Summary
En protokoll for separasjon av embryo ansikts ektoderm og mesenchyme er beskrevet. Vi bruker Dispase II til å behandle hele embryoer først, dissekere hele ansikts prominenser ut, og deretter skille ansikts ektoderm og mesenchyme.
Abstract
Orofacial kløfter er de hyppigste kraniofaciale defekter som påvirker 1,5 i 1000 nyfødte på verdensbasis 1,2. Orofacial clefting er forårsaket av unormal ansikts utvikling 3. Hos menneske og mus, innledende vekst og mønster av ansiktet avhengig flere små knopper av vev, ansikts prominenser 4,5. Ansiktet er avledet fra seks viktigste prominenser: sammenkoblede frontal nasal prosesser (FNP), overkjevens prominenser (MXP) og underkjevens prominenser (MDP). Disse prominenser består av hevelser i mesenchyme som er innkapslet i en overliggende epitel. Studier i flere arter har vist at signaliserer crosstalk mellom ansikts ektoderm og mesenchyme er kritisk for å forme ansiktet 6. Likevel er mekanistiske detaljer om gener som er involvert i disse signaliserer releer mangler. En måte å få en helhetlig forståelse av genekspresjon, transkripsjonsfaktor bindende, og kromatin merker forbundet med utvikledeping ansikts ektoderm og mesenchyme er å isolere og karakterisere de atskilte vev avdelinger.
Her presenterer vi en metode for å skille ansikts ektoderm og mesenchyme på embryonale dag (E) 10,5, en kritisk utviklingsstadiet i mus ansikts formasjon som står foran fusjon av prominenser. Vår metode er tilpasset fra den tilnærmingen vi tidligere har brukt for å dissekere ansikts prominenser 7. I denne tidligere studie hadde vi ansatt innavlet C57BL / 6 mus som denne belastningen har blitt en standard for genetikk, genomikk og ansikts morfologi 8. Her, skjønt, på grunn av mer begrensede mengder vev tilgjengelig, har vi utnyttet outbred CD-en belastning som er billigere å kjøpe, mer robust for reindrift, og tending å produsere flere embryoer (12-18) per kull enn noen innavlede mus stamme 8. Etter embryo isolasjon, ble nøytral protease Dispase II brukes til å behandle hele embryo. Deretter ble ansikts prominenser dissekereed ut, og ansikts ektoderm ble skilt fra mesenchyme. Denne metoden holder både ansikts ektoderm og mesenchyme intakt. Prøvene oppnådd ved hjelp av denne metodikken kan brukes for teknikker inkludert protein deteksjon, kromatin immunoutfelling (chip) assay, mikromatriser studier, og RNA-seq.
Protocol
1. Forbered Dispase II
- Tilberede ferske Hepes-bufret saltvann (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Tilsett 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 og 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml Ultrapure H 2 O.
- Gjør 10 mg / ml Dispase II. Vei 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) og oppløses i 20 ml HBS. Forbered 1,0 ml alikvoter i enkelte Eppendorf-rør og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring.
- Fortynn 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS før bruk. Sett utvannet Dispase II på isen.
2. Dissekere CD-en E10.5 embryo fra gravide kvinner
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med protokoller godkjent av Universitetet i Colorado Denver (UCD) Animal Care og bruk komité. CD-1 (ICR) mus ble oppnådd fra Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Rengjør disseksjon området og verktøy med 70% etanol.
- Avlive gravid CD-en kvinnelig bruker approved protokoller.
- Spray magen med 70% etanol og deretter åpne magen. Bruke ett sett av tang til å trekke livmor og en annen for å rive bort mesometrium fra livmor. Fjerne livmor fra kroppen. Gjenta for livmor horn på andre siden av magen.
- Kort skylle livmoren med iskald PBS i en 10-cm petriskål å vaske ut blod.
- Overfør livmoren inn i en ny petriskål med iskald PBS. Del den opp i ett embryo fragmenter ved å kutte mellom implantasjoner.
- Overfør ett embryo i iskald PBS under en stereomikroskop. Bruke fine pinsett for å rive av den muskulære veggen av livmor starter på en av de snitt steder å avsløre embryoet med plommesekken. Trekk av plommesekken og amnion. Overfør dissekerte embryo til en 6-cm petriskål med PBS på isen. Fortsette før alle embryoer er samlet på denne måten.
3. Dispase II Behandling
- Vask alle embryoer med PBS i en 6-cm petriskål. ErstattPBS med 10 ml fortynnet Dispase II i PBS. Dekk petriskål og inkuber ved 37 ° C i 25 min - en bakteriell inkubator eller varmt rom bør nok - vi ikke har brukt en CO 2 vevskultur inkubator for dette trinnet.
- Ta petriskål ut og observere embryoet under en stereomikroskop. Ektoderm burde blitt løst, preget av et tydelig gap mellom dette vevet lag og underliggende mesenchyme. Hvis ikke, inkuberes i en ytterligere 5 min ved 37 ° C. Deretter sette petriskål på isen.
4. Dissekere ut Intakte Facial prominenser
- Bruk en engangs glass pipette (VWR, Cat # 14672-380) å overføre én Dispase II behandlet embryo i iskald PBS i en 6-cm petriskål under en stereomikroskop.
- Bruk en pinsett til å holde fosteret. Bruk et annet par av fine pinsetter nøye å kutte grensene av ansikts prominenser festet til hodet (Figur 1 viser grensene foransikts prominenser). Start fra den ene siden av MNP, deretter MXP, og varer FNP. Gjør det samme på den andre siden å dissekere ansikts prominenser ut intakt (figur 2A).
5. Separat Facial ektoderm fra mesenchyme
- Observere ansikts prominenser under en stereomikroskop med 3x arbeidsavstand. Bruk en lang glass Pasteur pipette å forsiktig pipettere ansikts prominenser opp og ned 5 ganger. Etter dette er ektoderm lett å skrelle av.
- Bruk en pinsett til å holde ansikts prominenser. Bruk den andre pinsett å skrelle av ektoderm veldig sakte. Figur 2B viser de atskilte ark med ansikts ektoderm.
- Bruk en ny lang glass Pasteur pipette til å overføre ansikts ektoderm i en 1,5 ml Eppendorf tube med PBS på is. Overfør mesenchyme til en annen 1,5 ml Eppendorf-rør med PBS på isen.
- Bruk ny iskald PBS for hver disseksjon. Samle inn prøver.
- Vask than prøver med PBS. Sentrifuger ved 4 ° C, 500 xg i 3 min.
- Aspirer PBS ved hjelp av lange glass Pasteur pipetter. Hvis prøvene skal brukes for chip analysen, går du videre til trinn 6.1. For RNA utvinning, gå videre til trinn 6.2. For Protein utvinning, gå videre til trinn 6.3.
6. Prosess Prøver for videre eksperimentering
- Prøver for ChIP analysen
- Tilsett 1 ml PBS med 1% formaldehyd til kryssbindende. Homogenisere prøvene.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 min med rotasjon.
- Legg 110 pl 1,25 M Glysin til hvert rør for å slukke ureagert formaldehyd.
- Bland og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Spinne ved 500 xg ved 4 ° C i 3 min. Fjern supernatant.
- Tilsett 1 ml kaldt PBS for å vaske vevet.
- Spinne ved 500 xg ved 4 ° C i 3 min.
- Fjern PBS og gjenta PBS vask en gang.
- Fjern supernatant, Snap fryse vevet i flytende nitrogen. Oppbevar samples ved -80 ° C for senere pooling og behandling.
- Prøver for RNA ekstraksjon
- Plasser ansikts ektoderm og mesenchyme i rør som inneholder RNAlater (Ambion).
- Inkuber prøvene i RNAlater Solution natten ved 4 ° C for å tillate god inntrengning av vev.
- Oppbevares ved -20 ° C for senere pooling og behandling.
- Prøver for protein utvinning
Legg lyseringsbuffer til prøven for påfølgende behandling. Eller snap fryse vevet i flytende nitrogen. Oppbevar prøvene ved -80 ° C for etterfølgende pooling og prosessering.
Merknader
- Tidspress. Tenkt på 4-6 timer fra starten av disseksjon gjennom til begynnelsen av § 6.
- Når dyktig, tar det ~ 10-15 minutter per embryo for å utføre § § 4 og 5 (prominence disseksjon og ektoderm separasjon).
- Hvis prøvene er for RNA isolering, hver solution skal behandles med Diethylpyrocarbonate først. Også rengjøre pinsett og arbeidsområde med RNase Away.
- Holde prøvene på is til enhver tid, bortsett fra for den Dispase II behandling og disseksjoner. Bytt til ny iskald PBS for hver disseksjon for å sikre at PBS brukes til disseksjon er kaldt.
- Skarpe tang er avgjørende for å oppnå nøyaktig disseksjon. Rengjør tang helt å hindre forurensning.
- For prøvetaking fra ulike prominenser, dissekere hvert prominence separat etter Dispase II behandling. Deretter skille ektoderm og mesenchyme.
- Etter behandling med Dispase II, er ansikts ektoderm lett å skrelle av. Vær spesielt oppmerksom på forurensning fra andre ektoderm. Kast alle potensielt forurenset vev.
- Når du starter, stopper ikke før prøvene kommer riktig punkt i § 6. Fullfør separasjon av ansikts ektoderm og mesenchyme for alle embryoene så raskt som mulig.
- Enzyme aktiviteter Dispase II kan være forskjellig mellom partier og merkevarer. Det er nødvendig å justere behandlingen tid for ulike merker og grupper av Dispase II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter Dispase II behandling, har en tendens ektoderm av embryoet å være løs. Ansikts prominenser skal være intakt etter disseksjon (figur 2A). Den isolerte ansikts ektoderm er klar og fri for mesenchyme vev (figur 2B). Å bestemme effekten av protokollen, og å oppdage krysskontaminering vi analysert for forebrain uttrykt Zic3 9, ectodermal spesifikk cdh1 5 og mesenchymale spesifikk sox10 10 bruker revers transkriptase PCR. Våre studier bekreftet at både ansikts ektoderm og mesenchyme uttrykte de forventede gener og var fri for krysskontaminering (figur 3).
Figur 1. Skjematisk diagram som viser mus E10.5 ansikts prominenser. Lateral utsikt (til venstre) av hodet og rostral visning (til høyre) fra E10.5 embryo hodet. Red dotted linjene indikerer grensen av ansikts prominenser. Frontonasal prominence (FNP), maxillaris prominence (MXP), mandibulære prominence (MDP).
Figur 2. Utseende av dissekert hele E10.5 ansikts prominenser og ansikts Ektoderm. (A) Hele ansikts prominenser. (B) Facial Ektoderm. Panelene A og B er samme forstørrelse. Sett i B viser høyere forstørrelse av en av ansikts ektoderm i panel B. Frontonasal prominence (FNP), maxillaris prominence (MXP), mandibulære prominence (MDP).
Figur 3. Reverstranskriptase PCR bekreftet at både ansikts ektoderm og mesenchyme er fri for kryss contamination. total RNA ble ekstrahert fra ansikts ektoderm (E) og mesenchyme (M). RNA ble revers transkribert til sin komplementære DNA (cDNA), etterfulgt av PCR med spesifikke primere for å detektere ekspresjon av beta-aktin (B-aktin), Zic3, cdh1 og sox10. Primeren sekvensene i Tabell 1 ble oppnådd fra primer bank ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). PCR produkter ble separert på en 2% agarosegel. DNA Stige (L).
| Gene | Primer navn | sekvenser | Produkt størrelse |
| Beta-aktin | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| cdh1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabell 1. Primer sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en grei metode for å skille embryonale mus ansikts ektoderm og mesenchyme basert på en første Dispase II behandling trinn. I tidligere studier har vi utført disseksjon av ansikts prominenser før Dispase II behandling, men vi har stadig funnet at mesenchyme blir "sticky" og vanskeligere å manipulere. Vår nye protokollen eliminerer dette problemet. Kombinasjon Dispase II behandling med mild fysisk makt ved å pipettere opp og ned gjør separasjon av ektoderm og mesenchyme enklere. Videre arbeider denne protokollen også godt for separasjon av andre embryonale Ektoderm og mesenchyme prøver, for eksempel lem bud ektoderm og mesenchyme med kortere Dispase II behandling. Likeledes kan det benyttes på andre stadier av utviklingen - for eksempel, for separering E11.5 ansikts ektoderm og mesenchyme med en lengre Dispase II behandlingstrinn.
Størrelsen på utvalget hentet fra en E10.5 mus ansikts prominhet er ganske liten, og derfor har vi en tendens til å lagre grupper for slutt behandling og analyse. I dette henseende er det nødvendig å pool ectodermal prøver 100-150 embryo å skaffe 10 mg vev. En større mengde av mesenchyme er avledet fra hver embryo krever mindre pooling. Utbyttet av sonicated genomisk DNA for ChIP analysen er ca 80 ug fra 10 mg ansikts ektoderm. Den totale RNA avkastning er ca 20 ug per 10 mg ansikts ektoderm. Fra en komparativ Bradford protein assay, anslår vi at vi kan få opp til 1 mg protein per 10 mg ansikts ektoderm. Når RNA, kromatin eller proteinprøver er i hånden, kan de benyttes for en rekke tester, inkludert protein deteksjon, chip analysen, microarray analyse, og RNA-seq. Derfor gjør denne protokollen en grundig analyse av differensial genuttrykk, epigenetic endring, og transkripsjon faktor bindende ansvarlig for molekylær crosstalk mellom ansikts ektoderm og mesenchyme under embryonal utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser eller andre konflikter knyttet til innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Irene Choi for å illustrere embryo hoder i Fig 1 og de andre medlemmene av laboratoriet for å få hjelp og diskusjon. Dette arbeidet støttes av NIH stipend DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
