Summary
胚顔面外胚葉と間充織を分離するためのプロトコルが記載されている。我々は、最初の全体の胚を扱う全体フェイシャルプロミネンスを解剖してから、顔の外胚葉と間充織を分離するためにディスパーゼIIを使用。
Abstract
口腔顔面裂は、世界中の千新生児1,2で1.5に影響を与える最も頻繁に顔面の欠陥である。口腔顔面分裂文形成が異常な顔の開発3によって引き起こされます。ヒトとマウスでは、顔の初期成長とパターン形成は、組織のいくつかの小さな芽、4,5顔面プロミネンスに依存しています。ペアの前頭鼻プロセス（FNP）、上顎プロミネンス（MXP）及び下顎プロミネンス（MDP）：顔が6メインプロミネンスから派生しています。これらのプロミネンスは、上面を覆う上皮に収められて間葉の腫れで構成されています。複数の種における研究では、顔の外胚葉と間充織間のシグナリングのクロストークが面6を形成するための重要であることが示されている。しかし、これらのシグナル伝達に関与する遺伝子のリレーに関する機序の詳細は不足している。一遺伝子発現の包括的な理解を得るための方法、結合転写因子、およびdeveloに関連付けられたクロマチンマーク顔面外胚葉と間充織にpingを実行すると、分離された組織区分を隔離し、特徴付けることである。
ここでは、胎生（E）は10.5、プロミネンスの融合の前にマウスの顔の形成に重要な発達段階で顔の外胚葉と間充織を分離するための方法を提示します。本手法は、我々が以前に顔のプロミネンス7を解剖に使用してきたアプローチから適応されている。この株は遺伝学、ゲノミクスおよび顔面形態8のための標準となっているように、この以前の研究では、近交系のC57BL / 6マウスを採用していた。ここでは、しかし、可能な組織のより数量限定のため、弊社では一切の近交系より腹あたり近交系のCD-1購入したほうが安い株を、畜産のためのより堅牢で、より多くの胚を生成する傾向がある（12-18）を利用してきたマウス系統8。胚の分離に続いて、中性プロテアーゼディスパーゼIIは、全胚を治療するために使用されていました。その後、顔のプロミネンスは解剖されたED出て、顔の外胚葉が間葉から分離した。この方法は、顔の外胚葉と間充織の両方をそのまま保持します。この方法論を用いて得られた試料は、タンパク質検出、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイ、マイクロアレイ研究、およびRNA-seqを含む技術に使用することができます。
Protocol
1。ディスパーゼIIを調製
- 新鮮なHepes緩衝生理食塩水（HBS）（50mMのHEPES / KOH pH7.4の150mMのNaCl）を準備します。 16.8ミリリットル純H 2 Oに2ミリリットル、0.5M HEPES / KOH pH7.4及び1.2ミリリットル2.5 M NaClを追加
- 10 mg / mlのディスパーゼIIを作る。 0.2グラムディスパーゼII（Roche社、カタログ番号4942078001）を計量し、20ミリリットルHBSに溶解する。長期保存のために-20℃で、個々のエッペンドルフチューブとストアに1.0mlのアリコートを準備します。
- 使用前にPBS中の10 mg / mlのディスパーゼII 1:10に希釈します。氷の上に希釈ディスパーゼIIを入れてください。
2。妊娠中の女性からのCD-1 E10.5胚を解剖
全ての動物実験は、コロラド州デンバー大学（UCD）の動物のケアと使用委員会によって承認されたプロトコールに従って行った。 CD-1（ICR）マウスをハーランラボラトリーズ（インディアナポリス、インディアナ州）から入手した。
- 70％エタノールを用いて解剖エリアやツールを清掃してください。
- approvを使用して妊娠CD-1雌を安楽死させるedのプロトコル。
- 腹部を開いた後、70％エタノールで腹部をスプレーしてください。子宮から子宮間膜を引き離すために、子宮と別のを引っ張るために鉗子の1セットを使用します。体内から子宮を取り出します。腹部の反対側の子宮角にこの手順を繰り返します。
- 簡単に言えば血液を洗い流す10cmのペトリ皿に氷冷PBSで子宮をすすいでください。
- 氷冷PBSで新しいシャーレに子宮を転送します。注入部位の間に切断することにより1-胚断片に分離します。
- 実体顕微鏡下で氷冷PBS中に1つの胚を転送します。卵黄嚢と胚を露出するように切断部位の1つで始まって子宮の筋肉壁をはがすように細かい鉗子を使用しています。卵黄嚢と羊膜を剥がします。氷上のPBSで6 cmのシャーレに解剖した胚を転送します。すべての胚がこのように収集されるまで進んでください。
3。ディスパーゼIIの治療
- 6 cmのシャーレにPBSですべての胚を洗浄します。置き換えるPBS中で10ミリリットル希釈ディスパーゼIIを含むPBS。 25分間37℃でペトリ皿とインキュベートをカバー-細菌インキュベーターまたは暖かい部屋で十分です-私たちは、このステップのために、CO 2組織培養インキュベーターを使用していない。
- ペトリ皿を取り出し、実体顕微鏡下で胚を観察します。外胚葉が緩んでいるはずですが、この組織層と下層の間充織との間に明確なギャップに代表される。されていない場合は、37℃でさらに5分間℃のインキュベート次いで氷上でペトリ皿を置く。
4。無傷の顔の際立ちを解剖する
- 使い捨てガラスピペット（VWR、カタログ番号14672から380）を使用して、 実体顕微鏡下で1ディスパーゼIIが6 cmのペトリ皿に氷冷PBS中に胚を扱わ転送します。
- 胚を保持するために鉗子のペアを1つ使用します。ヘッド（ 図1に取り付けられて顔面プロミネンスの境界線をカットするために慎重細かい鉗子の別のペアを使用しての境界を示していますフェイシャルプロミネンス）。 MXPその後、MNPの一方の側から起動して、FNPを持続。そのまま外に顔のプロミネンス（ 図2A）を解剖し、反対側にも同じことを行います。
5。間葉とは別の顔の外胚葉
- 3倍の作動距離を持つ実体顕微鏡下で顔面プロミネンスを観察します。優しく上下に5回フェイシャルプロミネンスをピペットに長いガラスパスツールピペットを使用しています。この後、外胚葉は剥がれやすいです。
- 顔のプロミネンスを保持するために鉗子のペアを1つ使用します。非常にゆっくりと外胚葉剥がし鉗子の他のペアを使用します。 図2Bは、顔の外胚葉の分離シートを示しています。
- 氷上のPBSで1.5mlのエッペンドルフチューブに顔面外胚葉を転送するために新しい長さのガラスパスツールピペットを使用しています。氷上のPBSで別の1.5mlエッペンドルフチューブに間充織を転送します。
- 各解剖のために新しい氷冷PBSを使用しています。サンプルを収集します。
- トンを洗うPBSで彼がサンプル。 4℃、3分間、500×gで遠心分離します。
- 長いガラスパスツールピペットを用いてPBSを吸引除去。サンプルはChIPアッセイに使用する場合は、6.1に進みます。 RNA抽出のために、6.2に進みます。タンパク質の抽出には、6.3に進みます。
6。さらなる実験のためのプロセスのサンプル
- ChIPアッセイ用サンプル
- 架橋〜1％ホルムアルデヒドで1mlのPBSを追加します。サンプルをホモジナイズする。
- 回転に室温で10分間インキュベートする。
- 未反応のホルムアルデヒドをクエンチするために各チューブに1.25 Mグリシンの110μlを添加する。
- 混ぜ、室温で5分間静置します。
- 3分間、4℃で500×gで遠心する。上清を除去します。
- 組織を洗浄するために1ミリリットルの冷PBSを追加します。
- 3分間、4℃で500×gで遠心する。
- PBSを除去し、PBSで一度洗浄を繰り返す。
- 上清を除去し、液体窒素で組織を凍結スナップ。 SAを保存-80℃で、その後のプーリングおよび処理するためのmples。
- RNA抽出用サンプル
- RNAlaterで（Ambion）を含むチューブの顔面外胚葉と間充織を置きます。
- 一晩4 RNAlaterでソリューションでサンプルをインキュベート℃で組織の徹底的な浸透を可能にする。
- 後続のプーリングおよび処理するため-20℃で保存。
- タンパク質抽出用のサンプル
その後の処理のために試料に溶解バッファーを追加します。または液体窒素で組織を凍結スナップ。 -80℃で、その後のプーリングして処理するためのサンプルを保管してください。
注釈
- 時間の制約。第6節の初めに至るまで解剖の開始4から6時間を計画します。
- ときに堪能、それはセクション4および5（プロミネンス解離および外胚葉分離）を実行するために胚当たり約10〜15分かかります。
- サンプルは、RNA単離、毎solutioのためにしている場合nは、第ジエチルで治療すべきである。また鉗子＆アウェイRNaseの作業領域をきれいにしてください。
- ディスパーゼIIの治療および解剖を除いてすべての回でサンプルを氷上で保管してください。解剖に使用PBSは寒いであることを確認するために各郭の新しい氷冷PBSに変更します。
- シャープ鉗子は、正確な切開を得ることが重要です。任意の汚染を防ぐために完全に鉗子を清掃してください。
- 異なるプロミネンスからサンプルを収集するために、ディスパーゼIIの治療後に、個別に各プロミネンスを解剖。その後、外胚葉と間充織を分離します。
- ディスパーゼIIで処理した後、顔の外胚葉が剥がれやすいです。他の外胚葉からの汚染に特別な注意を払う。すべての汚染された可能性のある組織を捨ててください。
- 一度サンプルがセクション6で適切なポイントに到達するまで停止しないと、起動します。早くすることができますようにすべての胚の顔面外胚葉と間葉の分離を完了します。
- 電子ディスパーゼIIのnzyme活動は、バッチとブランドの間で異なる可能性があります。それは、さまざまなブランドとディスパーゼIIのバッチの処理時間を調整することが必要である。
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Representative Results
ディスパーゼIIの治療後、胚の外胚葉が緩んでいる傾向にある。顔のプロミネンスは解剖（ 図2A）した後、無傷でなければなりません。隔離された顔の外胚葉は、はっきりと間葉組織（ 図2B）は無料です。プロトコルの有効性を決定するために、我々は前脳についてアッセイし、交差汚染を検出するZic3 9、外胚葉特定CDH1 5と逆転写PCRを用いた間葉系特定SOX10 10が発現した。我々の研究は、顔の外胚葉と間充織の両方が期待される遺伝子を発現させ、交差汚染（ 図3）の自由であることを確認した。
図1。マウスE10.5顔のプロミネンスを示す模式図。E10.5胚ヘッドのヘッドと吻側ビュー（右）側面図（左）。赤dotted行は顔プロミネンスの境界を示す。前頭鼻隆起（FNP）、上顎隆起（MXP）、下顎隆起（MDP）。
図2。解剖全体E10.5顔のプロミネンスや顔面外胚葉の外観。（）全体の顔のプロミネンス（B）フェイシャル外胚葉。パネルには、AとBは同じ倍率である。 Bに挿入し、パネルBの顔の外胚葉のいずれかの高倍率を示しています。前頭鼻隆起（FNP）、上顎隆起（MXP）、下顎隆起（MDP）。
図3。転写酵素PCRが顔面外胚葉と間充織の両方がクロス共同の自由であることが確認された逆転ntamination全RNAを顔面外胚葉（E）との間充織（M）から抽出した。 RNAを逆β-アクチン（B-アクチン）、Zic3、CDH1とSOX10の発現を検出するために特異的なプライマーを用いたPCRに続いて、その相補的DNA（cDNA）に転写した。 表1のプライマー配列は、プライマー銀行（から得られたhttp://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ）。 PCR産物を2％アガロースゲル上で分離した。 DNAラダー（L）。
| 遺伝子 | プライマー名 | シーケンス | 商品のサイズ |
| β-アクチン | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bpの |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bpの |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bpの |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| SOX10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bpの |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
表1。プライマー配列。
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Discussion
このプロトコルは、初期ディスパーゼIIの処理工程に基づいてマウス胎児顔面外胚葉と間充織を分離するための簡単な方法を提供します。以前の研究で、我々はディスパーゼIIの治療の前に顔のプロミネンスの解剖を行ったが、我々は一貫して間充織は "スティッキー"と操作することがより困難になることを発見した。私たちの新しいプロトコルは、この問題を回避できます。ピペッティングにより穏やかな物理的な力との組み合わせディスパーゼIIの治療は外胚葉の分離を行い、簡単に間葉。また、このプロトコルはまた、短いディスパーゼIIの治療と肢芽の外胚葉と間葉のように、他の胚外胚葉と間充織のサンプルの分離に適しています。同様に、開発の他の段階で使用することができます - 例えば、長いディスパーゼIIの処理工程でE11.5顔面外胚葉と間充織を分離する。
E10.5マウス顔面prominから得られたサンプルサイズリファレンスは非常に小さいため、我々は最終的に処理し、分析用のバッチを格納する傾向がある。この点では、組織の10mgを得るために100から150の胚からプール外胚葉サンプルに必要である。間葉の大きい量を必要とするより少ないプーリング各胚に由来します。 ChIPアッセイのために超音波処理したゲノムDNAの収量は10mg顔面外胚葉から約80μgです。トータルRNAの収量は10mg顔面外胚葉あたり約20μgです。比較ブラッドフォードタンパク質アッセイから、我々は10 mgの顔面外胚葉あたり1mgタンパク質に入手できていると推定している。 RNA、クロマチン、またはタンパク質サンプルが手に入ったら、それらはタンパク質検出、ChIPアッセイ、マイクロアレイ解析、およびRNA-seqを含む多数のアッセイのために利用することができる。したがって、このプロトコルは、異なる遺伝子発現、エピジェネティックな修飾、および胚の発生過程で顔の外胚葉と間充織間の分子のクロストークを担当する転写因子の結合の徹底的な分析を可能にします。
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Disclosures
著者らは、競合する利益またはこの記事の内容に関連した他の競合はありません。
Acknowledgments
著者らは、胚の図1におけるヘッドやヘルプや議論のための研究室の他のメンバーを説明するためのアイリーン·チョイに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金DE012728（TW）でサポートされています
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
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