Summary
Um protocolo para a separação da ectoderme embrionária facial e mesênquima é descrito. Usamos Dispase II para tratar embriões inteiros primeiro, dissecar todo proeminências faciais, e então separar o ectoderma facial e mesênquima.
Abstract
Fendas orofaciais são os defeitos mais freqüentes craniofaciais, que afetam 1,5 em 1000 1,2 recém-nascidos em todo o mundo. Fissuras orofaciais é causada por três desenvolvimento anormal facial. No ser humano e do rato, o crescimento inicial e padronização da cara depende de várias papilas pequenas de tecido, as proeminências faciais 4,5. O rosto é derivado de seis principais destaques: emparelhados processos frontais nasais (FNP), proeminências maxilares (MXP) e proeminências mandibulares (MDP). Estes consistem de proeminências inchaços de mesênquima que estão incorporados em um epitélio de revestimento. Estudos realizados em várias espécies têm mostrado que a sinalização crosstalk entre ectoderma facial e mesênquima é crítico para a formação da face 6. No entanto, os detalhes mecanísticos sobre os genes envolvidos nestes relés de sinalização são escassos. Uma maneira de obter uma compreensão abrangente da expressão do gene, fator de transcrição de ligação, e marcas de cromatina associados ao desenectoderme pingue facial e mesênquima é isolar e caracterizar os compartimentos dos tecidos separados.
Aqui apresentamos um método para separar ectoderma facial e mesênquima no dia embrionário (E) 10,5, uma fase crítica de desenvolvimento na formação do mouse facial que precede a fusão dos destaques. O nosso método é adaptado a partir do método já anteriormente utilizado para dissecar proeminências faciais 7. Neste estudo anterior havia sido empregado C57BL inato / 6 ratos como esta cepa se tornou um padrão para a genética, morfologia facial genômica e 8. Aqui, no entanto, devido às quantidades mais limitadas de tecido disponível, nós utilizamos a estirpe CD-1 outbred que é mais barata para comprar, mais robusto para a criação, e que tende a produzir mais embriões (12-18) por ninhada do que qualquer inbred rato tensão 8. Seguindo o isolamento do embrião, neutro protease Dispase II foi usada para tratar o embrião inteiro. Em seguida, as proeminências faciais foram dissecared para fora, e a ectoderme facial foi separado do mesênquima. Este método mantém tanto ectoderme facial e mesênquima intacta. As amostras obtidas utilizando este método pode ser usado para a detecção de proteínas, incluindo as técnicas, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio, os estudos de microarranjos e RNA-seq.
Protocol
1. Prepare Dispase II
- Preparar uma solução fresca de Hepes-solução salina tamponada (HBS) (50 mM de Hepes / KOH, pH 7,4, 150 mM NaCl). Adicionar 2 ml de 0,5 M de tampão Hepes / KOH a pH 7,4 e 1,2 ml de 2,5 M de NaCl em 16,8 ml de H 2 O. Ultrapure
- Faça 10 mg / ml Dispase II. Pesar 0,2 g Dispase II (Roche, Cat. # 4942078001) e dissolver em 20 ml de HBS. Preparar 1,0 ml alíquotas em tubos de Eppendorf individuais, e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Diluir 10 mg / ml Dispase II 1:10 em PBS antes da utilização. Coloque a Dispase II diluído em gelo.
2. Dissecar CD-1 embriões E10.5 de mulher grávida
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Animal Care Universidade do Colorado, Denver (UCD) e Comitê de uso. Ratinhos CD-1 (ICR) foram obtidos a partir de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Limpe a área de dissecção e ferramentas com etanol 70%.
- Euthanize fêmea CD-1 grávidas usando aprovaprotocolos ed.
- Pulverizar o abdômen com etanol 70%, em seguida abrir o abdômen. Usar um conjunto de pinças para retirar o útero e outro para rasgar o mesométrio do útero. Remover o útero do corpo. Repita o procedimento para corno uterino no outro lado do abdômen.
- Resumidamente enxaguar o útero com PBS gelado em uma placa de Petri de 10 cm, para lavar o sangue.
- Transferir o útero para uma nova placa de Petri com PBS gelado. Separar em um embrião de-fragmentos cortando entre os locais de implantação.
- Transferir um embrião em PBS gelado sob um estereomicroscópio. Use uma pinça fina para arrancar a parede muscular do útero a partir de um dos locais de corte para expor o embrião com o saco vitelino. Retire o saco vitelino e âmnio. A transferência de embriões dissecados para uma placa de Petri de 6 cm com PBS em gelo. Prossiga até que todos os embriões foram coletados desta forma.
3. Dispase II Tratamento
- Lave todos os embriões com PBS numa placa de Petri de 6 cm. SubstituirPBS com 10 ml diluídos em PBS Dispase II. Cobrir a placa de Petri e incubar a 37 ° C durante 25 minutos - uma incubadora bacteriana ou sala quente deve ser suficiente - não ter usado um tecido de CO 2 incubadora de cultura para esta etapa.
- Pegue a placa de Petri para fora e observar o embrião sob estereomicroscópio. O ectoderma deve ter se soltado, caracterizado por uma diferença clara entre esta camada de tecido e no mesênquima subjacente. Se não, incubar por mais 5 min a 37 ° C. Em seguida, coloque a placa de Petri no gelo.
4. Dissecar os destaques intactas Facial
- Use uma pipeta de vidro descartável (VWR, Cat # 14672-380) para transferir um Dispase II tratados embrião em PBS gelado em uma placa de Petri de 6 cm sob um estereomicroscópio.
- Utilizar um par de pinças para segurar o embrião. Utilizar um outro par de fórceps finos cuidadosamente para cortar os limites das proeminências faciais associadas a cabeça (Figura 1 mostra os limites daos destaques facial). Iniciar a partir de um lado da MnP, em seguida, o MxP e FNP o último. Fazer o mesmo para o outro lado para dissecar as proeminências para fora da face intacto (Figura 2A).
5. Ectoderma Facial separado do mesênquima
- Observar as proeminências faciais sob um estereomicroscópio com distância de trabalho de 3x. Use um longo vidro Pasteur pipeta suavemente para pipetar as proeminências faciais cima e para baixo 5 vezes. Depois disso, a ectoderme é fácil de descascar.
- Use uma pinça para segurar as proeminências faciais. Usar o outro par de pinças para retirar a ectoderme muito lentamente. Figura 2B mostra as folhas separadas de ectoderma facial.
- Usar uma nova longo vidro Pasteur pipeta para transferir o ectoderma facial em um tubo Eppendorf de 1,5 ml com PBS em gelo. Transferir o mesênquima para outro tubo Eppendorf de 1,5 ml com PBS em gelo.
- Use o novo gelada PBS para cada dissecção. Coletar amostras.
- Lave tele amostras com PBS. Centrifugar a 4 ° C, 500 xg durante 3 min.
- Aspirar o PBS utilizando pipetas de vidro longos de Pasteur. Se as amostras devem ser usados para o ensaio de chip, vá para o passo 6.1. Para a extração de RNA, vá para o passo 6.2. Para a extração de proteínas, vá para o passo 6.3.
6. Amostras de processo para novas experiências
- As amostras para ensaio ChIP
- Adicionar 1 ml de PBS com formaldeído a 1% e de reticulação. Homogeneizar as amostras.
- Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos com rotação.
- Adicionar 110 ul de 1,25 M de glicina a cada tubo para extinguir o formaldeído que não reagiu.
- Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Girar a 500 xg a 4 ° C durante 3 min. Remover o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de PBS frio para lavar tecidos.
- Girar a 500 xg a 4 ° C durante 3 min.
- Remover PBS e PBS lavar repetir uma vez.
- Remover o sobrenadante, Encaixe congelar os tecidos em azoto líquido. Armazenar a samples a -80 ° C para posterior partilha e processamento.
- As amostras para a extração de RNA
- Coloque o ectoderma facial e mesênquima em tubos contendo RNAlater (Ambion).
- Incubar as amostras em RNAlater solução durante a noite a 4 ° C para permitir a penetração profunda do tecido.
- Armazenar a -20 ° C para subsequente conjugação e processamento.
- As amostras para a extração de proteínas
Adicionar tampão de lise para a amostra para o processamento subsequente. Ou tirar congelar os tecidos em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras a -80 ° C para subsequente conjugação e processamento.
Notas
- Limitações de tempo. Pensando em 4-6 horas desde o início da dissecção até o início da seção 6.
- Quando proficiente, leva ~ 10-15 minutos por embrião para realizar seções 4 e 5 (dissecção destaque e separação ectoderme).
- Se as amostras são para o isolamento de ARN, cada solution deve ser tratado com dietilpirocarbonato primeiro. Também limpar a pinça e da área de trabalho com RNase Fora.
- Mantenha as amostras em gelo em todos os momentos, exceto para o tratamento II Dispase e dissecações. Mudar para nova gelada PBS para cada dissecção para garantir que o PBS utilizado para dissecção é frio.
- Pinças cortantes são cruciais para obter a dissecção precisa. Limpe a pinça completamente para evitar qualquer contaminação.
- Para a coleta de amostras de proeminências diferentes, dissecar cada proeminência separadamente após Dispase tratamento II. Em seguida, separar o ectoderma e mesênquima.
- Após o tratamento com Dispase II, o ectoderma facial é fácil de descascar. Preste atenção especial à contaminação por ectoderma outro. Descartar todo o tecido potencialmente contaminadas.
- Depois de começar, não pare até que as amostras atingir o ponto adequado na Secção 6. Concluir separação de ectoderma facial e mesênquima para todos os embriões tão rapidamente como você pode.
- O e-atividades nzyme de Dispase II pode ser diferente entre os lotes e marcas. É necessário regular o tempo de tratamento para as diferentes marcas e lotes de Dispase II.
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Representative Results
Após tratamento Dispase II, a ectoderme do embrião tende a ser solto. As proeminências faciais devem estar intacto após dissecção (Figura 2A). O ectoderma facial isolada é clara e livre de mesênquima tecido (Figura 2B). Para determinar a eficácia do protocolo e para detectar a contaminação cruzada nós ensaiadas para prosencéfalo expressaram Zic3 9, ectodérmica específico CDH1 5 e mesenquimal específico SOX10 10 utilizando transcriptase reversa PCR. Nossos estudos confirmaram que tanto ectoderma facial e mesênquima expressa os genes esperadas e estavam livres de contaminação cruzada (Figura 3).
Figura 1. Diagrama esquemático mostrando proeminências rato E10.5 faciais. Vista lateral (esquerda) da cabeça e vista rostral (à direita) da cabeça do embrião E10.5. Red dottelinhas d indicar o limite dos destaques faciais. Frontonasal destaque (FNP), a proeminência maxilar (MXP), a proeminência da mandíbula (MDP).
Figura 2. Aparecimento de proeminências inteiros dissecados E10.5 faciais e ectoderme facial. (A) Total proeminências faciais. (B) ectoderme Facial. Os painéis A e B são mesma ampliação. Inserir na B mostra maior ampliação de um dos ectoderma facial no painel B. Frontonasal destaque (FNP), a proeminência maxilar (MXP), a proeminência da mandíbula (MDP).
Figura 3. Transcriptase reversa PCR confirmou que tanto ectoderma facial e mesênquima estão livres de cruz coRNA ntamination. total foi extraído a partir de ectoderma facial (E) e mesênquima (M). O RNA foi transcrito de forma inversa em seu DNA complementar (cDNA), seguido por PCR com primers específicos para detectar a expressão da beta-actina (B-actina), Zic3, CDH1 e SOX10. As sequências dos iniciadores da Tabela 1 foram obtidos a partir do banco de primer ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 2%. DNA Ladder (L).
| Gene | Nome Primer | seqüências | Tamanho do produto |
| Beta-actina | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 pb |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 pb |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| CDH1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 pb |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| SOX10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 pb |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabela 1. Sequências iniciadoras.
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Discussion
Este protocolo fornece um método simples para separar ectoderma rato embrionário mesênquima facial e base em uma primeira etapa de tratamento Dispase II. Em estudos anteriores, temos realizado dissecção das proeminências faciais antes Dispase tratamento II, mas temos de forma consistente que o mesênquima se torna "pegajoso" e mais difícil de manipular. Nosso novo protocolo evita esse problema. Combinação Dispase II tratamento com força física suave pipetando para cima e para baixo faz a separação de ectoderma e mesênquima mais fácil. Além disso, este protocolo também funciona bem para a separação de outras amostras embrionárias ectoderme e mesênquima, tais como ectoderme membro botão e mesênquima de tratamento mais curto com Dispase II. De modo semelhante, ele pode ser usado noutras fases de desenvolvimento - por exemplo, para a separação de E11.5 ectoderma facial e mesênquima com um passo mais Dispase tratamento II.
O tamanho da amostra obtida a partir de um mouse E10.5 facial prominrência é muito pequena e, portanto, tendem a armazenar lotes para, eventualmente, processamento e análise. A este respeito, é necessário que as amostras de piscina ectodérmicos 100-150 embriões para se obter 10 mg de tecido. Uma maior quantidade de mesênquima é derivado de cada embrião requer menos de agrupamento. O rendimento de ADN genómico para o ensaio de ChIP sonicado é cerca de 80 ug de 10 mg ectoderma facial. O rendimento de ARN total é de cerca de 20 ug por 10 mg ectoderma facial. A partir de um ensaio comparativo de proteína de Bradford, estima-se que se pode obter-se a 1 mg de proteína por cada 10 mg de ectoderma facial. Uma vez que o RNA, a cromatina, ou amostras de proteína são dadas, eles podem ser utilizados para ensaios de detecção, incluindo numerosos proteína, ensaio de ChIP, análise de microarray e RNA-seq. Portanto, este protocolo permite uma análise aprofundada da expressão diferencial de genes, modificação epigenética, e ligação de fatores de transcrição responsáveis pela crosstalk molecular entre ectoderma facial e mesênquima durante o desenvolvimento embrionário.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes ou outros conflitos associados com o conteúdo deste artigo.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Irene Choi para ilustrar cabeças de embriões em Fig. 1 e os outros membros do laboratório de ajuda e discussão. Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
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