة اليمنى أسفل تركيز سجل من نقطة منحنى القياسية (يوضح خط مستقيم على التخفيف المتسلسل الأمثل). يتم استخدام هذا المنحنى الخطي لحساب تركيز أنابيب اختبار (لوحة أسفل اليسار). النتائج QRT-PCR، في البداية في أيدي Cawthon في 19، وكرر من قبلنا وغيرها، وقد ثبت أن تكون مرتبطة مع تلك التي تم الحصول عليها من قبل محطة تقييد جزء طول الفحص. واحد T / S وحدة نسبة (دورات QRT-PCR من المدى التيلومير خلال دورات QRT-PCR من المدى SCG) ما يعادل طول التيلومير يعني من 4،270 شركة بريتيش بتروليوم في الكريات البيض 42. تقسيم دورات QRT-PCR لفحص التيلومير بواسطة الفحص SCG في مثالنا أدى إلى نسبة 0.87، وهو ما يعادل في المتوسط 3،715 BP. يتكون هذا المقياس من طول التيلومير وحدها ولا يشمل المناطق subtelomeric.
و-PC QRTR تظاهر هنا تشارك إعداد عينة صغيرة جدا. في هذا المثال (الشكل 1)، وقد لوحظت اختلافات نوعية، فضلا عن كمية (ممثلة في التخفيف المتسلسل ومدى التطابق بين ثلاث مكرارت) بين اثنين من المقايسات. النتائج المحسوبة من هذا الاختبار تظهر طول التيلومير وسيطة لموضوع قديم 65 سنة.
ويتجلى مثال آخر تيلوميراز نتائج الفحص والعلاقة الممكنة بين النشاط تيلوميراز وطول التيلومير في الشكل 2. تظهر نتائجنا الأولية أن طول أطول التيلومير قد تترافق مع زيادة النشاط تيلوميراز.
الشكل 1. يمثل الشكل 1 إخراج نموذجية من عبد القديرRT-PCR مقايسة لطول التيلومير. يظهر في الزاوية اليسرى العليا العينات مرتبة في لوحة 96 جيدا، في ثلاث نسخ. الزاوية اليسرى السفلى يسرد تركيزات محسوب والقيم CT لكل عينة، والتي تستخدم لحساب القيم T / S. الجزء العلوي الأيمن هو الرسم البياني لمنحنى التضخيم (عدد الدورات مقابل الكشف عن الإزهار من CYBR الأخضر)، وتستخدم لتصور النتائج. على اليمين أسفل، ورسوم بيانية منحنى القياسية للتركيز دخول مقابل قيمة CT من السيطرة التخفيف المتسلسل. خط مستقيم يؤكد أن تخفيف المسلسل تم قياسها بدقة وتحميلها. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. باستخدام النتائج الأولية للفحص QRT-PCR للنشاط التيلوميراز وطول تيلوميراز، <يظهر STRONG> الشكل 2، علاقة مباشرة معنوية (P = 0.008) بين طول التيلومير، وتقاس عن طريق T / S نسبة، والنشاط تيلوميراز، تقاس قيمة ط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر طول التيلومير علامة الخلوية فريدة لدراسة الخلية وشدد والشيخوخة، ويقدم نظرة ثاقبة لآليات الشيخوخة. منذ دورها في الشيخوخة قد اقترح أولا، وقد تم القيام به العديد من الدراسات المتعلقة طول التيلومير إلى العمر، طول العمر، الأمراض المرتبطة بالعمر، وأمراض السرطان، والتوتر. على مدى عقود، كان معيار الذهب من قياسات طول التيلومير محطة تحليل شظية تقييد باستخدام التهجين الجنوبي. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة تطورت وسيلة معقولة وسريعة، وسهلة لتنفيذ بواسطة Cawthon. باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي، وعرضت Cawthon بديلا مفيدا لقياس طول التيلومير، مما يجعل دراسات لعينات كبيرة الحجم ممكن.
باستخدام QRT-PCR، وقد أجريت العديد من الدراسات للتحقيق في العلاقة بين طول التيلومير ومجموعة متنوعة من النتائج، خصوصا الأمراض المرتبطة بالعمر. وبشكل أكثر تحديدا، سمحت هذه الطريقة الباحثين لإجراء ستو وبائية كبيرةيموت على السكان أن تثبت أو تنفي وجود علاقة بين طول التيلومير ومجموعة متنوعة من الأمراض. هذا غيض من فيض، وأمراض نقص تروية القلب 7 ومرض الزهايمر 22، osteocarcoma في الإناث 23، وسرطان الرئة بين المدخنين 24، عائلي بسرطان الغدة الدرقية 25 والسكري 5، ضغط الدم 26، والشيخوخة 27، والخرف 28 تم ربطها مع أقصر طول التيلومير ، في حين المرتبطة بالعمر وقد ثبت الضمور البقعي 7، سرطان القولون والمستقيم 43، والوفيات الناجمة عن الأمراض المعدية والسرطان وأمراض القلب أو أمراض الأوعية الدماغية 44 لديهم اي علاقة كبيرة مع طول التيلومير. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أن بعض الضغوط ليتزامن مع أقصر طول التيلومير، على سبيل المثال، زيادة كمية علامات للالتهابات، TNF-α و IL-6، وقد ارتبط مع أطوال التيلومير أقصر في الكريات البيض 29. أيضا، مرهقة ليفestyles بسبب الجداول الزمنية المستهلكة العمل، العمل في نوبات، أو طبيعة العمل، وبخاصة موقف المؤقتة للطفل مصابين بأمراض مزمنة، وقد ارتبطت مع وجود اختلافات في طول التيلومير. وهذا يشير إلى أن الإجهاد يمكن أن يسبب الشيخوخة المبكرة عن طريق تقصير التيلومير دون استرداد كافية 30، 31. في دراسة أجريت مؤخرا، وجود علاقات اجتماعية أقل ويرتبط أيضا مع أقصر التيلوميرات 32. وقد تبين أيضا الوقاية من التيلومير تقصير طول لربط مع اختيارات الحياة الصحية، مثل تناول الفيتامينات يوميا وعدم التدخين 24 و 33. بالإضافة إلى ذلك، كشفت هذه الدراسات الاستخدامات السريرية المحتملة لالتيلوميرات القياس، على سبيل المثال، بمثابة اختبار الفحص غير الغازية لاحتمالات تطوير تليف الكبد 34. في حالات أخرى، حيث أظهرت دراسات مماثلة لا ارتباط كبير (أو ارتباط متواضع) بين مرض وطول التيلومير، وقد شجعت الباحثين على شارعآليات udy رواية أخرى لانخفاض الخلوية والدولة المريضة 7.
هذه الدراسات لديها قوة في أرقام وأثبتت فائدة قياس طول التيلومير باعتبارها واحدة من الخطوات الأولى في فك رموز عملية الشيخوخة. كان أسلوب QRT-PCR Cawthon في مفيدة لهذا الغرض لأنه لا يمكن مقارنة أعداد كبيرة من الناس، ويتطلب الحد الأدنى من الحمض النووي، ويمكن أن تعطي أدلة موثوق بها نحو علاقة بين طول التيلومير والصحة الخلية. هذه الدراسات تساعد على توجيه الجهود البحثية الشيخوخة في المستقبل لجينات معينة، والأنسجة، والعمليات الخلوية.
حتما، بعد ويلاحظ اختلاف كبير في طول التيلومير، تم الاستعلام عنه تفسيرا لذلك. إلى إجابات على هذه الأسئلة، ودراسات عن التيلوميراز، وقد أنشئت الانزيم تشارك في صيانة التيلومير ولائحته التنفيذية،. وقد عرضت PCR البروتوكولات النشاط تيلوميراز مقرها، وإعطاء معلومات إضافية نحو: أ. تحديد تابعributions من تدهور التيلوميرات، وب. فشل ناجحة صيانة طول التيلومير بواسطة تيلوميراز، وبالتالي توفير فصل آخر لهذه القصة على الشيخوخة ككل، ولا سيما الشيخوخة الخلية.
على الرغم من QRT-PCR بالكشف عن متوسط طول التيلومير، وليس على أساس كروموسوم فردي، وهذا الأسلوب هو أداة قوية للحصول على أدلة نحو كيف يتفاعل الخلية إلى الشيخوخة، والإجهاد، ويوفر ديباجة قصة كيف تقدمنا في العمر. ومن المثير للاهتمام، وقد أدى هذه المعلومات بالفعل إلى قياس طول التيلومير في العيادة لتقدير العمر البيولوجي، وسوف تعزز فهمنا للعملية الشيخوخة ويؤدي حتما إلى منع أو تأخير والفرز من الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر.
| اسم كاشف | شركة | عدد كتالوج |
| الكمية كشف تيلوميراز المتحالفة معها في مجال التكنولوجيا الحيوية | MT3012 | |
| QIAGEN DNeasy كيت | QIAGEN | 69506 |
| LightCycler 480 SYBR الأخضر أنا ماستر، الجاهزة للاستخدام بداية ساخنة مزيج رد فعل لSYBR الخضراء القائم أنا PCR في الوقت الحقيقي باستخدام LightCycler 480 الصك | روش تشخيص | 4707516 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
- Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
- Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
- Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
- Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
- Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
- Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , In Press (2012).
- Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
- Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
- Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
- Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
- Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
- Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
- O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
- Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
- Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
- O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
- Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
- Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
- Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
- Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
- Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
- Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
- Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
- Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
- O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
- Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
- Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. , In Press (2012).
- Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
- Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , In Press (2012).
- Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , In Press (2012).
- Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
- Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
- Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
- Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
- Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
- Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
- Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).
