Summary
Протокол для разделения эмбриона лица эктодермы и мезенхимы описано. Мы используем диспазы II для лечения целого эмбрионов первых, анализировать все лица протуберанцы, а потом разделить лицевой эктодермы и мезенхимы.
Abstract
Орофациальные трещины являются наиболее частыми черепно-лицевых дефектов, которые влияют 1,5 на 1000 новорожденных по всему миру 1,2. Орофациальные clefting вызвана ненормальной лица 3 развитии. В человека и мыши, начальный рост и структурирование лицо опирается на несколько маленьких бутонов ткани, лицевой протуберанцы 4,5. Лицо является производным от шести основных протуберанцев: парные фронтальные процессы носа (ФНП), верхнечелюстной протуберанцы (MXP) и нижней челюсти протуберанцы (MDP). Эти протуберанцы опухоли состоят из мезенхимы, которые заключены в вышележащие эпителия. Исследования, проведенные в нескольких видов показало, что сигнализации перекрестных помех между лицевой эктодермы и мезенхимы имеет решающее значение для формирования лица 6. Тем не менее, механистического подробная информация о генах, участвующих в этих сигнальных реле отсутствует. Один из способов, чтобы получить полное представление о генной экспрессии, связывания транскрипционных факторов, и хроматина знаки, связанные с развитпинг лица эктодермы и мезенхимы, чтобы выделить и охарактеризовать разделенных отсеков ткани.
Здесь мы представляем метод разделения лица эктодермы и мезенхимы в эмбриональный день (E) 10,5, критическую стадию развития в лице мыши образование, которое предшествует слияние протуберанцев. Наш метод адаптирован от подхода, мы уже использовали для рассечения лица протуберанцы 7. В этом раннем исследовании мы заняты инбредных мышей C57BL / 6, как этот штамм стал стандартом для генетика, геномика и лицевой морфологии 8. Здесь, однако, из-за более ограниченного количества тканей в наличии, мы использовали беспородных CD-1 штамм, который дешевле купить, более надежных для животноводства, и стремящихся производить больше эмбрионов (12-18) в помете, чем любой инбредных мыши штамма 8. После эмбриона изоляции, нейтральные протеазы диспазы II был использован для лечения целого эмбриона. Тогда, лица протуберанцев были рассекатьред в аренду, и лица эктодермы была отделена от мезенхимы. Этот метод сохраняет оба лица эктодермы и мезенхимы нетронутыми. Образцы, полученные с использованием этой методики могут быть использованы для методов, включая обнаружение белка, иммунопреципитации хроматина (ChIP) анализа, микрочипов исследований, и РНК-след.
Protocol
1. Подготовка диспазы II
- Подготовка свежих Hepes-солевой буфер (HBS) (50 мМ Hepes / KOH рН 7,4, 150 мМ NaCl). Добавить 2 мл 0,5 М Hepes / KOH рН 7,4 и 1,2 мл 2,5 М NaCl в 16,8 мл ультрачистой H 2 O.
- Сделайте 10 мг / мл диспазы II. Взвесить 0,2 г диспазы II (Roche, Cat # 4942078001) и растворить в 20 мл HBS. Подготовка 1,0 мл аликвоты в отдельных труб Эппендорф и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
- Развести 10 мг / мл диспазы II 1:10 в PBS перед использованием. Положить разбавленный диспазы II на льду.
2. Проанализируйте CD-1 E10.5 эмбрионов от беременной женщины
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными в Университете Колорадо Денвере (UCD) Уход за животными и использованию комитета. CD-1 (ICR) мышей были получены от Харлан Laboratories (Индианаполис, Индиана).
- Очистите область вскрытие и инструментов с 70% этанола.
- Усыпить беременных CD-1 женский использованием approvред протоколов.
- Спрей живота с 70% этанола затем открыть живот. Используйте один набор щипцы, чтобы вытащить матки и другим оторвать mesometrium из матки. Удалить матку из тела. Повторите эти действия для рог матки на другой стороне живота.
- Сполоснуть матки с ледяным PBS в 10-см чашки Петри, чтобы смыть кровь.
- Передача матки в новую чашку Петри с ледяным PBS. Отдельная в одном эмбриона фрагменты, сокращая между имплантацией сайтов.
- Передача одного эмбриона в ледяной PBS под стереомикроскопа. Используйте тонкий пинцет, чтобы оторвать мышечной стенки матки, начиная с одного из участков разреза подвергать эмбрион с желточного мешка. Снимите желточный мешок и амнион. Передача расчлененный эмбриона с 6-см чашки Петри с PBS на льду. Продолжаться, пока все эмбрионы были собраны на этом пути.
3. Диспазы II Лечение
- Вымойте все эмбрионы с PBS в 6-см чашки Петри. ЗаменятьPBS с 10 мл разбавленной диспазы II в PBS. Накройте чашку Петри и инкубируют при 37 ° С в течение 25 мин - бактериальная инкубатор или теплой комнате должно быть достаточно - мы не использовали CO 2 культуре ткани инкубатора для этого шага.
- Возьмите чашку Петри, и наблюдать зародыш под стереомикроскопа. Эктодермы должны были стать свободным, характерна четкая разрыв между этим слоем ткани и основных мезенхимы. Если нет, инкубировать в течение еще 5 мин при 37 ° C. Затем поместите чашку Петри на льду.
4. Проанализируйте из неповрежденных лице Протуберанцы
- Используйте одноразовые пипетки стекла (VWR, Cat # 14672-380) передать один диспазы II рассматриваются эмбриона в ледяной PBS в 6-см чашки Петри под стереомикроскопа.
- Используйте одну пару щипцов для хранения эмбриона. Используйте другой парой тонких щипцов тщательно, чтобы сократить границы лица протуберанцы прикреплены к голове (рис. 1 показаны границылица протуберанцы). Начните с одной стороны MnP, то MXP, а в прошлом ФНП. Сделайте то же самое в другую сторону, чтобы анализировать лица протуберанцы из нетронутым (рис. 2A).
5. Отдельные лица эктодермы из мезенхимы
- Обратите внимание на лица протуберанцы под стереомикроскопа с 3-кратным рабочее расстояние. Используйте длинную стеклянную пипетку Пастера, чтобы аккуратно пипетировать лица протуберанцы вверх и вниз 5 раз. После этого эктодерма легко шелушится.
- Используйте одну пару щипцов для хранения лица протуберанцев. Используйте другую пару щипцов шелушиться эктодермы очень медленно. Рис. 2В показывает, разделенных листов лицевой эктодермы.
- Используйте новую длинную стеклянную пипетку Пастера перенести лица эктодермы в 1,5 мл Eppendorf трубки с PBS на льду. Передача мезенхимы в другую 1,5 мл Eppendorf трубки с PBS на льду.
- Используйте новые ледяной PBS для каждого вскрытия. Сбор образцов.
- Вымойте тОн образцов с PBS. Центрифуга при 4 ° C, 500 мкг в течение 3 мин.
- Аспирируйте PBS, используя длинные стеклянные Пипетки Пастера. Если образцы будут использованы для чип-анализа, переходите к шагу 6.1. Для выделения РНК, переходите к шагу 6.2. Для экстракции белков, переходите к шагу 6.3.
6. Процесс образцы для дальнейших экспериментов
- Образцы для анализа ChIP
- Добавить 1 мл PBS с 1% формальдегида для сшивания. Однородный образцов.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 10 мин с вращением.
- Добавить 110 мкл 1,25 М глицина в каждую пробирку, чтобы утолить непрореагировавшего формальдегида.
- Перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Спиновые при 500 мкг при 4 ° С в течение 3 мин. Удалить супернатант.
- Добавить 1 мл холодного PBS мыть тканей.
- Спиновые при 500 мкг при 4 ° С в течение 3 мин.
- Удалить PBS и повторить PBS мыть один раз.
- Удалить супернатант, Snap замораживания тканей в жидком азоте. Хранить SAmples при -80 ° С для последующего объединения и обработки.
- Образцы для выделения РНК
- Поместите лица эктодермы и мезенхимы в пробирки, содержащие RNAlater (Ambion).
- Инкубируйте образцы в RNAlater решение в течение ночи при 4 ° С, чтобы позволить тщательного проникновения в ткани.
- Хранить при температуре от -20 ° C для последующего объединения и обработки.
- Образцы для экстракции белков
Добавить лизис буфера для образца для последующей обработки. Или оснастки замораживания тканей в жидком азоте. Храните образцы при -80 ° C для последующего объединения и обработки.
Примечания
- Время ограничения. План по 4-6 часа от начала вскрытия до начала раздела 6.
- Когда опытный, он занимает ~ 10-15 мин на эмбрион для выполнения разделов 4 и 5 (вскрытие известность и эктодермы разделения).
- Если образцы для выделения РНК, каждая Solutioп следует относиться с диэтилпирокарбонатом в первую очередь. Также очистите щипцы и рабочая зона с РНКазы в гостях.
- Храните образцы на льду в любое время, за исключением лечения диспазы II и вскрытия. Изменения в новой ледяной PBS для каждого вскрытие, чтобы убедиться, PBS использовали для вскрытия холодно.
- Sharp щипцов имеют решающее значение для получения точных рассечение. Очистите щипцы, чтобы полностью предотвратить любое загрязнение.
- Для сбора образцов из различных выступов, анализировать каждую отдельно известность после лечения диспазы II. Затем отделить эктодермы и мезенхимы.
- После обработки диспазы II, лица эктодермы легко шелушится. Обратите особое внимание на загрязнение от других эктодермы. Отменить все потенциально зараженные ткани.
- Как только вы начинаете, не останавливайтесь, пока образцы достигают соответствующий пункт в разделе 6. Завершить разделение лица эктодермы и мезенхимы для всех эмбрионов так быстро, как вы можете.
- Электронныеnzyme деятельности диспазы II могут быть различными в разных партиях и брендов. Это необходимо отрегулировать время обработки для различных марок и серий диспазы II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После лечения диспазы II, эктодермы зародыша стремится быть свободной. Лица протуберанцы должны быть неповрежденными после рассечения (рис. 2A). Изолированные лица эктодермы является чистой и свободной от мезенхимы ткани (рис. 2В). Для определения эффективности протокола и для выявления перекрестного загрязнения мы анализировали на переднем мозге выразил Zic3 9, эктодермального конкретных CDH1 5 и мезенхимальные конкретных Sox10 10 с помощью обратной транскриптазы ПЦР. Наши исследования подтвердили, что оба лица эктодермы и мезенхимы выразил ожидаемого генов и были свободны от перекрестного загрязнения (рис. 3).
Рисунок 1. Принципиальная схема показывает мыши E10.5 лица протуберанцев. Вид сбоку (слева) головы и ростральной вид (справа) глава E10.5 эмбрионов. Красный dotteд линии обозначают границы лица протуберанцев. Лобно-носовой известность (ФНП), верхнечелюстной известность (MXP), нижней челюсти известность (MDP).
Рисунок 2. Внешний вид расчлененного целого E10.5 лица протуберанцев и лица эктодермы. (A) всего лица протуберанцев. (B) лица эктодермы. Панели А и В то же увеличением. Включить в B показывает большее увеличение одного из эктодермы лица в панели B. Лобно-носовой известность (ФНП), верхнечелюстной известность (MXP), нижней челюсти известность (MDP).
Рисунок 3. Обратной транскриптазы ПЦР подтвердил, что оба лица эктодермы и мезенхимы бесплатно креста сотрудничестваntamination. Тотальная РНК была извлечена из эктодермы лица (E) и мезенхимы (M). РНК обратной транскрипции в свою комплементарную ДНК (кДНК), а затем с помощью ПЦР со специфическими праймерами для выявления экспрессии бета-актина (B-актин), Zic3, CDH1 и Sox10. Праймеров в таблице 1 были получены от грунтовки банка ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). ПЦР-продукты были разделены на 2% агарозном геле. ДНК Ladder (L).
| Ген | Primer имя | Последовательности | Размер продукта |
| Бета-актин | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 б.п. |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| Zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 б.п. |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 б.п. |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| Sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 б.п. |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Таблица 1. Грунтовка последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает простой способ отделить эмбриональных мышь лица эктодермы и мезенхимы основаны на начальном этапе лечения диспазы II. В предыдущих исследованиях, мы провели вскрытие лица протуберанцев до начала лечения диспазы II, но мы последовательно обнаружили, что мезенхимы становятся «липкими» и труднее манипулировать. Наш новый протокол позволяет решить эту проблему. Комбинация диспазы II лечения с нежной физической силы с помощью пипетки вверх и вниз делает разделение эктодермы и мезенхимы легче. Кроме того, этот протокол также хорошо работает для разделения других эмбриональных образцы эктодермы и мезенхимы, таких как конечности эктодермы и мезенхимы бутон с более короткими сроками лечения диспазы II. Кроме того, она может быть использована и на других стадиях развития - например, для разделения E11.5 лица эктодермы и мезенхимы с более длинным шагом диспазы лечение II.
Размер выборки получены из E10.5 мышь лица ПроминьENCE весьма мала, и поэтому мы, как правило, хранят в конечном счете партий для обработки и анализа. В связи с этим необходимо бассейна эктодермального образцов от 100-150 эмбрионов для получения 10 мг ткани. Большое количество мезенхимы является производным от каждого эмбриона требует меньше объединения. Выход ультразвуком геномной ДНК для чип-анализа составляет около 80 мкг от 10 мг лица эктодермы. Общий выход РНК составляет около 20 мкг на 10 мг лица эктодермы. Из сравнительного анализа белков Брэдфорд, мы считаем, что мы можем получить до 1 мг белка на 10 мг лица эктодермы. После того, РНК, хроматина, или образцы белка в стороны, они могут быть использованы для многочисленных анализов, включая обнаружение белка, чип анализ, анализ микрочипов, и РНК-след. Таким образом, этот протокол позволяет провести тщательный анализ дифференциальной экспрессии генов, эпигенетические модификации и связывания транскрипционных факторов, ответственных за молекулярную перекрестных помех между лицевой эктодермы и мезенхимы в процессе эмбрионального развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие интересы или иных конфликтов, связанных с содержанием этой статьи.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Irene Choi для иллюстрации эмбрионов главы на рис 1, а остальные члены лаборатории за помощь и обсуждение. Эта работа выполнена при поддержке гранта NIH DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
