Summary
外胚层和间充质细胞的胚胎面部分离的协议。我们使用的是中性蛋白酶II对待整个胚胎首先，剖析整个面部突起，然后分离的面部外胚层和间充质细胞。
Abstract
口面裂是最常见的颅面畸形，从而影响1.5在1000新生儿全球1,2。颜面部clefting引起的脸部发育异常3。在人类和小鼠中，最初的增长和图案的脸依赖于几个小芽组织，面部突起4,5。面对来自6个主要的日珥：配对正面的鼻流程（FNP），上颌骨突起（MXP）和下颌骨突起（MDP）。这些日珥包括装在覆上皮细胞肿胀，间质细胞，。在多个物种的研究表明，信号之间的串扰面部外胚层和间充质是至关重要的塑造脸部6。然而，机械的细节关于这些信号继电器中所涉及的基因所缺乏的。的方式来获得一个全面的了解基因表达的转录因子结合，及相关的染色质标记的开发与平面外胚层和间充质细胞的分离和鉴定分离的组织车厢。
在这里，我们提出了一个方法，分离面外胚层和间充质细胞在胚胎天（E）10.5鼠标的面部的形成，融合的日珥之前，一个关键的发展阶段。我们的方法是适用的方法，我们以前用于解剖面部突起7。在这个早期的研究中，我们采用近交系C57BL / 6小鼠作为这株已成为标准的遗传学，基因组学和面部形态。在这里，虽然，由于可用组织更有限的数量，我们已利用远交的CD-1菌株，购买更便宜，更健壮的畜牧业，并趋向于产生更多的胚胎（12-18）比任何自交系每窝小鼠品系8。在胚胎隔离，中性蛋白酶中性蛋白酶用于治疗II全胚胎。然后，面部突起剖析编出来，面部外胚层分离的间充质细胞。这种方法保持完整的面部外胚层和间质。可用于蛋白质检测，染色质免疫沉淀法（ChIP）的检测，基因芯片的研究，和RNA-seq的技术，包括使用这种方法获得的样品。
Protocol
1。准备Dispase酶II
- 制备新鲜的盐水（HBS）的Hepes缓冲液（50mM HEPES / KOH pH为7.4，150mM的NaCl）。添加到16.8毫升超纯水H 2 O 2毫升0.5 M羟乙基哌嗪/ KOH pH值7.4和1.2毫升2.5 M氯化钠
- 10毫克/毫升中性蛋白酶II。中性蛋白酶称取0.2 g II（罗氏，猫＃4942078001），和溶于20毫升哈佛商学院。准备在个别的Eppendorf管中并储存在-20℃的1.0毫升等分试样用于长期存储。
- 10毫克/毫升的中性蛋白酶II 1:10在PBS中稀释后再使用。将稀释后的中性蛋白酶II冰。
2。解剖CD-1的E10.5胚胎发育从怀孕的女
所有的动物实验，按照美国科罗拉多州丹佛大学（UCD）动物护理和使用委员会批准的协议。 CD-1（ICR）小鼠由哈伦实验室（印第安纳波利斯，IN）。
- 用70％乙醇清洁解剖区域和工具。
- 安乐死怀孕CD-1女批准编辑协议。
- 腹部喷用70％的乙醇，然后再打开腹部。使用一组产钳拉子宫，另一个系膜及子宫撕裂。从身体中取出子宫。重复另一侧子宫角的腹部。
- 简单地用冰冷的PBS冲洗子宫，在10厘米的培养皿中洗出的血液。
- 子宫转移到一个新的培养皿中，用冰冷的PBS。独立成一个胚胎碎片切割之间植入部位。
- 在立体显微镜下，转移到冰冷的PBS中的一个胚胎。用细镊子撕断子宫肌壁的切割位点暴露的胚胎卵黄囊开始在。卵黄囊和羊膜剥离。解剖胚胎转移到6厘米的陪替氏培养皿，用PBS在冰上。继续，直到所有的胚胎已经以这种方式收集。
3。中性蛋白酶II处理
- 洗，PBS 6厘米的培养皿中的胚胎。更换PBS用10毫升在PBS中稀释的中性蛋白酶II。覆盖培养皿中，在37°C孵育25分钟-一个细菌培养箱或温暖的房间应该足够了-我们还没有使用的CO 2组织培养的孵化器这一步。
- 培养皿中，在立体显微镜下观察胚胎。外胚层的应变得松散，此组织层和底层的间充质细胞为代表的一个明确的差距。如果没有，一个额外的5分钟，在37℃下孵育然后把培养皿放在冰块上。
4。解剖出完整的面部日珥
- 使用一次性的玻璃吸管（VWR目录号14672-380） 传送1 Dispase酶II处理胚胎到冰冷的PBS中在6厘米的陪替氏培养皿，在立体显微镜下
- 用一个钳子持有的胚胎。使用另一对细钳子仔细切割，附着在鱼头面部日珥（ 图1示出的边界的边界面部突起）。从MnP的一侧的，那么MXP，和最后的FNP开始。到另一侧做同样的解剖出完整的面部突起（ 图2A）。
5。独立的脸外胚层分化而来间充质
- 3倍工作距离体视显微镜下观察面部的突起。使用长玻璃巴斯德吸管轻轻地移液的面部突起向上和向下的5倍。在此之后，外胚层易于剥离。
- 用一个钳子持有的面部突起。使用其他对镊子剥离外胚层非常缓慢。 图2B示出面部外胚层分离的片材。
- 使用一个新的长玻璃巴斯德吸管面部外胚层转移到1.5 ml Eppendorf管中，用PBS在冰上。的间充质细胞转移到另一个1.5 ml Eppendorf管中，用PBS在冰上。
- 使用新的冰冷的PBS为每个解剖。收集样本。
- 洗净吨他样品用PBS。离心机在4℃，500×g离心3分钟。
- 使用长玻璃巴氏吸管吸取PBS。如果用于芯片检测样品，进行步骤6.1。对于RNA的提取，进行步骤6.2。对于蛋白质的提取，进行步骤6.3。
6。进一步的实验过程中样品
- ChIP实验样品
- 加入1毫升的PBS，用1％甲醛的交联。均质样品。
- 与旋转的10分钟，在室温下孵育。
- 在每个管中加入110微升的1.25M的甘氨酸，淬灭未反应的甲醛。
- 混合，并在室温下孵育5分钟。
- 附带在4℃下在500×g离心3分钟。除去上清液。
- 加入1ml冷PBS到洗的组织。
- 附带在4℃下在500×g离心3分钟。
- 删除PBS和重复PBS洗一次。
- 去除上清液，糟糕冻结组织在液氮中。存储SAmples在-80℃下为后续池和处理。
- 样品提取RNA
- 将面部外胚层和间充质在RNAlater溶液（Ambion公司），管中含有。
- 孵育在RNAlater溶液4℃过夜，以允许彻底渗透的组织样本。
- 随后池和处理在-20℃下储存。
- 蛋白提取样品
裂解缓冲液加入到样品中，供后续处理。急速冷冻在液氮中的组织。将样品储存在-80℃下为后续池和处理。
笔记
- 时间限制。计划在4-6小时，从一开始就通过解剖开始的第6条。
- 当精通，约需10-15分钟，每胚胎执行第4和第5（突出解剖和外胚层分离）。
- 如果样品是RNA分离，每个搜寻解决方案n应该被视为第一焦碳酸二乙酯。同时清洁钳和工作区用RNase客场。
- Dispase酶II的治疗和解剖除了冰在任何时候都保持样品。每个解剖，以确保用于解剖的PBS是冷的，切换到新的冰冷的PBS。
- 夏普的的镊子是关键，以获得精确的解剖。完全清洁的钳子，以防止任何污染。
- 从不同的日珥收集样本，分别剖析每一个突出中性蛋白酶II处理后。然后分离外胚层和间充质细胞。
- 治疗后中性蛋白酶II，面部外胚层容易脱落。要特别注意从其他外胚层污染。放弃所有可能受污染的组织。
- 一旦你开始，不要停止直到样品达到第6章中的适当位置。完成所有的胚胎分离的面部外胚层和间充质迅速，你可以。
- 电子nzyme，Dispase酶II的活动可能会有所不同批次之间和品牌。这是必要的，调整的处理时间为不同品牌和批次的中性蛋白酶II。
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Representative Results
中性蛋白酶II处理后的胚胎的外胚层往往是松散的。经过解剖（ 图2A）的面部突起应该是完整的。孤立的面部外胚层是明确的，免费的间充质组织（ 图2B）。的协议，以确定疗效和检测交叉污染检测前脑表达Zic3 9，外胚层具体的CDH1和间质特定的SOX10 10采用逆转录聚合酶链反应。我们的研究证实，这两个面部外胚层和间充质细胞表达预期的基因和无交叉污染（ 图3）。
图1。示意图小鼠E10.5面部突起。横向视图（左）E10.5胚胎头的头部和喙视图（右）。红dotted线指示的面部日珥的边界。额鼻突出（FNP），上颌骨的突出（MXP），下颌突出（MDP）。
图2。解剖整个的E10.5面部突起和面部外胚层的外观。（A）整个面部突起。（B）面部外胚层。 A组和B是相同的放大倍率。插入在 B显示出更高的放大倍率的一个面板 B的面部外胚层。额鼻突出（FNP），上颌骨的突出（MXP），下颌突出（MDP）。
图3。逆转录PCR证实，对面部外胚层和间质的交叉合作ntamination。提取总RNA，从面部的外胚层（E）和间充质细胞（M）。将RNA反转录成互补DNA（cDNA），然后与特异性引物，通过PCR来检测表达的β-肌动蛋白（B-肌动蛋白），Zic3，CDH1，SOX10。于表1中的引物序列，得到从底漆的银行（ http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ）。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离。 DNA梯（L）。
| 基因 | 引物名称 | 序列 | 产品尺寸 |
| β-肌动蛋白 | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' | 154基点 |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3' | 138基点 |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3' | 175基点 |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3' | ||
| SOX10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3' | 165基点 |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3' |
表1中。引物序列。
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Discussion
该协议提供了一个简单的方法来分离面部小鼠胚胎外胚层和间充质的基础上Dispase酶II的初步处理步骤。在以前的研究中，我们进行了解剖的面部突起之前，中性蛋白酶II处理，但我们一直发现，间充质变成“粘”，更难以操纵。我们的新的协议，避免了这个问题。结合中性蛋白酶II处理与柔和的身体的力量，通过上下吹打分离的外胚层和间充质更容易。此外，该协议还可以很好地用于分离的胚胎外胚层和间充质样品，如肢芽外胚层和间充质较短的中性蛋白酶II处理。同样地，它也可以被用来在其他阶段的发展 - 例如，用于分离E11.5面部外胚层和间充质细胞与较长的Dispase酶II处理工序。
获得，从E10.5鼠标面部PROMIN的样本大小ence是相当小的，因此，我们倾向于存储批次的最终处理和分析。在这方面，它是必要的池外胚层样品从100-150的胚胎，得到10毫克的组织。一个更大的量的间充质细胞，是来自每个胚胎需要较少的池。超声波处理的基因组DNA芯片检测的收益率大约是80微克，10毫克的面部外胚层。总RNA的产量大约是20微克每10毫克面部外胚层。从比较Bradford蛋白测定，我们估计，我们可以得到1毫克蛋白质每10毫克面部外胚层。一旦RNA，染色质，或蛋白质样品在手，它们可以被用于许多分析，包括蛋白的检测，ChIP实验，微阵列分析，和RNA-seq的。因此，该协议实现了透彻的分析差异表达基因，表观遗传修饰和转录因子结合面部外胚层和间充质细胞在胚胎发育过程的分子之间的串扰负责。
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Disclosures
作者有没有利益冲突或其他冲突与本文内容相关的。
Acknowledgments
作者要感谢艾琳在图1和实验室的其他成员的帮助和讨论，说明胚胎头彩。这项工作是由美国国立卫生研究院授予DE012728（TW）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
