Summary
भ्रूण चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme की जुदाई के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. हम Dispase द्वितीय का उपयोग करने के लिए पूरे भ्रूण पहले इलाज, पूरे चेहरे prominences बाहर टुकड़े करना, और फिर चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme अलग.
Abstract
Orofacial clefts सबसे अक्सर craniofacial दोष है, जो हज़ार newborns दुनिया भर में 1,2 में 1.5 को प्रभावित कर रहे हैं. Orofacial clefting असामान्य चेहरे का विकास 3 के कारण होता है. मानव और माउस, प्रारंभिक और चेहरे के विकास patterning में ऊतक के कई छोटे कलियों, चेहरे 4,5 prominences पर निर्भर करता है. बनती ललाट नाक प्रक्रियाओं (FNP), दाढ़ की हड्डी prominences (MXP) और जबड़े prominences (एमडी): चेहरा छह मुख्य prominences से ली गई है. ये prominences mesenchyme की सूजन है कि एक overlying उपकला में encased हैं से मिलकर. कई प्रजातियों में अध्ययनों से पता चला है कि चेहरे की बाहरी झिल्ली और mesenchyme बीच crosstalk संकेत 6 चेहरे को आकार देने के लिए महत्वपूर्ण है. फिर भी, इन संकेत रिले में शामिल जीन से संबंधित यंत्रवत विवरण की कमी कर रहे हैं. जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक व्यापक समझ हासिल करने के लिए एक तरीका है, प्रतिलेखन बाध्यकारी कारक, और chromatin के निशान develo के साथ जुड़ेपिंग चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme करने के लिए अलग और अलग ऊतक डिब्बों विशेषताएँ है.
यहाँ हम भ्रूण (ई) दिन 10.5, माउस चेहरे गठन कि prominences के विलय से पहले में एक महत्वपूर्ण विकास मंच में चेहरे की बाहरी झिल्ली और mesenchyme को अलग करने के लिए एक विधि उपस्थित थे. हमारे विधि दृष्टिकोण से अनुकूलित है हम पहले विदारक चेहरे 7 prominences के लिए इस्तेमाल किया है. इस पहले के अध्ययन में हम सहज C57BL कार्यरत था / इस तनाव के रूप में 6 चूहों आनुवांशिकी, जीनोमिक्स और चेहरे आकारिकी 8 के लिए एक मानक बन गया है. यहाँ, हालांकि, उपलब्ध ऊतक के अधिक सीमित मात्रा के कारण, हम outbred तनाव सीडी-1 है कि खरीद करने के लिए सस्ता है, खेती - किसानी के लिए और अधिक मजबूत का उपयोग किया है, और कूड़े के प्रति अधिक (12-18) किसी भी जन्मजात से भ्रूण का उत्पादन प्रवृत्त माउस तनाव 8. भ्रूण अलगाव के बाद, तटस्थ protease Dispase द्वितीय पूरे भ्रूण का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिर, चेहरे prominences टुकड़े करनाएड बाहर, और चेहरे की बाहरी झिल्ली mesenchyme से अलग हो गया था. इस विधि दोनों चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme बरकरार रहता है. इस पद्धति का उपयोग के नमूने प्राप्त प्रोटीन का पता लगाने, chromatin immunoprecipitation (चिप) परख, माइक्रोएरे अध्ययन, और शाही सेना seq सहित तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. Dispase द्वितीय तैयार करें
- ताजा HEPES-buffered खारा (HBS) (50 मिमी HEPES / KOH पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl) तैयार 16.8 मिलीलीटर Ultrapure एच 2 ओ में 2 मिलीलीटर 0.5 एम / HEPES KOH पीएच 7.4 और 1.2 मिलीग्राम 2.5 एम NaCl जोड़ें
- 10 मिग्रा / मिली Dispase द्वितीय बनाओ. वजन 0.2 छ Dispase द्वितीय (रॉश, बिल्ली 4942078001 #) और 20 मिलीलीटर HBS में भंग. व्यक्तिगत Eppendorf -20 डिग्री सेल्सियस पर और ट्यूब की दुकान में लंबी अवधि के भंडारण के लिए 1.0 मिलीलीटर aliquots तैयार करो.
- उपयोग करने से पहले 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर Dispase द्वितीय 1:10 पीबीएस में पतला. बर्फ पर पतला Dispase द्वितीय रखो.
2. गर्भवती महिला से CD-1 E10.5 भ्रूण टुकड़े करना
सभी पशु प्रयोगों पशु कोलोराडो डेनवर विश्वविद्यालय (UCD) की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. सीडी एक (ICR) चूहों Harlan लेबोरेटरीज (इंडियानापोलिस में) से प्राप्त किया गया.
- 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन क्षेत्र और उपकरण साफ.
- गर्भवती सीडी-1 का उपयोग कर महिला approv euthanizeएड प्रोटोकॉल.
- 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे तो पेट खुला. संदंश की एक सेट का उपयोग करने के लिए गर्भाशय और अन्य पुल के गर्भाशय से दूर mesometrium आंसू. शरीर से गर्भाशय निकालें. पेट के दूसरे पक्ष पर गर्भाशय सींग के लिए दोहराएँ.
- संक्षेप में बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश में गर्भाशय के बाहर खून धोने कुल्ला.
- बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ एक नई पेट्री डिश में गर्भाशय में स्थानांतरित करें. आरोपण साइटों के बीच में कटौती करके एक भ्रूण के टुकड़ों में अलग है.
- एक stereomicroscope तहत ठंडा पीबीएस में एक भ्रूण स्थानांतरण. ठीक संदंश का प्रयोग करने से गर्भाशय की मांसपेशियों में दीवार कट जर्दी थैली के साथ भ्रूण बेनकाब साइटों में से एक में शुरू आंसू. पील जर्दी थैली और भ्रूणावरण बंद. एक 6 सेमी पीबीएस के साथ बर्फ पर पेट्री डिश dissected भ्रूण स्थानांतरण. आगे बढ़ें जब तक सभी भ्रूण इस तरह से एकत्र किया गया है.
3. Dispase द्वितीय उपचार
- पीबीएस के साथ एक 6 सेमी पेट्री डिश में सभी भ्रूण धो लें. बदलेंपीबीएस के साथ 10 मिलीलीटर पीबीएस में पतला Dispase द्वितीय. एक जीवाणु इनक्यूबेटर या गर्म कमरे पर्याप्त होना चाहिए - 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए कवर पेट्री डिश और सेते हम एक सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर इस कदम के लिए इस्तेमाल नहीं किया है.
- पेट्री डिश बाहर ले जाओ और एक stereomicroscope तहत भ्रूण का पालन. बाहरी झिल्ली ढीला हो जाना चाहिए, इस ऊतक परत और अंतर्निहित mesenchyme के बीच एक स्पष्ट अंतर द्वारा typified. यदि नहीं, तो 37 में एक अतिरिक्त 5 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए सेते हैं तो बर्फ पर पेट्री डिश में डाल दिया.
4. बाहर बरकरार चेहरे prominences टुकड़े करना
- एक डिस्पोजेबल गिलास विंदुक का प्रयोग (VWR, बिल्ली 14672-380 #) एक stereomicroscope के तहत हस्तांतरण एक Dispase द्वितीय ठंडा पीबीएस में एक 6 सेमी पेट्री डिश में भ्रूण का इलाज किया.
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए भ्रूण को पकड़. ठीक संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग सावधानी से करें चेहरे सिर से जुड़े prominences (चित्रा 1 की सीमाओं से पता चलता है की सीमाओं में कटौतीचेहरे prominences). एमएनपी के एक तरफ, तो MXP, और पिछले FNP से शुरू करो. दूसरे पक्ष के लिए भी ऐसा ही करने बरकरार बाहर चेहरे prominences (2A चित्रा) टुकड़े करना.
5. Mesenchyme से अलग चेहरे बाहरी झिल्ली
- 3x काम दूरी के साथ एक stereomicroscope के तहत चेहरे prominences का निरीक्षण करें. एक लंबे गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग धीरे चेहरे prominences ऊपर और नीचे 5 बार विंदुक. इस के बाद, बाहरी झिल्ली बंद छील करने के लिए आसान है.
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए चेहरे का prominences पकड़. छील करने के लिए बाहरी झिल्ली बंद संदंश की अन्य जोड़ी प्रयोग बहुत धीरे धीरे चित्रा 2B चेहरे चादरें बाहरी झिल्ली से अलग से पता चलता है.
- एक नया लंबे गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में बर्फ पर पीबीएस के साथ चेहरे की बाहरी झिल्ली का हस्तांतरण. बर्फ पर पीबीएस के साथ एक और 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब mesenchyme स्थानांतरण.
- प्रत्येक विच्छेदन के लिए नए बर्फ के ठंडे PBS का प्रयोग करें. नमूने इकट्ठा.
- टी धोउन्होंने पीबीएस के साथ नमूने हैं. 4 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र.
- लंबे गिलास पाश्चर pipettes का उपयोग पीबीएस Aspirate. यदि नमूने चिप परख के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, के लिए 6.1 कदम आगे बढ़ना. शाही सेना निष्कर्षण के लिए, 6.2 कदम आगे बढ़ना. प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, 6.3 कदम आगे बढ़ना.
6. आगे के प्रयोगों के लिए प्रक्रिया नमूने
- चिप परख के लिए नमूने
- 1% crosslink formaldehyde के साथ 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें. नमूने homogenize.
- रोटेशन के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- प्रत्येक ट्यूब 1.25 एम Glycine के 110 μl जोड़ें unreacted formaldehyde बुझाना.
- मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 500 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए स्पिन. तैरनेवाला निकालें.
- 1 मिलीलीटर ठंड पीबीएस जोड़ें ऊतकों धोने.
- 500 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए स्पिन.
- पीबीएस निकालें और दोहराने पीबीएस एक बार धो लो.
- तैरनेवाला निकालें, स्नैप तरल नाइट्रोजन में ऊतकों फ्रीज. सा स्टोर-80 डिग्री बाद pooling और प्रसंस्करण के लिए सी mples.
- शाही सेना निष्कर्षण के लिए नमूने
- चेहरे और RNAlater (Ambion) युक्त ट्यूबों में बाहरी झिल्ली mesenchyme रखें.
- RNAlater 4 में रातोंरात डिग्री सेल्सियस ऊतक के पूरी तरह से प्रवेश की अनुमति के समाधान में नमूने सेते हैं.
- -20 डिग्री सेल्सियस के बाद pooling और प्रसंस्करण के लिए स्टोर.
- प्रोटीन निकासी के लिए नमूने
बाद के प्रसंस्करण के लिए नमूना lysis बफर जोड़ें. तस्वीर या तरल नाइट्रोजन में ऊतकों फ्रीज. -80 डिग्री बाद pooling और प्रसंस्करण के लिए सी नमूने स्टोर.
नोट्स
- समय की कमी. विच्छेदन के माध्यम से शुरू से धारा 6 की शुरुआत करने के लिए 4-6 घंटे पर योजना.
- जब प्रवीण, यह ~ भ्रूण प्रति 10-15 मिनट लगते हैं 4 वर्गों और 5 (प्रमुखता विच्छेदन और बाहरी झिल्ली जुदाई) प्रदर्शन.
- यदि नमूने शाही सेना अलगाव, हर solutio के लिए कर रहे हैंn Diethylpyrocarbonate साथ 1 माना जाना चाहिए. इसके अलावा संदंश और RNase साथ काम कर दूर क्षेत्र को साफ.
- Dispase द्वितीय उपचार और dissections के लिए छोड़कर सभी समय पर बर्फ पर नमूने रखें. प्रत्येक के लिए सुनिश्चित करें कि विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया पीबीएस ठंड बनाने के विच्छेदन के लिए नए बर्फ ठंड पीबीएस में बदलें.
- तीव्र संदंश सटीक विच्छेदन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. संदंश पूरी तरह से साफ करने के लिए किसी भी प्रदूषण को रोकने के लिए.
- विभिन्न prominences से नमूने इकट्ठा करने के लिए, प्रत्येक प्रमुखता अलग टुकड़े करना Dispase द्वितीय उपचार के बाद. फिर बाहरी झिल्ली और mesenchyme अलग.
- Dispase द्वितीय के साथ उपचार के बाद, चेहरे की बाहरी झिल्ली बंद छील करने के लिए आसान है. अन्य बाहरी झिल्ली से संदूषण के लिए विशेष ध्यान देना. सभी संभावित दूषित ऊतक त्यागें.
- एक बार जब आप शुरू, बंद करो जब तक नमूने धारा 6 में उपयुक्त बिंदु तक पहुँच नहीं है. चेहरे की बाहरी झिल्ली की जुदाई समाप्त करें और सभी भ्रूण के लिए के रूप में के रूप में आप यह कर सकते हैं जल्दी mesenchyme.
- ईकी nzyme गतिविधियों Dispase द्वितीय बैचों और ब्रांडों के बीच अलग हो सकता है. यह विभिन्न ब्रांडों और Dispase द्वितीय के बैचों के लिए उपचार का समय समायोजित करने के लिए आवश्यक है.
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Representative Results
Dispase द्वितीय उपचार के बाद भ्रूण की बाहरी झिल्ली को ढीला हो जाता है. चेहरे prominences विच्छेदन (2A चित्रा) के बाद बरकरार होना चाहिए. पृथक चेहरे बाहरी झिल्ली स्पष्ट और mesenchyme ऊतक (चित्रा 2B) के मुक्त है. प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए और हम अग्रमस्तिष्क के लिए assayed पार संदूषण का पता लगाने 9 Zic3, बहिर्जनस्तरीय विशिष्ट cdh1 5 और mesenchymal विशिष्ट sox10 रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर का उपयोग 10 व्यक्त. हमारे अध्ययन की पुष्टि की है कि दोनों चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme उम्मीद जीनों व्यक्त और पार संदूषण (चित्रा 3) के लिए स्वतंत्र थे.
चित्रा 1. योजनाबद्ध आरेख माउस E10.5 चेहरे prominences E10.5 भ्रूण सिर के व्याख्यान चबूतरे वाला दृश्य (दाएं) और सिर के पार्श्व दृश्य (बाएं) दिखा. लाल dotteरेखाएं चेहरे prominences की सीमा का संकेत. ललाटनासास्थिक (FNP) प्रमुखता, दाढ़ की हड्डी प्रमुखता (MXP), जबड़े प्रमुखता (एमडी).
चित्रा 2. Dissected पूरे E10.5 चेहरे prominences और चेहरे की बाहरी झिल्ली की उपस्थिति. (ए) पूरे चेहरे prominences. चेहरे बाहरी झिल्ली (बी). पैनलों ए और बी एक ही बढ़ाई हैं. बी में सम्मिलित करें एक पैनल बी में चेहरे की बाहरी झिल्ली के उच्च वृद्धि से पता चलता है. ललाटनासास्थिक (FNP) प्रमुखता, दाढ़ की हड्डी प्रमुखता (MXP), जबड़े प्रमुखता (एमडी).
चित्रा 3. ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर उल्टा इस बात की पुष्टि की कि दोनों चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme पार सह के लिए स्वतंत्र हैंntamination. कुल शाही सेना चेहरे (ई) बाहरी झिल्ली और mesenchyme (एम) से निकाला गया था. आरएनए रिवर्स इसकी पूरक डीएनए (सीडीएनए), विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा पीछा करने के लिए (B-actin) बीटा-actin, Zic3, cdh1 और sox10 की अभिव्यक्ति का पता लगाने में transcribed किया गया था. तालिका 1 में प्राइमर दृश्यों प्राइमर बैंक (से प्राप्त किया गया http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). पीसीआर उत्पादों 2% agarose जेल पर अलग हो गए थे. डीएनए सीढ़ी (एल).
| जीन | प्राइमर नाम | दृश्यों | उत्पाद का आकार |
| बीटा-actin | mActb एफ | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 बीपी |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3 एफ | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 बीपी |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| cdh1 | mcdh1 एफ | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 बीपी |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10 एफ | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 बीपी |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
तालिका 1. प्राइमर दृश्यों.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीधा करने के लिए भ्रूण माउस चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme एक प्रारंभिक Dispase द्वितीय उपचार कदम के आधार पर अलग तरीका प्रदान करता है. पिछले अध्ययनों में, हम Dispase द्वितीय उपचार के लिए पहले चेहरे prominences के विच्छेदन प्रदर्शन किया है, लेकिन हम लगातार पाया है कि mesenchyme "चिपचिपा" और अधिक हेरफेर करने के लिए मुश्किल हो जाता है. हमारे नए प्रोटोकॉल इस समस्या से बचा जाता है. युग्म Dispase कोमल शारीरिक बल के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा उपचार द्वितीय बाहरी झिल्ली की जुदाई और mesenchyme आसान बनाता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के भी अन्य अंग कली और कम Dispase द्वितीय उपचार के साथ बाहरी झिल्ली mesenchyme के रूप में इस तरह के भ्रूण बाहरी झिल्ली और mesenchyme नमूने के अलग होने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. इसी प्रकार, यह विकास के दूसरे चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है - उदाहरण के लिए अब Dispase द्वितीय उपचार कदम के साथ E11.5 चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme को अलग करने के लिए,.
एक E10.5 माउस चेहरे promin से प्राप्त नमूना आकारखिलाडि़यों काफी छोटा है और इसलिए हम अंततः प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए बैचों की दुकान करते हैं. इस संबंध में यह 100-150 भ्रूण से पूल बहिर्जनस्तरीय नमूने के लिए ऊतक के 10 मिलीग्राम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. Mesenchyme की एक बड़ी राशि प्रत्येक की आवश्यकता होती है कम pooling भ्रूण से ली गई है. चिप परख के लिए sonicated जीनोमिक डीएनए की उपज 10 मिलीग्राम चेहरे बाह्य त्वक स्तर से 80 ग्राम के बारे में है. कुल शाही सेना उपज 10 मिलीग्राम चेहरे बाहरी झिल्ली प्रति 20 ग्राम के बारे में है. एक तुलनात्मक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख से, हम अनुमान है कि हम 1 मिलीग्राम प्रति 10 मिलीग्राम चेहरे बाहरी झिल्ली प्रोटीन प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं. एक बार शाही सेना, chromatin, या प्रोटीन के नमूने हाथ में हैं, वे प्रोटीन का पता लगाने, चिप परख, माइक्रोएरे विश्लेषण, और शाही सेना seq सहित कई assays के लिए उपयोग किया जा सकता है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल अंतर जीन की अभिव्यक्ति, epigenetic संशोधन, और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी चेहरे और भ्रूण विकास के दौरान बाहरी झिल्ली mesenchyme के बीच आणविक crosstalk के लिए जिम्मेदार का एक गहन विश्लेषण में सक्षम बनाता है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा के हितों या अन्य संघर्ष इस लेख की सामग्री के साथ जुड़े है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए Irene चोई 1 छवि और मदद और चर्चा के लिए प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों में भ्रूण सिर illustrating के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम NIH अनुदान DE012728 (TW) द्वारा समर्थित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
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