Summary
태아 얼굴 외배엽과 mesenchyme의 분리를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 먼저 전체 배아를 취급하는 전체 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부하기 위해 Dispase II를 사용하고 얼굴 외배엽과 mesenchyme 구분합니다.
Abstract
Orofacial 갈라진 틈은 1,000 신생아 세계 1,2에서 1.5에 영향을 미치는 가장 자주 craniofacial 결함입니다. Orofacial clefting는 이상 얼굴의 개발 3로 인해 발생합니다. 얼굴의 인간과 마우스, 초기 성장 및 패턴에서 조직의 몇몇 작은 꽃 봉오리, 4,5 얼굴 프로미넌스 prominences에 의존하고 있습니다. 이점 정면 코 프로세스 (FNP), 턱의 프로미넌스 prominences (MxP)와 mandibular의 프로미넌스 prominences (MDP) : 얼굴은 여섯 가지 주요 프로미넌스 prominences에서 파생됩니다. 이러한 프로미넌스 prominences는 놓인 상피으로 쌌다 아르 mesenchyme의 swellings로 구성되어 있습니다. 여러 종의 연구는 얼굴 외배엽과 mesenchyme 사이의 누화 신호를하면 얼굴 6 형성에 중요합니다 것으로 나타났습니다. 그러나,이 신호를 릴레이에 참여 유전자에 관한 기계론의 내용은 부족합니다. 하나의 유전자 표현의 포괄적 인 이해를 얻을 수있는 방법 구속력이 전사 인자 및 develo과 관련된 염색질 마크핑 얼굴 외배엽과 mesenchyme은 분리 조직 구획을 분리하고 특성화하는 것입니다.
여기 배아 일 (E) 10.5 프로미넌스 prominences의 융합을 앞에 마우스 얼굴 형성에 중요한 발달 단계에서 얼굴 외배엽과 mesenchyme를 분리하기위한 방법을 제시한다. 우리의 방법은 우리가 이전에 얼굴 프로미넌스 prominences에게 7 해부에 사용했던 방법에서 구성된다. 이 이전 연구에서 우리는 근친 C57BL을 고용 한 /이 변형 등 6 마우스 유전학, 유전체학 및 얼굴 형태 8에 대한 표준이되었습니다. 여기하지만 가능한 조직의 더 한정된 수량으로 인해, 우리는 축산에 대해보다 강력한를 구입 저렴 outbred CD-1 변형을 활용, 모든 근친보다 쓰레기 당 더 많은 배아 (12-18)를 생산 돌봐 있습니다 마우스 변형 8. 배아 분리 후, 중성 단백 분해 효소 Dispase II는 전체 배아을 치료하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 얼굴 프로미넌스 prominences가 해부했다에드 아웃, 그리고 얼굴 외배엽은 mesenchyme에서 분리되었다. 이 방법은 얼굴 외배엽과 mesenchyme 모두 그대로 유지합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 샘플은 단백질 감지, 염색질 immunoprecipitation (칩) 분석, microarray 연구 및 RNA-seq 등의 기술을 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. Dispase II 준비
- 준비 신선한 Hepes 버퍼 식염 (HBS) (50 밀리미터 Hepes / 코 산도 7.4, 150 MM NaCl).에게 16.8 ML Ultrapure H 2 O.으로 2 ML 0.5 M Hepes / 코 산도 7.4 및 1.2 ML 2.5 M NaCl을 추가
- 10 MG / ML Dispase II하십시오. 0.2 g Dispase II를 (로슈, 고양이 # 4942078001) 무게 20 ML HBS에 용해. 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 각각 Eppendorf 튜브 및 저장소에 1.0 ML의 aliquots를 준비합니다.
- 사용하기 전에 PBS에서 10 MG / ML Dispase II 1시 10분을 희석. 얼음에 희석 Dispase II를 놔.
2. 임신 여성에서 CD-1 E10.5의 태아를 해부
모든 동물 실험은 콜로라도 덴버의 대학 (UCD) 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행되었다. CD-1 (ICR) 마우스는 할란 연구소 (인디애나 폴리스, IN)에서 얻은되었습니다.
- 70 % 에탄올로 분해 공간 및 도구를 청소하십시오.
- approv을 사용하여 임신 CD-1 여성을 안락사시켜야에드 프로토콜.
- 70 % 에탄올로 복부를 뿌려서하면 다음 복부를 엽니 다. 자궁에서 mesometrium을 멀리 찢어 자궁과 다른 끌어 포셉 한 세트를 사용합니다. 몸에서 자궁을 제거합니다. 복부의 다른 쪽 자궁 뿔에 대해 반복합니다.
- 간단히 피를 씻어 10 cm 배양 접시에 얼음 차가운 PBS로 자궁을 씻어.
- 얼음 차가운 PBS로 새 페트리 접시에 자궁을 전송합니다. 주입 사이트 사이에서 절단하여 한 배아 조각으로 분리합니다.
- stereomicroscope 아래 얼음처럼 차가운 PBS에 하나 배아를 전송합니다. 난황 주머니에 배아를 노출 할 수있는 컷 사이트 중 하나에서 시작 자궁의 근육 벽을 찢어 고급 집게를 사용하십시오. 난황 주머니와 양막 보지. 얼음에 PBS로 6 cm 페트리 접시에 해부하는 배아를 전송합니다. 모든 배아는 이런 방식으로 수집 될 때까지 진행합니다.
3. Dispase II 치료
- 6 cm 배양 접시에있는 PBS 모든 배아를 씻으십시오. 교체PBS 10 ML 희석 Dispase II와 PBS. 25 분에 37 ° C에서 페트리 접시 및 배양을 커버 - 세균 배양기 나 따뜻한 방은 충분해야합니다 - 우리는이 단계의 CO 2 조직 문화 인큐베이터를 사용하지 않았습니다.
- 페트리 접시를 타고 stereomicroscope 아래의 배아를 관찰합니다. 외배엽이 느슨되고있는 것,이 조직 계층과 기본 mesenchyme 사이에 명확한 차이가 typified. 그렇지 않은 경우, 37에서 추가로 5 분 ° C.에 품다 그런 다음 얼음에 페트리 접시를 넣어.
4. 그대로 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부
- (VWR, 고양이 # 14672-380) 일회용 유리 피펫을 사용하여 stereomicroscope 미만 Dispase II는 6 cm 배양 접시에 얼음처럼 차가운 PBS로 배아를 취급 전송합니다.
- 배아를 개최 할 포셉 한 쌍의를 사용하십시오. 머리에 부착 된 얼굴 프로미넌스 prominences의 경계를 (그림 1의 경계를 표시자를주의 깊게 고급 집게의 또 다른 한 쌍의를 사용하여얼굴 프로미넌스 prominences). 하나 MnP의 측면, 다음 MxP, 그리고 마지막으로 FNP에서 시작합니다. 그대로 밖으로 얼굴 프로미넌스 prominences (그림 2A)를 해부하기 위해 반대쪽으로 동일한 작업을 수행.
5. Mesenchyme에서 별도의 얼굴 외배엽
- 3 배 작동 거리와 stereomicroscope 아래 얼굴 프로미넌스 prominences을 관찰합니다. 부드럽게 위아래로 5 배 얼굴 프로미넌스 prominences을 피펫하는 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 이 후, 외배엽으로 흩어져 용이합니다.
- 얼굴 프로미넌스 prominences을 보유 할 포셉 한 쌍의를 사용하십시오. 아주 천천히 외배엽에서 껍질에 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 그림 2B는 얼굴 외배엽의 분리 시트를 보여줍니다.
- 얼음에 PBS와 1.5 ML Eppendorf 튜브에 얼굴 외배엽를 전송하는 새로운 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 얼음에 PBS와 함께 또 다른 1.5 ML Eppendorf 튜브에 mesenchyme를 전송합니다.
- 각각의 해부를위한 새로운 얼음 차가운 PBS를 사용합니다. 샘플을 수집합니다.
- t을 씻으십시오PBS로 그는 샘플. 4 ° C, 3 분 500 XG에서 원심 분리기.
- 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 대기음. 샘플 칩 분석을 위해 사용됩니다 경우, 6.1 단계로 진행합니다. RNA 추출의 경우, 6.2 단계로 진행합니다. 단백질 추출의 경우, 6.3 단계로 진행합니다.
6. 또한 실험에 대한 공정 샘플
- 칩 분석을위한 샘플
- crosslink에 1 %의 포름 알데히드와 함께 1 ML PBS를 추가합니다. 샘플을 균질화.
- 회전 10 분 동안 실온에서 알을 품다.
- unreacted 포름 알데히드을 해소하기 위해 각 튜브에 1.25 M 글리신의 110 μl를 추가합니다.
- 섞어서 5 분 동안 실온에서 알을 품다.
- 3 분에 대해 4 ° C에서 500 XG에서 봐. 표면에 뜨는 제거합니다.
- 조직을 씻어 한 ML 차가운 PBS를 추가합니다.
- 3 분에 대해 4 ° C에서 500 XG에서 봐.
- PBS를 제거하고 PBS 한 번 씻어 반복합니다.
- 표면에 뜨는 제거, 액체 질소의 조직을 고정 스냅인을 종료합니다. SA를 저장-80 ° C에서 후속 풀링 및 처리를 위해 mples.
- RNA 추출을위한 샘플
- RNAlater (Ambion)를 포함하는 튜브의 얼굴 외배엽과 mesenchyme를 놓습니다.
- ° C는 조직의 철저한 침투를 허용 할 4에 박 RNAlater 솔루션에 샘플을 품다.
- 이후 풀링 및 처리를 위해 -20 ° C에서 저장합니다.
- 단백질 추출을위한 샘플
후속 처리를 위해 샘플에 용해 버퍼를 추가합니다. 또는 액체 질소의 조직을 동결 이런. -80 ° C에서 후속 풀링 및 처리를 위해 샘플을 저장합니다.
참고 사항
- 시간 제약. 을 통해 해부의 시작부터 제 6의 시작 부분에 4-6 시간을 계획합니다.
- 때 실력, 그것은 섹션 4와 5 (명성의 해부 및 외배엽 분리)를 수행하기 위해 배아 당 ~ 10-15 분 정도 소요됩니다.
- 샘플 RNA 분리, 모든 solutio에있는 경우N 먼저 Diethylpyrocarbonate로 치료해야합니다. 또한 포셉과 멀리 RNase있는 작업 공간을 청소.
- Dispase II 처리 및 dissections를 제외한 모든 시간에 얼음에 샘플을 보관. 해부에 사용 된 PBS 감기에 있는지 확인하기 위해 각 절개에 대한 새로운 얼음 차가운 PBS로 변경합니다.
- 샤프 포셉 정확한 절개를 얻을 중요합니다. 모든 오염을 방지하기 위해 완전히 포셉를 청소합니다.
- 다른 프로미넌스 prominences에서 샘플을 수집하기 위해 Dispase II 치료 후 각각 부각을 해부. 그런 다음 외배엽과 mesenchyme 구분합니다.
- Dispase II 치료 후 얼굴 외배엽이 흩어져 쉽게합니다. 다른 외배엽에서 오염에 특별한주의를 기울이십시오. 모든 잠재적으로 오염 된 조직을 폐기하십시오.
- 일단 샘플 제 6 항에서 해당 지점에 도달 할 때까지 멈추지 말고, 시작합니다. 얼굴 외배엽의 분리를 완료하고 최대한 빨리 할 수있는 한 모든 배아에 대한 mesenchyme.
- 전자Dispase II의 nzyme 활동은 일괄 및 브랜드 사이에 다를 수 있습니다. 이것은 다른 브랜드와 Dispase II의 배치에 대한 치료 시간을 조정할 필요가 있습니다.
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Representative Results
Dispase II 치료 후, 배아의 외배엽이 늘어 경향이있다. 얼굴 프로미넌스 prominences는 절개 (그림 2A) 후 그대로 있어야합니다. 격리 된 얼굴 외배엽는 명확하고 mesenchyme 조직 (그림 2B)은 무료입니다. 프로토콜의 효능을 결정하기 위해 우리는 forebrain에 대한 assayed 교차 오염을 감지 할 수 Zic3 9 ectodermal 특정 cdh1 5 역 transcriptase PCR을 사용하여 중간 엽 특정 sox10 10 표명했다. 우리의 연구는 얼굴 외배엽과 mesenchyme 모두 예상 유전자를 표현하고 교차 오염 (그림 3) 무료 있다고 확인했다.
1 그림. 개략도 마우스 E10.5 얼굴 프로미넌스 prominences을 보여줍니다. E10.5의 배아 헤드의 머리와 뱃 부리 장식이있는보기 (오른쪽)의 측면보기 (왼쪽). 레드 dotteD 라인 얼굴 프로미넌스 prominences의 경계를 나타냅니다. Frontonasal의 부각 (FNP), 턱의 부각 (MxP), Mandibular 부각 (MDP).
그림 2. 해부 전체 E10.5 얼굴 프로미넌스 prominences 및 얼굴 외배엽의 외관. (A) 전체 얼굴 프로미넌스 prominences. (B) 얼굴 외배엽. 패널은 A와 B는 같은 배율입니다. B에 넣고 패널 B의 얼굴 외배엽 중 하나의 높은 배율을 보여줍니다. Frontonasal의 부각 (FNP), 턱의 부각 (MxP), Mandibular 부각 (MDP).
그림 3. transcriptase PCR을 반대로 얼굴에 외배엽과 mesenchyme 모두 크로스 공동 무료입니다 확인ntamination. 총 RNA는 얼굴 외배엽 (E)와 mesenchyme (M)에서 추출되었다. RNA는 역 베타 고를 (B-고를), Zic3, cdh1 및 sox10의 표현을 감지하는 특정 프리 머와 PCR 다음의 보완 DNA (cDNA)로 베꼈습니다. 표 1의 프라이머 시퀀스는 프라이머 은행 (에서 얻은되었습니다 http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). PCR 제품은 2 % 아가로 오스 젤에 분리되었다. DNA의 사다리 (L).
| 유전자 | 프라이머 이름 | 시퀀스 | 제품 크기 |
| 베타 - 고를 | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 BP |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 BP |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| cdh1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 BP |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 BP |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
표 1. 프라이머 시퀀스.
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Discussion
이 프로토콜은 초기 Dispase II 치료 단계에 따라 배아 마우스 얼굴 외배엽과 mesenchyme을 분리 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 이전 연구에서, 우리는 이전 Dispase II 치료에 얼굴 프로미넌스 prominences의 절개를 수행했지만, 우리는 지속적으로 mesenchyme는 "끈적"과 조작이 더 어려워지고있는 것으로 나타났습니다. 새로운 프로토콜은이 문제를 방지합니다. 조합 Dispase II 아래로 pipetting과의 부드러운 물리적 인 힘과 치료 외배엽 쉽게 mesenchyme의 분리를합니다. 또한,이 프로토콜은 또한 짧은 Dispase II 트리트먼트로 사지 꽃 봉오리의 외배엽과 mesenchyme 등의 배아 외배엽과 mesenchyme 샘플의 분리에 적합합니다. 마찬가지로, 그것은 개발의 다른 단계에서 사용할 수 있습니다 - 예를 들어, 더 이상 Dispase II 트리트먼트 단계로 E11.5 얼굴 외배엽과 mesenchyme을 분리하십시오.
E10.5 마우스 얼굴 promin에서 얻은 표본의 크기줬어 아주 작고 따라서 우리는 결국 처리 및 분석을위한 배치를 저장하는 경향이 있습니다. 이러한 측면에서이 조직의 10 밀리그램을 얻기 위해 100-150 배아에서 수영장 ectodermal 샘플이 필요합니다. mesenchyme의 큰 금액이 필요로 적은 풀링 각 배아에서 파생됩니다. 칩 분석을위한 sonicated 게놈 DNA의 수율은 10 밀리그램 얼굴 외배엽에서 약 80 μg이다. 총 RNA의 수율은 10 밀리그램 얼굴 외배엽 당 20 μg이다. 비교 브래드 포드 단백질 분석에서, 우리는 10 밀리그램 얼굴 외배엽 당 1 MG 단백질까지 얻을 수 것으로 예상하고 있습니다. RNA, 염색질, 또는 단백질 샘플 손에되면, 그것들은 단백질 감지, 칩 분석, microarray 분석 및 RNA-seq 등 다양한 assays에 활용 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 차동 유전자 발현, epigenetic 수정 및 배아 발달 동안 얼굴 외배엽과 mesenchyme 사이의 분자 누화에 대한 책임 전사 인자 바인딩의 철저한 분석을 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 문서의 내용과 관련된 기타 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그림 1과 도움과 토론 연구소의 다른 회원 배아 헤드를 도시에 아이린 최 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 DE012728 (TW)에 의해 지원됩니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
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