Summary
Un protocollo per la separazione di ectoderma dell'embrione del viso e del mesenchima è descritto. Usiamo dispasi II per il trattamento di embrioni interi in primo luogo, analizzare interi protuberanze del viso, e poi separare il viso ectoderma e mesenchima.
Abstract
Schisi oro-facciali sono i difetti più frequenti cranio-facciali, che colpiscono 1,5 nel 1000 1,2 neonati in tutto il mondo. Palatoschisi orofacciale è causata da abnorme 3 Sviluppo del viso. In mouse e dell'essere umano, la crescita iniziale ed il modello del volto si basa su diversi piccoli boccioli di tessuto, le sporgenze del viso 4,5. Il volto è derivato da sei coppie di protuberanze principali: i processi frontali nasali (FNP), protuberanze mascellari (MXP) e protuberanze mandibolari (MdP). Tali prominenze consistono rigonfiamenti di mesenchima che sono incassati in un epitelio sovrastante. Gli studi condotti su specie diverse hanno dimostrato che la segnalazione crosstalk tra ectoderma e mesenchima del viso è fondamentale per plasmare il volto 6. Tuttavia, i dettagli meccanicistici riguardanti i geni coinvolti in questi relè di segnalazione sono carenti. Un modo per ottenere una comprensione globale di espressione genica, il fattore di trascrizione vincolante e marchi associati alla cromatina sviectoderma ping viso e mesenchima è quello di isolare e caratterizzare i compartimenti separati.
Qui vi presentiamo un metodo per separare ectoderma del viso e del mesenchima al giorno embrionale (E) 10.5, una fase critica dello sviluppo nella formazione del mouse facciale che precede la fusione delle protuberanze. Il nostro metodo è adattato da un approccio che abbiamo utilizzato in precedenza per sezionare protuberanze facciali 7. In questo studio abbiamo utilizzato inbred C57BL / 6 topi come questo ceppo è diventato uno standard per la genetica, la genomica e la morfologia del viso 8. Qui, tuttavia, sia per le quantità più limitata di tessuto disponibili, abbiamo utilizzato la outbred CD-1 ceppo che è conveniente per l'acquisto, più robusto per l'allevamento, e tende a produrre più embrioni (12-18) per cucciolata di qualsiasi inbred topo strain 8. Dopo aver isolato embrione, neutro proteasi dispasi II è stato usato per trattare l'embrione intero. Poi, le protuberanze facciali sono stati sezionareed out, e l'ectoderma facciale è stato separato dal mesenchima. Questo metodo mantiene sia l'ectoderma e mesenchima viso intatto. I campioni cosi ottenuti possono essere utilizzati per le tecniche di rilevamento tra proteine, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) assay, studi di microarray, e RNA-seq.
Protocol
1. Preparare dispasi II
- Preparare fresco Hepes-buffered saline (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Aggiungere 2 ml di 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 e 1,2 ml 2.5 M NaCl in 16,8 ml ultrapura H 2 O.
- Rendere 10 mg / ml dispasi II. Pesare 0,2 g dispasi II (Roche, Cat # 4942078001) e sciogliere in 20 ml di HBS. Preparare 1,0 ml aliquote nelle singole provette Eppendorf e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Diluire 10 mg / ml dispasi II 1:10 in PBS prima dell'uso. Mettere il diluito dispasi II su ghiaccio.
2. Dissect CD-1 E10.5 embrioni da Donne in stato di gravidanza
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla University of Colorado Denver (UCD) Cura degli animali e del Comitato d'uso. Topi CD-1 (ICR) sono stati ottenuti da Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Pulire la zona dissezione e gli strumenti con il 70% di etanolo.
- Eutanasia incinta CD-1 femmina con approveD protocolli.
- Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo quindi aprire l'addome. Usare un set di pinze per tirare l'utero e un altro per strappare il mesometrium dall'utero. Rimuovere l'utero dal corpo. Ripetere l'operazione per corno uterino sull'altro lato del ventre.
- Sciacquare brevemente l'utero con ghiaccio freddo PBS in un 10 cm piastra di Petri per lavare il sangue.
- Trasferire l'utero in un nuovo piatto di Petri con ghiaccio PBS freddo. Separati in un unico embrione-frammenti tagliando tra i siti di impianto.
- Trasferire un solo embrione in ghiaccio-freddo PBS allo stereomicroscopio. Utilizzare una pinza sottile per strappare la parete muscolare dell'utero a partire da uno dei siti di taglio per esporre l'embrione con il sacco vitellino. Staccare il sacco vitellino e amnios. Trasferimento a un embrione sezionato 6 cm Petri con PBS su ghiaccio. Procedere fino a quando tutti gli embrioni sono stati raccolti in questo modo.
3. Dispasi II Trattamento
- Lavare tutti gli embrioni con PBS in un 6 cm piastra di Petri. SostituirePBS diluito con 10 ml dispasi II in PBS. Coprire la piastra di Petri e incubare a 37 ° C per 25 min - un batterica incubatore o camera calda dovrebbe essere sufficiente - non abbiamo usato un CO 2 di coltura tissutale incubatore per questo passo.
- Prendere la piastra di Petri e osservare l'embrione allo stereomicroscopio. L'ectoderma dovrebbe si sono allentati, caratterizzata da un evidente divario tra questo strato di tessuto e il mesenchima sottostante. Se no, incubare per altri 5 minuti a 37 ° C. Poi mettere la piastra di Petri su ghiaccio.
4. Staccare le protuberanze intatte per il viso
- Utilizzare una pipetta di vetro monouso (VWR, Cat # 14672-380) trasferire una dispasi II trattato embrione in ghiacciata PBS in un 6 cm piastra di Petri allo stereomicroscopio.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere l'embrione. Utilizzare un altro paio di pinze sottili attentamente per tagliare i confini delle protuberanze facciali attaccati alla testa (figura 1 mostra i confinile protuberanze del viso). Inizia da un lato della MNP, poi il MxP, e l'ultima FNP. Fate lo stesso per l'altro lato di sezionare le protuberanze facciali fuori intatta (Figura 2A).
5. Separata Ectoderma viso da Mesenchima
- Osservare le protuberanze del viso sotto uno stereomicroscopio con 3x distanza di lavoro. Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro lunghe di pipettare delicatamente le protuberanze del viso su e giù per 5 volte. Dopo questo, l'ectoderma è facile da staccare.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere le protuberanze del viso. Utilizzare l'altra coppia di pinze per staccare l'ectoderma molto lentamente. Figura 2B mostra i fogli separati di ectoderma facciale.
- Utilizzare una nuova pipetta Pasteur di vetro lunghe per trasferire l'ectoderma del viso in un 1,5 ml Eppendorf tubo con PBS su ghiaccio. Trasferire il mesenchima ad un altro 1,5 ml Eppendorf tubo con PBS su ghiaccio.
- Utilizzate il nuovo ghiacciata PBS per ogni dissezione. Raccogliere campioni.
- Lavare tegli campioni con PBS. Centrifugare a 4 ° C, 500 xg per 3 min.
- Aspirare il PBS con lunghi vetro pipette Pasteur. Se i campioni devono essere utilizzati per il saggio ChIP, passare al punto 6.1. Per l'estrazione di RNA, passare al punto 6.2. Per l'estrazione di proteine, passare al punto 6.3.
6. I campioni di processo per ulteriori sperimentazioni
- I campioni per analisi ChIP
- Aggiungere 1 ml di PBS con 1% di formaldeide di reticolazione. Omogeneizzare i campioni.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min con rotazione.
- Aggiungere 110 ml di 1,25 M Glycine ad ogni provetta per placare la formaldeide che non ha reagito.
- Miscelare ed incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Centrifugare a 500 xg a 4 ° C per 3 min. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 1 ml di PBS per lavare i tessuti.
- Centrifugare a 500 xg a 4 ° C per 3 min.
- Rimuovere PBS e ripetere PBS lavare una volta.
- Rimuovere il surnatante, Snap congelare i tessuti in azoto liquido. Conservare la samples a -80 ° C per la successiva messa in comune e l'elaborazione.
- I campioni per l'estrazione di RNA
- Posizionare il viso ectoderma e mesenchima in provette contenenti RNAlater (Ambion).
- Incubare i campioni in soluzione RNAlater notte a 4 ° C per consentire una buona penetrazione del tessuto.
- Conservare a -20 ° C per la successiva messa in comune e l'elaborazione.
- I campioni per l'estrazione delle proteine
Aggiungere tampone di lisi al campione per la successiva lavorazione. Oppure scattare congelare i tessuti in azoto liquido. Conservare i campioni a -80 ° C per la successiva messa in comune e l'elaborazione.
Note
- Tempo di vincoli. Pianificare il 4-6 ore dall'inizio della dissezione fino all'inizio della sezione 6.
- Quando esperti, ci vogliono 10-15 minuti per ~ embrione di eseguire sezioni 4 e 5 (dissezione rilievo e la separazione ectoderma).
- Se i campioni di RNA isolamento, ogni solution deve essere trattata con dietilpirocarbonato prima. Pulire anche la pinza e l'area di lavoro con RNase Away.
- Mantenere i campioni nel ghiaccio sempre salvo per il trattamento dispasi II e dissezioni. Passare alla nuova ghiacciata PBS per ogni dissezione per assicurarsi che il PBS utilizzato per la dissezione è freddo.
- Pinze Sharp sono fondamentali per ottenere dissezione precisa. Pulire le pinze completamente per evitare qualsiasi contaminazione.
- Per la raccolta di campioni da diverse protuberanze, sezionare ogni rilievo separatamente, dopo il trattamento dispasi II. Poi separare l'ectoderma e mesenchima.
- Dopo il trattamento con dispasi II, l'ectoderma facciale è facile da staccare. Prestare particolare attenzione alla contaminazione da ectoderma altri. Eliminare tutti i tessuti potenzialmente contaminati.
- Una volta avviato, non si fermano fino a quando i campioni di raggiungere il punto appropriato nella sezione 6. Fine separazione tra ectoderma e mesenchima facciale per tutti gli embrioni nel più breve tempo possibile.
- L'indirizzo eattività di nzyme dispasi II potrebbe essere diversa tra i lotti e dei marchi. E 'necessario regolare il tempo di trattamento per diverse marche e lotti di dispasi II.
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Representative Results
Dopo il trattamento dispasi II, l'ectoderma dell'embrione tende ad essere sciolto. Le protuberanze del viso dovrebbe essere intatto dopo la dissezione (Figura 2A). L'ectoderma isolato viso è chiara e priva di tessuto mesenchima (Figura 2B). Per determinare l'efficacia del protocollo e per rilevare la contaminazione incrociata abbiamo saggiato per proencefalo espresso ZIC3 9, ectodermica specifica CDH1 5 e mesenchimali specifica SOX10 10 con trascrittasi inversa PCR. I nostri studi hanno confermato che sia ectoderma del viso e del mesenchima espressi i geni attesi ed erano liberi di contaminazione incrociata (Figura 3).
Figura 1. Schema che mostra il mouse protuberanze E10.5 facciali. Vista laterale (a sinistra) della testa e vista rostrale (a destra) della testa dell'embrione E10.5. Red dotted righe indicano il confine delle protuberanze facciali. Fronto-nasale rilievo (FNP), prominenza mascellare (MXP), rilievo mandibolare (MdP).
Figura 2. Aspetto di sezionato protuberanze interi E10.5 viso e ectoderma viso. (A) interi prominenze facciali. (B) ectoderma viso. Pannelli A e B sono lo stesso ingrandimento. Inserire in B mostra un ingrandimento maggiore di uno dei ectoderma facciale nel pannello B. Fronto-nasale rilievo (FNP), prominenza mascellare (MXP), rilievo mandibolare (MdP).
Figura 3. Trascrittasi inversa PCR confermato che sia ectoderma del viso e del mesenchima sono privi di una collabontamination. RNA totale è stato estratto da ectoderma facciale (E) e mesenchima (M). L'RNA è stato inversamente trascritto nel suo DNA complementare (cDNA), seguita da PCR con primer specifici per rilevare l'espressione di beta-actina (B-actina), ZIC3, CDH1 e SOX10. Le sequenze di primer in Tabella 1 sono stati ottenuti da banca primer ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). I prodotti PCR sono stati separati su un gel di agarosio al 2%. DNA Ladder (L).
| Gene | Primer nome | sequenze | Formato del prodotto |
| Beta-actina | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| ZIC3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| SOX10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabella 1. Primer sequenze.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo semplice per separare ectoderma embrionale del mouse e mesenchima facciale sulla base di una prima fase di trattamento dispasi II. In studi precedenti, abbiamo svolto dissezione delle protuberanze del viso prima del trattamento dispasi II, ma abbiamo sempre trovato che il mesenchima diventa "appiccicoso" e più difficile da manipolare. Il nostro nuovo protocollo evita questo problema. Combinazione dispasi II trattamento con dolce forza fisica pipettando su e giù rende separazione di ectoderma e mesenchima più facile. Inoltre, questo protocollo funziona bene anche per la separazione di altri campioni embrionali ectoderma e mesenchima, come ectoderma arto bud e mesenchima breve trattamento con dispasi II. Analogamente, può essere utilizzato in altre fasi di sviluppo - per esempio, per separare ectoderma viso E11.5 e mesenchima con una fase di trattamento più dispasi II.
La dimensione del campione ottenuto da un mouse E10.5 viso Prominmento è piuttosto piccolo e quindi si tende a conservare i lotti per l'eventuale elaborazione e analisi. A questo proposito è necessario piscina campioni ectodermiche 100-150 embrioni per ottenere 10 mg di tessuto. Una quantità maggiore di mesenchima deriva da ciascun embrione richiedendo meno pooling. La resa di sonicato DNA genomico per il saggio di ChIP è di circa 80 mg da 10 mg ectoderma viso. La resa RNA totale è di circa 20 mg per ogni 10 mg di ectoderma viso. Da un saggio comparativo proteina Bradford, si stima che si possono ottenere fino a 1 mg di proteina per 10 mg ectoderma viso. Dopo l'RNA, cromatina, o campioni di proteina sono in mano, possono essere utilizzate per saggi numerosi compreso il rilevamento della proteina, saggio ChIP, analisi microarray, e RNA-seq. Pertanto, questo protocollo permette un'analisi approfondita di espressione genica differenziale, modificazione epigenetica, e vincolante per fattori di trascrizione responsabili per il crosstalk molecolare tra ectoderma del viso e del mesenchima durante lo sviluppo embrionale.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi in gioco o altri conflitti connessi con il contenuto di questo articolo.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Irene Choi per illustrare le teste di embrioni in Fig. 1 e gli altri membri del laboratorio per l'aiuto e la discussione. Questo lavoro è sostenuto da NIH sovvenzione DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
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