Summary
En protokol til adskillelse af foster facial ektoderm og mesenkym er beskrevet. Vi bruger Dispase II til behandling af hele embryoner først, dissekere hele ansigtet Fremspring ud, og derefter adskille facial ektoderm og mesenkym.
Abstract
Orofacial kløfter er de mest hyppige kraniofaciale defekter, som påvirker 1,5 ud af 1.000 nyfødte på verdensplan 1,2. Orofaciale clefting er forårsaget af unormal facial udvikling 3. I human og mus, initial vækst og mønsterdannelse af ansigtet er afhængig af flere små knopper af væv, ansigtets Fremspring 4,5. Ansigtet er afledt af seks store Fremspring: parrede frontal nasale processer (FNP), kaebe Fremspring (MXP) og mandiblens fremspring (MDP). Disse fremspring består af hævelse af mesenkym der er indkapslet i et overliggende epitel. Undersøgelser hos flere arter har vist, at signalering krydstale mellem facial ektoderm og mesenkym er kritisk for at forme flade 6. Alligevel er mekanistiske detaljer vedrørende generne involveret i disse signal-relæer mangler. En måde at få en bred forståelse af genekspression, transkriptionsfaktor bindende, og kromatin mærker i forbindelse med udvikping facial ektoderm og mesenkym er at isolere og karakterisere de adskilte væv rum.
Her præsenteres en fremgangsmåde til adskillelse facial ektoderm og mesenkym på fosterdag (E) 10,5, en kritisk udviklingsstadiet i mus facial formation, der går forud for smeltning af Fremspring. Vores metode er tilpasset fra den tilgang, vi tidligere har brugt til dissekering ansigtet Fremspring 7. I denne tidligere undersøgelse havde vi ansat indavlede C57BL / 6 mus som denne stamme er blevet en standard for genetik, genomforskning og i ansigtet morfologi 8. Her dog, på grund af de mere begrænsede mængder af væv til rådighed, har vi udnyttet den udavlet CD-1-stamme, der er billigere at købe, mere robust for dyrehold, og har tendens til at producere flere embryoner (12-18) per kuld end nogen indavlet musestamme 8. Efter embryo isolation blev neutral protease Dispase II til behandling af hele embryo. Derefter blev facial Fremspring dissekereed ud, og den facial ektoderm blev separeret fra mesenkym. Denne metode holder både ansigts ektoderm og mesenkym intakt. Prøverne opnået under anvendelse af denne metode kan anvendes til teknikker, herunder proteindetektion, chromatin immunoprecipitation (chip) assay, microarray undersøgelser, og RNA-seq.
Protocol
1. Forbered Dispase II
- Fremstilles frisk Hepes-pufret saltvand (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCI). Tilsæt 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 og 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml ultrarent H 2 O.
- Lav 10 mg / ml Dispase II. Afvej 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) og opløses i 20 ml HBS. Forbered 1,0 ml aliquots i individuelle Eppendorf-rør og opbevares ved -20 ° C for langtidsopbevaring.
- Fortynd 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS før brug. Sæt den fortyndede Dispase II på is.
2. Dissekere CD-1 E10.5 Fostre fra drægtige
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af University of Colorado Denver (UCD) Animal Care og brug Udvalg. CD-1 (ICR) mus blev opnået fra Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Rens dissektion område og værktøjer med 70% ethanol.
- Aflive gravid CD-1 kvinde med godkened protokoller.
- Spray maven med 70% ethanol derefter åbne maven. Brug ét sæt pincet til at trække livmoderen og en anden til rive mesometrium fra livmoderen. Fjerne livmoderen fra kroppen. Gentag for uterushorn på anden side af maven.
- Kortvarigt skyl livmoderen med iskoldt PBS i en 10 cm petriskål at udvaske blod.
- Overfør livmoderen til en ny petriskål med iskoldt PBS. Separat ind i en embryo-fragmenter ved at skære mellem implantationssteder.
- Overfør ét embryon i iskold PBS under et stereomikroskop. Anvende fine tænger til at afrive den muskulære væg af livmoderen begyndende ved en af de afskårne sider for at udsætte foster med blommesækken. Træk blommesækken og amnion. Overførsel dissekeret embryo til en 6 cm petriskål med PBS på is. Fortsæt, indtil alle embryoner er blevet indsamlet på denne måde.
3. Dispase II Behandling
- Vask de embryoner med PBS i en 6 cm Petri-skål. ErstatPBS med 10 ml fortyndet Dispase II i PBS. Dæk petriskålen og inkuberes ved 37 ° C i 25 min - en bakteriel inkubator eller varmt rum burde være nok - vi har ikke brugt en CO 2 vævskulturinkubator til dette skridt.
- Tag petriskålen ud og observere embryo under et stereomikroskop. Den ectoderm burde have løsnet sig, karakteriseret ved et tydeligt skel mellem dette væv lag og det underliggende mesenkym. Hvis ikke, inkuberes i yderligere 5 minutter ved 37 ° C. Derefter sætte petriskålen på is.
4. Dissekere de Intakte Facial Fremspring
- Brug en engangs glas pipette (VWR, Cat # 14.672-380) at overføre en Dispase II behandlede embryoer i iskold PBS i en 6 cm petriskål under et stereomikroskop.
- Benytte en pincet til at holde embryo. Brug et andet par fine pincet til at skære grænserne for de ansigtstræk Fremspring knyttet til hoved (Figur 1 viser grænserne foransigtets Fremspring). Starter fra den ene side af MnP, så MXP, og sidst FNP. Gør det samme til den anden side for at dissekere ansigtets Fremspring ud intakt (figur 2A).
5. Separat Facial ektoderm fra mesenkym
- Overhold ansigtets Fremspring under et stereomikroskop med 3x arbejdsafstand. Brug en lang glas Pasteur pipette til forsigtigt pipettere ansigtets Fremspring op og ned 5 gange. Herefter er den ectoderm let at skalle af.
- Brug en tang til at holde ansigtet Fremspring. Bruge den anden tang at skrælle ektoderm meget langsomt. Figur 2B viser de adskilte ark af ansigtet ektoderm.
- Anvend en ny lang glas Pasteur-pipette for at overføre facial ektoderm i et 1,5 ml Eppendorf-rør med PBS på is. Overfør mesenkym til et andet 1,5 ml Eppendorf-rør med PBS på is.
- Brug den nye iskold PBS for hver dissektion. Indsamle prøver.
- Vask than prøver med PBS. Der centrifugeres ved 4 ° C, 500 x g i 3 min.
- Aspirer PBS med lange glas Pasteur-pipetter. Hvis prøverne skal bruges til CHIP assay, gå videre til trin 6,1. For RNA ekstraktion, skal du fortsætte til trin 6,2. For Protein ekstraktion, gå videre til trin 6,3.
6. Proces Prøver til yderligere eksperimenter
- Prøver til CHIP assay
- Tilsæt 1 ml PBS med 1% formaldehyd til tværbinding. Homogeniser prøverne.
- Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter med rotation.
- Tilsættes 110 pi af 1,25 M glycin til hvert rør for at standse uomsat formaldehyd.
- Bland og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Spin ved 500 x g ved 4 ° C i 3 minutter. Fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 ml kold PBS at vaske vævene.
- Spin ved 500 x g ved 4 ° C i 3 minutter.
- Fjern PBS og gentag PBS vaskes én gang.
- Fjern supernatant, surt fryse væv i flydende nitrogen. Opbevar samples ved -80 ° C til efterfølgende pooling og forarbejdning.
- Prøver til RNA-ekstraktion
- Placer facial ektoderm og mesenkym i rør indeholdende RNAlater (Ambion).
- Inkuber prøverne i RNAlater opløsning natten over ved 4 ° C for at tillade grundig gennemtrængning af vævet.
- Opbevar ved -20 ° C til efterfølgende samling og bearbejdning.
- Prøver til proteinekstraktion
Læg lysepuffer til prøven for efterfølgende behandling. Eller snap fryse væv i flydende nitrogen. Opbevare prøverne ved -80 ° C til efterfølgende samling og bearbejdning.
Noter
- Tidsbegrænsninger. Planlæg på 4-6 timer fra starten af dissektion frem til begyndelsen af afsnit 6.
- Når dygtige, det tager ~ 10-15 min pr foster til at udføre afsnit 4 og 5 (fremtrædende dissektion og ectoderm separation).
- Hvis prøverne er for RNA-isolering, hver Solution bør behandles med diethylpyrocarbonat først. Også rense pincet og arbejdsområdet med RNase Away.
- Holde prøverne på is hele tiden bortset fra Dispase II behandling og dissektioner. Skift til ny iskold PBS for hver dissektion for at sikre, PBS, der anvendes til dissektion er kold.
- Skarpe pincet er afgørende for at opnå præcis dissektion. Rens pincet fuldstændigt for at forhindre enhver forurening.
- Til indsamling af prøver fra forskellige Fremspring, dissekere hver fremtrædende separat efter Dispase II behandling. Derefter adskille ectoderm og mesenkym.
- Efter behandling med Dispase II, er ansigtets ektoderm let at skalle af. Vær særlig opmærksom på forurening fra andre ektoderm. Kassér alle potentielt forurenede væv.
- Når du starter, stopper ikke før prøverne når det pågældende punkt i afsnit 6. Finish adskillelse af ansigtet ektoderm og mesenkym for alle embryoner så hurtigt som du kan.
- Den enzyme aktiviteter Dispase II kan være anderledes mellem partier og brands. Det er nødvendigt at justere behandlingstiden for forskellige mærker og partier af Dispase II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter Dispase II behandling tendens til, at ectoderm af embryonet til at være løst. Ansigtets fremspring skal være intakt efter dissektion (figur 2A). Det isolerede facial ektoderm er klar og fri for mesenkym væv (figur 2B). For at bestemme effektiviteten af protokollen og for at opdage krydskontaminering vi analyseret for forhjerne udtrykte Zic3 9, ectodermal specifik CDH1 5 og mesenchymal specifik sox10 10 under anvendelse af revers transkriptase PCR. Vore studier bekræftede, at både facial ektoderm og mesenkym udtrykte de forventede gener og var fri for krydskontaminering (figur 3).
Figur 1. Skematisk diagram, der viser muse E10.5 ansigts Fremspring. Sidebillede (venstre) af hovedet og rostrale visning (til højre) i E10.5 embryo hovedet. Red Dotted linjer angiver grænsen af ansigtets Fremspring. Frontonasal fremtrædende (FNP), maxillær fremtrædende (MXP), Mandibular fremtrædende (MDP).
Figur 2. Udseende af dissekerede hele E10.5 ansigts Fremspring og ansigtet ectoderm. (A) Hele ansigtet Fremspring. (B) Facial ectoderm. Panel A og B er samme forstørrelse. Indsættes i B viser større forstørrelse af en af de facial ektoderm i panel B. Frontonasal fremtrædende (FNP), maxillær fremtrædende (MXP), Mandibular fremtrædende (MDP).
Figur 3. Revers transkriptase PCR bekræftede, at både facial ektoderm og mesenkym er fri for cross contamination. Totalt RNA blev ekstraheret fra ansigtet ektoderm (E) og mesenkym (M). RNA'et blev revers transkriberet til dets komplementære DNA (cDNA), efterfulgt af PCR med specifikke primere til påvisning af ekspression af beta-actin (B-actin), Zic3, CDH1 og sox10. Primersekvenserne i tabel 1 blev opnået fra primer bank ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). PCR-produkterne blev separeret på en 2% agarosegel. DNA Ladder (L).
| Gene | Primer navn | sekvenser | Product størrelse |
| Beta-actin | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabel 1. Primersekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en enkel metode til at skille embryonale muse facial ektoderm og mesenkym baseret på en initial Dispase II behandlingstrin. I tidligere undersøgelser er der udført dissektion af ansigtets Fremspring før Dispase II behandling, men vi konsekvent har vist sig, at mesenkym bliver "klæbrige" og vanskeligere at manipulere. Vores nye protokol undgår dette problem. Kombinationen Dispase II behandling under forsigtig fysisk kraft ved at pipettere op og ned gør adskillelse af ektoderm og mesenkym lettere. Endvidere er denne protokol fungerer også godt til adskillelse af andre embryonale ektoderm og mesenkym prøver, såsom lem-knop ektoderm og mesenkym med kortere Dispase II behandling. Tilsvarende kan den anvendes på andre stadier i udviklingen - for eksempel til adskillelse af E11.5 facial ektoderm og mesenkym med en længere Dispase II behandlingstrin.
Prøvestørrelsen opnået fra en E10.5 mus facial prominning er ganske lille, og derfor er vi tilbøjelige til at gemme partier for tiden bearbejdning og analyse. I denne henseende er det nødvendigt at samle ektodermal prøver 100-150 embryoer til opnåelse af 10 mg af væv. En større mængde af mesenkym er afledt fra hvert foster kræver mindre pooling. Udbyttet af sonikeret genomisk DNA til CHIP assay er ca 80 ug fra 10 mg ansigtet ektoderm. Det totale RNA Udbyttet er omkring 20 ug per 10 mg facial ektoderm. Fra en komparativ Bradford proteinassay estimerer vi, at vi kan få op til 1 mg protein per 10 mg facial ektoderm. Når RNA, chromatin eller proteinprøver er i gang, kan de anvendes til en lang række assays, herunder proteindetektion, chip assay, microarray analyse, og RNA-seq. Derfor denne protokol giver mulighed for en grundig analyse af differentiel genekspression, epigenetisk modifikation, og transkriptionsfaktor bindende ansvarlige for den molekylære krydstale mellem facial ektoderm og mesenkym under fosterudviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser eller andre konflikter, der er forbundet med indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Irene Choi til at illustrere embryo hoveder i figur 1 og de øvrige medlemmer af laboratoriet for hjælp og diskussion. Dette arbejde understøttes af NIH tilskud DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
