Summary
Ett protokoll för separering av embryo ansiktet ektoderm och mesenkym beskrivs. Vi använder Dispase II för att behandla hela embryon först dissekera hela ansiktet protuberanser ut, och sedan separera ansiktet ektoderm och mesenkym.
Abstract
Orofaciala klyftor är de vanligaste kraniofaciala defekter som påverkar 1,5 i 1000 nyfödda i världen 1,2. Orofacial clefting orsakas av onormal ansikts utveckling 3. I människa och mus, första tillväxt och mönstring av ansiktet är beroende av flera små knoppar av vävnad, ansikts protuberanser 4,5. Ansiktet kommer från sex stora protuberanser: parade frontal näsan processer (FNP), maxillary protuberanser (MXP) och mandibular protuberanser (MDP). Dessa protuberanser består av svullnader i mesenkym som är inneslutna i ett överliggande epitel. Studier i flera arter har visat att signalering överhörning mellan ansiktet ektoderm och mesenkym är avgörande för att forma ansiktet 6. Ändå är mekanistiska uppgifter om de gener som är involverade i dessa signalreläerna saknas. Ett sätt att få en övergripande förståelse av genuttryck, transkriptionsfaktor bindande och märken kromatin i samband med utveckping ansiktet ektoderm och mesenkym är att isolera och karakterisera de separerade teoretiska vävnader.
Här presenterar vi en metod för att separera ansiktet ektoderm och mesenkym på embryonala dag (E) 10,5, en kritisk utvecklingsstadium i mus ansiktet formation som föregår sammansmältning av protuberanser. Vår metod är anpassad från den strategi som vi har tidigare använts för dissekera ansiktet protuberanser 7. I denna tidigare studie hade vi anställda inavlade C57BL / 6 möss som denna stam har blivit en standard för genetik, genomik och ansikts morfologi 8. Här, men på grund av de mer begränsade mängder vävnad finns, har vi utnyttjat utavlat CD-1-stam som är billigare att köpa, mer robust för djurhållning, och tenderar att producera mer embryon (12-18) per kull än något inavlad musstammen 8. Efter embryo isolering, var neutralt proteas Dispase II används för att behandla hela embryot. Därefter var de ansikts protuberanser dissekeraed ut och ansiktet ektodermet separerades från mesenkym. Denna metod håller både ansiktet ektoderm och mesenkym intakt. De prover som erhölls med denna metod kan användas för tekniker inklusive protein upptäckt, kromatin immunoprecipitation (chip)-analys, microarray studier och RNA-seq.
Protocol
1. Förbered Dispase II
- Bered färsk Hepes-buffrad saltlösning (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Tillsätt 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 och 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml Ultrapure H 2 O
- Gör 10 mg / ml Dispase II. Väg 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) och lös upp i 20 ml HBS. Förbered 1,0 ml portioner i enskilda Eppendorf-rör och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- Späd 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS före användning. Sätt den utspädda Dispase II på is.
2. Dissekera CD-1 E10.5 embryon från gravida kvinnor
Samtliga djurförsök har utförts i enlighet med protokoll som godkänts av University of Colorado Denver (UCD) Animal Care och användning kommittén. CD-1 (ICR) möss erhölls från Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
- Rengör dissektion området och verktyg med 70% etanol.
- Avliva gravid CD-1 hona med godkäned protokoll.
- Spraya buken med 70% etanol och sedan öppna buken. Använd en uppsättning av pincett för att dra livmodern och en annan för att riva bort mesometrium från livmodern. Avlägsna livmodern från kroppen. Upprepa för livmoderhorn på andra sidan av buken.
- Kortfattat Skölj livmodern med iskall PBS i en 10-cm petriskål att tvätta bort blodet.
- Överför livmodern till en ny petriskål med iskall PBS. Separat till en embryo fragment genom att skära mellan implantationsställen.
- Överför ett embryo i iskall PBS under ett stereomikroskop. Använd fin pincett för att riva av den muskulära väggen i livmodern börjar vid en av de skurna platser att exponera embryot med gulesäcken. Dra av gulesäcken och amnion. Överför dissekerade embryot till en 6-cm Petri-skål med PBS på is. Fortsätt tills alla embryon har samlats på detta sätt.
3. Dispas II Behandling
- Tvätta alla embryon med PBS i en 6-cm petriskål. ErsättPBS med 10 ml utspädd Dispase II i PBS. Täck petriskål och inkubera vid 37 ° C i 25 minuter - en bakteriell inkubator eller varmt rum bör räcka - vi har inte använt en CO 2 inkubator vävnadsodling för detta steg.
- Ta petriskål ut och observera embryot under ett stereomikroskop. Den ektoderm borde ha lossnat, kännetecknas av en tydlig klyfta mellan denna vävnad skikt och underliggande mesenkym. Om inte, inkubera under ytterligare 5 minuter vid 37 ° C. Lägg sedan petriskålen på is.
4. Dissekera ut de intakta Facial protuberanser
- Använd en disponibel glaspipett (VWR, Cat # 14.672-380) att överföra en Dispase II behandlade embryo i iskall PBS i en 6-cm Petri-skål under ett stereomikroskop.
- Använd en pincett för att hålla embryot. Använd en annan par fina pincett försiktigt skära gränserna för ansiktet protuberanser bifogas huvudet (Figur 1 visar gränserna föri ansiktet protuberanser). Starta från en sida av MNP sedan MXP och sist FNP. Gör samma sak på andra sidan för att dissekera de ansikts protuberanser ut intakt (Figur 2A).
5. Separat Facial ektoderm från mesenkym
- Beakta ansikts protuberanser under ett stereomikroskop med 3x arbetsavstånd. Använd en lång glas pasteurpipett att försiktigt pipettera de ansikts protuberanser upp och ner 5 gånger. Efter detta, är ektodermet lätt att skala bort.
- Använd en pincett för att hålla ansiktet protuberanser. Använd den andra pincett lossnar ektoderm mycket långsamt. Figur 2B visar de separerade arken av ansikts ektoderm.
- Använd en ny lång glas pasteurpipett att överföra ansiktet ektoderm i en 1,5 ml Eppendorf-rör med PBS på is. Överför mesenkymet till en annan 1,5 ml Eppendorf-rör med PBS på is.
- Använd nya iskall PBS för varje dissektion. Samla in prover.
- Tvätta than prover med PBS. Centrifugera vid 4 ° C, 500 x g under 3 minuter.
- Aspirera PBS med långa glas Pasteur-pipetter. Om proverna ska användas för chip analys, gå vidare till steg 6,1. För RNA-extraktion, vidare till steg 6,2. För protein utvinning, gå vidare till steg 6,3.
6. Process Prover för ytterligare experiment
- Prover för chip analys
- Tillsätt 1 ml PBS med 1% formaldehyd för att tvärbinda. Homogenisera proverna.
- Inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter under rotation.
- Lägg 110 pl 1,25 M glycin till varje rör för att släcka oreagerad formaldehyd.
- Blanda och inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Snurra vid 500 xg vid 4 ° C under 3 minuter. Avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 1 ml kall PBS för att tvätta vävnaderna.
- Snurra vid 500 xg vid 4 ° C under 3 minuter.
- Avlägsna PBS och upprepa PBS tvätta en gång.
- Avlägsna supernatanten, Knäpp frysa vävnaderna i flytande kväve. Förvara samples vid -80 ° C för efterföljande sammanslagning och bearbetning.
- Prover för RNA-extraktion
- Placera ansiktet ektoderm och mesenkym i rör innehållande RNAlater (Ambion).
- Inkubera proverna i RNAlater lösning över natten vid 4 ° C för att medge noggrann penetrering av vävnaden.
- Förvara vid -20 ° C för efterföljande sammanslagning och bearbetning.
- Prover för proteinextraktion
Lägg lysbuffert till provet för efterföljande behandling. Eller snäpp frysa vävnaderna i flytande kväve. Lagra proverna vid -80 ° C för efterföljande sammanslagning och bearbetning.
Anteckningar
- Tidsbrist. Planerar 4-6 tim från början av dissekering fram till början av avsnitt 6.
- När skicklig, det tar ~ 10-15 min per embryo för att utföra avsnitten 4 och 5 (framträdande dissekering och ektoderm separation).
- Om proverna är för RNA-isolering, varje solution skall behandlas med dietylpyrokarbonat först. Också rengöra pincetten och arbetsområdet med RNas Away.
- Håll proverna på is hela tiden med undantag för Dispase II behandling och dissektioner. Byt till nya iskall PBS för varje dissektion för att se PBS används för dissektion är kall.
- Skarpa pincett är avgörande för att få exakt dissektion. Rengör pincetten helt för att förhindra kontaminering.
- För att samla in prover från olika protuberanser, dissekera varje framträdande separat efter Dispase II behandling. Sedan separera ektoderm och mesenkym.
- Efter behandling med Dispase II är ansiktet ektoderm lätt lossnar. Ägna särskild uppmärksamhet åt föroreningar från andra ektoderm. Kasta alla potentiellt förorenade vävnad.
- När du börjar, sluta inte förrän proverna når rätt punkt i avsnitt 6. Avsluta separation av ansikts ektoderm och mesenkym för alla embryon så snabbt du kan.
- Den enzyme verksamhet Dispase II kan vara olika mellan partier och varumärken. Det är nödvändigt att anpassa behandlingstiden för olika märken och satser av Dispase II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter Dispase II behandling tenderar ektoderm av embryot vara lös. Ansikts protuberanser bör vara intakt efter dissektion (Figur 2A). Den isolerade ansiktet ektoderm är klar och fri från mesenkym vävnad (Figur 2B). För att bestämma effektiviteten av protokollet och att upptäcka korskontaminering vi analyserades för framhjärnan uttryckte Zic3 9, ektodermal specifika cdh1 5 och mesenkymala specifika sox10 10 med omvänt transkriptas-PCR. Våra studier bekräftar att både ansiktet ektoderm och mesenkym uttryckte de förväntade gener och var fria från korskontaminering (Figur 3).
Figur 1. Schematiskt diagram som visar mus E10.5 ansiktet protuberanser. Sidovy (vänster) i huvudet och rostralt vy (höger) i E10.5 embryon huvudet. Röd dotted linjer indikerar gränsen för ansikts protuberanser. Frontonasal framträdande (FNP), maxillary framträdande (MXP), Mandibular framträdande (MDP).
Figur 2. Utseende av dissekerade hela E10.5 ansiktet protuberanser och ansikts ektoderm. (A) Hela ansiktet protuberanser. (B) Skägg ektoderm. Paneler A och B är samma förstoring. Infoga i B visar högre förstoring av en av ansiktet ektoderm i panel B. Frontonasal framträdande (FNP), maxillary framträdande (MXP), Mandibular framträdande (MDP).
Figur 3. Omvänt transkriptas-PCR bekräftade att både ansiktet ektoderm och mesenkym är gratis kors samarbetentamination. Totalt RNA extraherades från ansiktet ektoderm (E) och mesenkym (M). RNA transkriberades omvänt till dess komplementära DNA (cDNA), följt av PCR med specifika primrar för att detektera uttrycket av beta-aktin (B-aktin), Zic3, cdh1 och sox10. Primersekvenserna i tabell 1 erhölls från primer bank ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). PCR-produkterna separerades på en 2% agarosgel. DNA-stege (L).
| Gen | Primer namn | sekvenser | Produkt storlek |
| Beta-aktin | mActb-F | 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ' | 154 bp |
| mActb-R | 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3 ' | ||
| zic3 | mZic3-F | 5'-TCCCTTCGGGGACTCAACC-3 ' | 138 bp |
| mZic3-R | 5'-GCATTGGCATAACCTGAACCC-3 ' | ||
| cdh1 | mcdh1-F | 5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3 ' | 175 bp |
| mcdh1-R | 5'-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3 ' | ||
| sox10 | msox10-F | 5'-ACACCTTGGGACACGGTTTTC-3 ' | 165 bp |
| msox10-R | 5'-TAGGTCTTGTTCCTCGGCCAT-3 ' |
Tabell 1. Primersekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en enkel metod för att separera embryonala mus ansiktet ektoderm och mesenkym baserat på en initial Dispase II behandling steg. I tidigare studier har vi utfört dissektion av ansikts protuberanser före Dispase II behandling, men vi har konsekvent funnit att mesenkym blir "klibbiga" och svårare att manipulera. Vår nya protokollet undviker detta problem. Kombination Dispase II behandling med mild fysisk kraft genom att pipettera upp och ned gör separation av ektoderm och mesenkym lättare. Vidare fungerar detta protokoll också bra för separation av andra embryonala ektoderm och mesenkym prover, såsom lem knopp ektoderm och mesenkym med kortare Dispase II behandling. Likaså kan den användas vid andra stadier av utveckling - till exempel för att separera E11.5 ansikts ektoderm och mesenkym med en längre Dispase II behandlingssteg.
Urvalsstorleken erhållits från en E10.5 mus ansiktsbehandling Prominhet är ganska liten och därför tenderar vi att lagra partier för att på sikt bearbetning och analys. I detta avseende är det nödvändigt att samla ektodermala prover 100 till 150 embryon att erhålla 10 mg vävnad. En större mängd mesenkym härrör från varje embryo kräver mindre pooling. Utbytet för sonikerade genomisk DNA för chip analys är cirka 80 pg från 10 mg ansikts ektoderm. Det totala RNA-utbytet är cirka 20 ^ g per 10 mg ansikts ektoderm. Från en jämförande Bradford proteinanalys, uppskattar vi att vi kan få upp till 1 mg protein per 10 mg ansikts ektoderm. När RNA, kromatinet, eller prover protein är i handen, kan de användas för ett flertal analyser, inklusive protein-detektering, ChIP-analys, microarray analys, och RNA-punkter. Därför gör detta protokoll en grundlig analys av differentiell genexpression epigenetisk modifiering, och transkription bindande faktorn bakom den molekylära överhörning mellan ansiktet ektoderm och mesenkym under embryonal utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen eller andra konflikter i samband med innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Irene Choi för att illustrera embryo huvuden i figur 1 och de övriga medlemmarna i laboratoriet för att få hjälp och diskussion. Detta arbete stöds av NIH bidrag DE012728 (TW)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
