Summary
ويمكن قياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي في الخميرة الحية (
Abstract
فجوي ودرجة الحموضة عصاري خلوي درجة عالية من التنظيم في خلايا الخميرة، وتحتل دورا مركزيا في توازن درجة الحموضة بشكل عام. نحن تصف بروتوكولات لقياس الرقم الهيدروجيني ratiometric في الجسم الحي باستخدام درجة الحموضة حساسة fluorophores مترجمة إلى فجوة أو العصارة الخلوية. يتم قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة عندما أدخلت الخلايا في شكله استر acetoxymethyl. يتم قياس درجة الحموضة عصاري خلوي مع GFP حساسة درجة الحموضة أعرب تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة، الخميرة pHluorin. وصفت وسائل لقياس نسب مضان في تعليق خلية الخميرة في مقياس التألق. من خلال هذه البروتوكولات، وقد تم مقارنة وقت واحد نقطة قياسات الحموضة في ظل ظروف مختلفة أو في المسوخ الخميرة مختلفة، ولقد تم رصد تغيرات في درجة الحموضة على مر الزمن. كما تم تكييف هذه الأساليب إلى لوحة مضان قارئ شكل لإجراء التجارب الإنتاجية العالية. مزايا قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric أكثر من AP أخرىموصوفة أيضا مقاربات قيد الاستخدام حاليا، المشاكل المحتملة التجريبية والحلول، وآفاق استخدامها في المستقبل من هذه التقنيات.
Introduction
توازن درجة الحموضة هي عملية ديناميكية ودرجة عالية من التنظيم في جميع الكائنات الحية 1،2. العمليات البيوكيميائية وينظم بإحكام بواسطة الرقم الهيدروجيني، ويتم ضبطها البيئات داخل الخلايا إلى نطاقات ضيقة الرقم الهيدروجيني للسماح النشاط الأمثل للأنزيمات المقيمين. ومع ذلك، الخلايا التوازن درجة الحموضة يمكن الطعن من قبل التغيرات السريعة في درجة الحموضة البيئة، والتحولات الأيضية، وبعض مسارات الإشارات. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة داخل الخلايا نفسها يمكن أن تكون بمثابة إشارة هامة. وأخيرا، العديد من العضيات الحفاظ على قيم درجة الحموضة lumenal التي تختلف من العصارة الخلوية المحيطة وأساسية لوظائف عضية محددة.
الخميرة خميرة الخباز أسهم عدد من آليات التوازن درجة الحموضة مع ارتفاع حقيقيات النوى 2. في العضيات الحامضية للمسار التقامي / الليزوزومية، ويتم التحكم في المقام الأول درجة الحموضة من قبل فجوي البروتون translocating أتباز حفظها للغاية (V-أتباز)، تعمل جنبا إلى جنب مع العديد من exchanالخيام تعتمد على التدرج درجة الحموضة. لديهم كل الخلايا حقيقية النواة أيضا آليات التصدير البروتون. في الفطريات والنباتات، والثانية، مضخة البروتون متميزة في غشاء البلازما، Pma1، صادرات البروتونات التمثيل الغذائي، ويعتقد أن يكون محددا رئيسيا من درجة الحموضة عصاري خلوي والمحتملة غشاء البلازما. المرونة الجينية من S. الخباز وأهميتها التجارية، جعلت من نموذج مثيرة جدا للاهتمام ومهم لدراسة توازن درجة الحموضة 2.
بالإضافة إلى كونها السبب الأساسي في عضية تحمض، وV-ATPases درجة عالية من التنظيم الانزيمات، وتهتم مختبرنا في فهم آليات التنظيم V-أتباز. وتحقيقا لهذا الهدف، لقد تم استخدام في قياس الأس الهيدروجيني pH الجسم الحي من درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي: 1) لرصد الاستجابات لتغير الظروف خارج الخلية، مثل الحرمان من الجلوكوز وreaddition، 2) لدراسة آثار الطفرات التي سطا النشاط V-أتباز، و 3) لاستكشاف COORdination من عضية والبلازما مضخات البروتون غشاء 3-5. أصبحت هذه التجارب فقط ممكن من خلال وضع مؤشرات قوية درجة الحموضة ratiometric قابلة للاستخدام في خلايا الخميرة. وأظهرت محطة وآخرون الأولى التي BCECF (2'7'-مكرر (2-carboxyethyl) -5 - (و 6)-carboxyfluorescein).، والتي تم استخدامها على نطاق واسع لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في خلايا الثدييات، يتراكم في فجوة الخميرة بدلا من العصارة الخلوية 6. ويعزى هذا الاختلاف في BCECF توطين للعديد من الإنزيمات حلمهي في فجوة، والتي من المرجح المسؤولة عن الانقسام من استر الميثيل acetoxy من BCECF-AM (استر acetoxymethyl من BCECF) والاحتفاظ فجوي 6. علي وآخرون. 7 تطويرها قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF وتكييفها هذه القياسات إلى تنسيق قارئ لوحة مضان. بريت وآخرون. عرض pHluorin الخميرة كوسيلة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الخميرة بالإعراب عن R-المنقولة البلازميدatiometric GFP حساسة الرقم الهيدروجيني 8 تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة محددة 9.
أطياف الإثارة من كلا BCECF والخميرة pHluorin حساسة لدرجة الحموضة، بحيث يتم استخدامها كمؤشرات درجة الحموضة ratiometric فيه نسبة من مضان على اثنين من موجات الإثارة، ويقاس عند طول موجي واحد الانبعاثات، ويوفر قدرا من درجة الحموضة 8،10. وقد استخدمت هذه المجسات الخميرة درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي لكلا القياسات أحادية الخلية ومرتكزة على السكان. القياسات وحيدة الخلية 6،11 يتم تنفيذها بواسطة الفحص المجهري مضان وتحليل الصور. يتم قياس مضان فجوي أو عصاري خلوي في موجات اثنين لكل خلية. يتم تنفيذ القياسات المأخوذة من السكان في أي قارئ صفيحة ميكروسكوبية مع قدرات مضان المناسبة أو في مقياس التألق. قمنا به عموما قياسات لدينا في مقياس التألق، لأنه يوفر سهولة الوصول لإضافة مكونات مثل الجلوكوز خلال يخدعالقياسات الحركية المستمرين. يتم سرد لدينا بروتوكولات مختبر الحالية لقياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي أدناه، ويتم أيضا تكييفها بسهولة على حد سواء لفحوصات صفيحة ميكروسكوبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. قياس درجة الحموضة في الجسم الحي باستخدام رغوي BCECF-AM
- تنمو ثقافة السائل 50 مل من سلالة الخميرة إلى أن تقاس على المدى المتوسط المطلوب بين عشية وضحاها. الهدف هو أن تكون الخلايا في مرحلة منتصف السجل (OD600 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر) قياس ما يقرب من 0.8 لتعليق).
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي الخميرة. Resuspend وبيليه في 0.6 مل من وسط النمو ونقل إلى أنبوب microcentrifuge التي تم وزنه سابقا. بيليه الخلايا مرة أخرى في microcentrifuge في 2،000 x ج لمدة 60 ثانية. إزالة طاف تماما بقدر الإمكان وثم وزن الخلية بيليه. resuspend الكرية إلى كثافة النهائي من 0.5 جم / مل (W / V)، وسوف ثقافة هذا الحجم يعطي الخلية بيليه من حوالي 200 ملغ، و 200 ميكرولتر من العازلة ستضاف إلى إعطاء الحجم النهائي من 400 ميكرولتر.
- إضافة BCECF-AM إلى تعليق خلية في تركيز النهائي من 50 مم من الأسهم 12 ملم أعدت في DMSO. تخلط جيدا ثم المؤتمر الوطني العراقيأوباتي الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. على منصة هزاز أو الأسطوانة.
- بينما تحتضن الخلايا، وإعداد مخازن المعايرة. المخزن المؤقت معايرة يحتوي على 50 ملي زارة التربية والعلم (2 - (N-morpholino) ethanesulfonic حامض)، 50 HEPES ملم (4 - (2-هيدروكسي إيثيل)-1-piperazineethanesulfonic حامض)، 50 ملي بوكل، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.2 M خلات الأمونيوم، 10 ملي أزيد الصوديوم، و 10 ملي 2-deoxyglucose، ويتم ضبط درجة الحموضة إلى القيم المناسبة لمجموعة معايرة مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك. (تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية، وينبغي التعامل معها بحذر.) لقياس درجة الحموضة في الخلايا من النوع البري، فإننا إعداد عدة مخاليط المعايرة في درجة الحموضة 5،5-6،5، ولكن لالمسوخ المتوقع أن يكون الرقم الهيدروجيني فجوي أكثر قلوية ( المسوخ الأهدل)، ونحن نستعد إضافية، مخازن درجة الحموضة أعلى.
- قسامة 2 مل من العازلة معايرة لكل درجة الحموضة في أنابيب مخروطية 15 مل، وإضافة مونينسين (15 ملي الأسهم) وnigericin (الأسهم مم 2) لإعطاء تركيز النهائي من 110 ميكرومتر مونينسين و 15 ميكرومتر nigericin، صespectively. تخلط جيدا في خلاط دوامة. (تنبيه: كل مونينسين وnigericin سامة، وينبغي التعامل معها بحذر.)
- عندما يتم الانتهاء من فترة حضانة BCECF-AM، بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 XG في microcentrifuge. resuspend الخلايا هي 1 مل من متوسط النمو تفتقر الجلوكوز وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه. كرر هذه الخطوة يغسل مرة واحدة، ثم resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من متوسط النمو دون الجلوكوز. مكان على الجليد.
- إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل أنبوب معايرة درجة الحموضة أعد أعلاه. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. على الأسطوانة.
- تعيين مقياس التألق لقياس بالتناوب في موجات الإثارة 450 نانومتر و 490 نانومتر، على حد سواء مع الطول الموجي الانبعاثات من 535 نانومتر. ضبط درجة حرارة غرفة العينة إلى 30 درجة مئوية. تنفيذ جميع القياسات مع التقليب المستمر للخليط في كفيت.
- إضافة 1.96 مل من 1 ملم MES (تعديلها لدرجة الحموضة 5 أو 7 اعتمادا على درجة الحموضة من نمو الخلايا المتوسطة 'Aالثانية التصميم التجريبي). إضافة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كفيت. بدء قياسات مضان. نقوم بجمع كل البيانات نقطة زمنية في تجارب مختلفة الحركية المستمر و. بالنسبة للبيانات الحركية المستمرة، ونحن نأخذ القياسات كل 6 ثوانى لمدة 5 دقائق، ثم يضاف السكر إلى تركيز الجلوكوز النهائي من 50 ملم، ويستمر لمدة 5-10 دقيقة القياس. لقياسات نقطة زمنية واحدة، ونحن نأخذ القياسات عموما في 1 و 5 دقائق. بعد إضافة الخلايا لكفيت، إضافة الجلوكوز كما في القياسات الحركية، ومن ثم أخذ القياس آخر 5 دقائق. بعد إضافة السكر. يمكن أن تختلف هذه الإضافات، ويمكن أيضا مكونات إضافية (مثبطات، الخ) يمكن ان تضاف.
- بعد القياسات التجريبية كاملة، وإزالة أنابيب المعايرة من 30 ° C الحضانة ونقل كامل حجم مل 2 لكل لكفيت مقياس التألق. قياس مضان في نفس الإعدادات (انظر 1.8) كل 5 ثوانى على ما مجموعه 30 ثانية لكل عينة.
- تصدير البيانات إلى Microsoft Excel مضان. (للحصول على مقياس التألق لدينا، وهذا يتطلب تصدير البيانات كنص في شكل المفصول والاستيراد إلى Excel.) الحصول على منحنى المعايرة عن طريق حساب نسبة من مضان في 490 نانومتر إلى 450 نانومتر لكل خليط المعايرة. ثم يتم رسم نسبة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني للحصول على منحنى المعايرة.
- تحويل البيانات التجريبية إلى نسبة مضان وحساب الرقم الهيدروجيني باستخدام منحنى القياسية. يمكن درجة الحموضة فجوي ثم تآمر ضد الزمن (حركية التغييرات درجة الحموضة) أو مقارنة في ظل ظروف مختلفة (الشكل 1) أو في سلالات متحولة مختلفة.
2. قياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الجسم الحي باستخدام الخميرة pHluorin
- تحويل سلالة الخميرة المطلوب مع pHluorin الخميرة البلازميد بواسطة بروتوكولات موحدة، وحدد ل transformants على استكمال الحد الأدنى المتوسطة تفتقر اليوراسيل (SC-اليوراسيل).
- تنمو ثقافة السائل 50 مل من الخلايا تحولت في SC-اليوراسيل إلى مرحلة منتصف السجل (OD
- إعداد معايير المعايرة كما هو موضح لدرجة الحموضة فجوي، ولكن المخزن المؤقت لمجموعة ودرجة الحموضة المناسبة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي، ودرجة الحموضة عموما 6-8. قسامة 2 مل من العازلة معايرة تعديلها لدرجة الحموضة المطلوبة إلى عدة أنابيب مخروطية 15 مل. إضافة مونينسين وnigericin كما هو موضح أعلاه (1.4) وتخلط جيدا.
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه، و resuspend بيليه في 600 ميكرولتر من متوسط النمو. نقل إلى أنبوب microcentrifuge وزنه، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. Resuspend الكرية في 1 مل من متوسط النمو دون الجلوكوز (SC-اليوراسيل، الجلوكوز)، وخلايا بيليه مرة أخرى وتكرار. بعد الطرد المركزي النهائي، وإزالة طاف على أكمل وجه ممكن، وتزن بيليه الخلية. Resuspend الخلايا إلى كثافة النهائي من 0.5 جم / مل في SC-اليوراسيل مع عدم وجود الجلوكوز.
- إضافة 20 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل أنبوب من المخزن المؤقت معايرة وتخلط جيدا في خلاط دوامة. احتضان عند 30 درجة مئوية على الدوار طبلة الغزل لمدة 60 دقيقة.
- إعداد مقياس التألق لإثارة عند أطوال موجية 405 و 485 نانومتر والطول الموجي الانبعاثات من 508 نانومتر. المضي قدما في نقطة واحدة مرة أو القياسات الحركية وبالإضافة إلى ذلك من الجلوكوز كما هو موضح أعلاه لقياس BCECF.
- قياس مضان من عينات المعايرة، وبناء منحنى المعايرة كما لBCECF (انظر 1،10-1،11). قطعة من نسبة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني هو الخطية على نطاق معظم قياسات درجة الحموضة عصاري خلوي (درجة الحموضة 6.0-8.0) 9، وتحويلها بسهولة تجريبية ولذلك قياسات نسبة مضان لدرجة الحموضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 البيانات الحموضة فجوي الحصول على خلايا الخميرة البرية من نوع نمت في المتوسط الغني (خلاصة الخميرة، ببتون-ديكستران؛ YEPD) مخزنة لدرجة الحموضة 5 مع 50 ملي زارة التربية والعلم. ونحن غالبا ما تنمو الخلايا في متوسطة مخزنة لأن الرقم الهيدروجيني للمتوسطة يمكن أن تتغير بشكل كبير جدا خلال نمو بين عشية وضحاها، ولا سيما بالنسبة للالحد الأدنى من المتوسط، وقد وجدنا أن الرقم الهيدروجيني للمتوسط النمو يمكن أن تؤثر على استجابات درجة الحموضة فجوي 3. ومع ذلك، فإنه هو أيضا مقبول لكثير من التجارب لزراعة الخلايا في المتوسط غير مصقول. الشكل 1A يظهر منحنى المعايرة لخلايا حضنت مع BCECF-AM بواسطة بروتوكول أعلاه. على الرغم من أن العلاقة بين BCECF نسبة مضان ودرجة الحموضة فجوي هو غير الخطية على نطاق أوسع درجة الحموضة 7، فمن خطية تقريبا في نطاق ذات الصلة لهذه القياسات التجريبية، ويظهر خط اتجاه خطي وتستخدم لحساب قيم الرقم الهيدروجيني للتجربة. تغييرات درجة الحموضة فجوي الناتجة عن GLوترد بالإضافة إلى ucose الخلايا الجلوكوز المحرومين في الشكل 1B. زيادة درجة الحموضة فجوي خلال BCECF-AM وصفها لأن الخلايا الجلوكوز المحرومين، ولكن تنقص بعد readdition الجلوكوز، ويفترض نتيجة لتفعيل V-أتباز من خلال إعادة التجميع 3،4. ويلاحظ وجود زيادة طفيفة في درجة الحموضة فجوي على إضافة 50 ملي بوكل، بعد إضافة السكر في ثلاث دقائق. في دراسة أكبر، ونحن عادة تشغيل لا يقل عن ثلاثة تجارب مستقلة (البيولوجية مكررات) وتبين أن متوسط درجة الحموضة ± SE لكل حالة 3-5.
وتظهر حركية تغير الأس الهيدروجيني عصاري خلوي مع اضافة السكر في الشكل 2. لهذه التجربة، كانت تزرع خلايا الخميرة النوع البري في المتوسطة كاملة الاصطناعية تفتقر اليوراسيل (SC-اليوراسيل)، مخزنة لدرجة الحموضة 5 مع 50 ملي زارة التربية والعلم. هذه الوسيلة غير مناسبة لصيانة phluorin الخميرة التي تحتوي على البلازميد تحت سيطرة فسفوغليسرات كيناز (PGK) المروج،التي استخدمناها مؤخرا 3،5، وقد تطلب بعض البلازميدات غير ذلك من الظروف تحديد مختلف. منحنى المعايرة (الشكل 2A) يدل على أن استجابة ratiometric من pHluorin لدرجة الحموضة بشكل طولي على مدى واسع من درجة الحموضة؛ تغطي عموما أي درجة الحموضة عصاري خلوي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. استجابة الخلايا من النوع البري هو موضح هنا هي مميزة جدا؛ هناك انخفاض فوري في درجة الحموضة تليها زيادة درجة الحموضة 7،2-7،4 ل.
ونحن بناء منحنيات المعايرة لكل سلالة وفي كل تجربة. نحن نستخدم مزيج المعايرة الموقع صفها بريت آخرون في 9 لكلا BCECF والقياسات pHluorin. ويشمل هذا الخليط خلات الأمونيوم الخلوي نفيذ قادرة على انهيار التدرجات درجة الحموضة عبر أغشية متعددة، أزيد الصوديوم وdeoxyglucose لوقف إنتاج ATP وتمنع H + المضخات، ومونينسين وnigericin، ionophores المتورطين في انهيار التدرجات درجة الحموضة في الخميرة إفرازية / بطالةالنقل uolar مسارات 12 والغشاء الداخلي الميتوكوندريا 13، على التوالي. ومن الجدير بالذكر أننا لا طرح قيمة خلفية للخلايا أونلبلد للقياسات درجة الحموضة فجوي أو عصاري خلوي. على الرغم من أن الخلايا لديها بعض تألق ذاتي جوهري، قمنا مباشرة مقارنة قياسات درجة الحموضة مع وبدون تصحيح الخلفية على معايرة والعينات التجريبية وشهدت أي اختلاف في القيم النهائية. سوف خلفية الطرح يؤدي إلى منحنيات المعايرة أكثر حدة، وربما يكون من المرغوب فيه في ظل ظروف حيث إشارات مضان منخفضة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء يصبح مشكلة. على سبيل المثال، في قياس من جولجي / جسيم داخلي المترجمة pHluorin 5، الذي يعطي إشارة أقل عموما، وفعلنا طرح إشارة الخلفية من جميع القياسات.
الشكل 1. قياس آثافةوقد نمت ement من الاستجابات درجة الحموضة فجوي في البرية من نوع الخلايا التي تزرع في YEPD، ودرجة الحموضة 5. البرية من نوع (SF838-5Aα) الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل ومن ثم حضنت مع BCECF-AM كما هو موضح أعلاه. A. منحنى معايرة تبين قياس نسبة كثافة مضان من الإثارة في 490 نانومتر (I490) إلى كثافة من الإثارة في 450 نانومتر (I450) (وحدة القياس في الطول الموجي لانبعاث نانومتر 535) في درجة الحموضة متنوعة. يظهر خط الاتجاه الخطي. بعد B. رغوي تم قياس درجة الحموضة والحرمان الجلوكوز وجيزة في جزء من نفسه، التعليق الخلية المسمى (أي السكر). ثم أضيف السكر إلى تركيز النهائي من 50 ملم و تم قياس نسبة مضان بعد 5 دقائق (5 '+ الجلوكوز). ثم أضيف 50 ملي بوكل وتم قياس نسبة مضان بعد 3 دقائق وتحويلها إلى درجة الحموضة (3 '+ بوكل).
الشكل 2. حركية CYTتحولت استجابة درجة الحموضة osolic لإضافة الجلوكوز في الخلايا من النوع البري. البرية من نوع الخلايا مع pHluorin الخميرة تحت السيطرة من كيناز فسفوغليسرات (PGK) المروج وtransformants نمت كما هو موضح أعلاه. A. منحنى معايرة تبين نسبة قياس كثافة مضان في 405 وقد اشتق نانومتر (I405) إلى كثافة في 485 نانومتر (I485) في مقابل درجة الحموضة. B. عصاري خلوي درجة الحموضة من قياسات كثافة مضان تؤخذ كل 6 ثوانى. أكثر من 6 دقائق. الجلوكوز (50 ملي النهائية) تم إضافتها إلى الخلايا في كوفيت في الوقت المشار إليه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد استخدمت هذه البروتوكولات لمعالجة عدد من جوانب التوازن الرقم الهيدروجيني. على سبيل المثال، لدينا مقارنة الاستجابات عصاري خلوي ودرجة الحموضة من النوع البري وV-أتباز التي تعاني من نقص خلايا متحولة 4،5. لقد درست أيضا آثار تغير ظروف النمو، ودرجة الحموضة خارج الخلية بشكل خاص، على استجابة درجة الحموضة فجوي إلى جلوكوز 3. الأهم من ذلك أن استجابات نلاحظ على حد سواء بما يتفق مع أساليب أخرى لقياس درجة الحموضة الكمية ومع البيانات البيوكيميائية التي تصف الأنشطة المتغير للمضخات البروتون.
وهما أهم سمات نوع في قياسات درجة الحموضة في الجسم الحي الموصوفة هنا التعريب من fluorophore ومستوى إشارة، ومشاكل مع أي من هذه تتطلب التعديل من طريقة لتطبيق معين أو متحولة. توطين فجوي من BCECF هو محاسن إلى حد ما 6، ولكن يتم الاحتفاظ في عدد من المسوخ مختلفة، بما في ذلكالمسوخ الأهدل 4، مما أدى إلى تخفيض مستويات hydrolases فجوي. فجوات الخميرة هي تصور بسهولة عن طريق الفحص المجهري تحت البصريات Nomarski، ونحن نؤكد توطين فجوي من الصبغة لكل سلالة. pHluorin هو أكثر تنوعا وجهاز استشعار درجة الحموضة، ولا سيما في ضوء استجابتها على معظم نطاق الأس الهيدروجيني الفسيولوجية (الشكل 2A). وpHluorin الخميرة التي استخدمناها يبدو أن عصاري خلوي حصرا، ويفترض لأنه يفتقر إلى المعلومات الاستهداف الأخرى. ومع ذلك، فقد تم استهداف pHluorin إلى جهاز جولجي بواسطة وضع علامات مع تسلسل من كلوريد نقل جولجي Gef1، جنبا إلى جنب مع الإدراج إضافية من شرائح غشاء من halorhodopsin لإعطاء طوبولوجيا الصحيح (الرقم الهيدروجيني Gef1؛ 14). Orij وآخرون. استهدفت بنجاح pHluorin إلى المصفوفة الميتوكوندريا وقياس التغيرات الميتوكوندريا درجة الحموضة مع استقلاب 15. هذه النتائج تشير إلى أن البروتينات الانصهار مصممة بشكل صحيح قد يجعل من وقت possibجنيه لرصد الاستجابات درجة الحموضة في كثير من العضيات. إشارة إلى مستوى الضوضاء من فجوي BCECF عالية جدا في معظم سلالات الخميرة أننا قد درست. يمكن التلاعب بها إشارة من البروتينات pHluorin أعرب عبر المروج القيادة pHluorin التعبير. في النص الأصلي عصاري خلوي pHluorin بناء 9، كان مدفوعا من قبل التعبير صدمة الحرارة المحتوية على عنصر المروج وكان يست عالية جدا. ومع ذلك، تظهر في وقت لاحق بنيات التعبير من المروج PGK، TEF1 المروج، والمروج الأكتين لإعطاء مستويات أعلى من التعبير 3،15،16. يتم التعبير عن جولجي محددة pHluorin الرقم الهيدروجيني Gef1 من المروج محرض 14. تحريض عابر التعبير قد يكون مفيدا بشكل خاص للمقصورات أصغر من إفرازية والتقامي مسارات، حيث استمرار ارتفاع مستوى التعبير يمكن أن يؤدي إلى pHluorin mislocalization أو حتى اضطرابات في درجة الحموضة مقصورة، واضح من خلال النمو البطيء أو mislocalization من البروتينات الأخرى.
<فئة P = "jove_content"> وبالإضافة إلى خصائص fluorophores، فمن المهم أن ندرك أن في قياسات درجة الحموضة في الجسم الحي حساسة لنمو وشروط التمثيل الغذائي في خلايا الخميرة أنفسهم. هذه الحساسية هي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ويحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام، ولكن يمكن أيضا أن تكون مصدرا للتقلب بين القياسات. نحن نحرص على مقارنة القياسات من خلايا الخميرة في مرحلة النمو نفسه، وعادة في وقت مبكر إلى مرحلة منتصف لوغاريتمي. لأن الاستجابات درجة الحموضة فجوي يمكن أن تكون حساسة لدرجة الحموضة خارج الخلية 3، نحن نراقب الرقم الهيدروجيني للمتوسطة النمو، ولا سيما بالنسبة للخلايا نمت في المتوسط غير مصقول. في حين أنه من الواضح أن العديد من وسائل الاعلام النمو المختلفة متوافقة مع أجهزة قياس الأس الهيدروجيني ratiometric، يمكن أن الاختلافات في تكوين المتوسطة تؤثر بالتأكيد درجة الحموضة 17. وبالإضافة إلى ذلك، بعد أن يتم حصاد الخلايا والتي أعدت لقياس، وجدنا أن الحرمان الجلوكوز لفترات طويلة (ساعة) يقلل من CYT الأولية ليس فقطالرقم الهيدروجيني osolic ويزيد من درجة الحموضة فجوي الأولي، ولكن أيضا يؤدي إلى إبطاء ملحوظ الردود على الجلوكوز. ولذلك، فإننا بدء التجارب عموما في غضون 30 دقيقة. أو أقل من بداية الحرمان الجلوكوز.وقد استخدم تراكم الأمينات lysosomotropic فلوري، مثل كيناكرين وأكريدين البرتقال، على نطاق واسع لتقييم تحمض حجرة المعيشة في خلايا الخميرة. هذه الأساليب هي سريعة وبسيطة، ولكن ينبغي أن يعتبر أكثر من ذلك بكثير النوعية من القياسات ratiometric من الحموضة. بشكل عام، وطرق مثل امتصاص كيناكرين تعتمد على نفاذية غشاء من الشكل الأساسي من fluorophore، التي أصبحت شرك عند البروتونية أنه في مقصورة الحمضية، ويمكن تصور تحت المجهر مضان 18. تراكم الصبغة يعتمد على تقسيم وفقا لدرجة الحموضة التدرج عبر الغشاء، وبالتالي امتصاص في العضيات الحمضية يمكن أن تضعف إما عن طريق تقلية من عضية أو acidificatiعلى من العصارة الخلوية. ستبقى هذه الأساليب مفيدة، ولكن ربما ينبغي أن تفسر على أنها توفير المستوى النسبي للتحمض.
تواصل تطبيقات ratiometric قياس الأس الهيدروجيني pH الفلورسنت في الخميرة في التوسع. بريت وآخرون. قياس درجة الحموضة فجوي مؤخرا في جمع أكثر من 4500 غير الضرورية المسوخ الحذف الخميرة وكشف عدد من الآليات الجديدة لتنظيم درجة الحموضة 17. كما تم تكييفها BCECF وpHluorin 19،20 إلى خلية مضان تنشيط الفرز تنسيق لتسهيل الكشف عن مثبطات الجديدة V-أتباز. Dechant وآخرون. 11 على microfluidics تستخدم في تركيبة مع المجهري مضان لرصد V-أتباز التجمع ودرجة الحموضة عصاري خلوي في وقت واحد من خلال دورات متعددة من الحرمان الجلوكوز وreaddition. هذه النتائج تشير إلى أن القياسات ratiometric من درجة الحموضة في الخميرة هي قوية وتنوعا ليتم تطبيقها في العديد من أنواع التجارب بما فيه الكفاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM50322 R01 لكين PM. الكتاب أشكر الدكتور راجيني راو، جامعة جونز هوبكنز لتوفير الخميرة البلازميدات pHluorin وللحصول على المشورة بشأن قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric، والدكتور غلوريا A. مارتينيز مونيوز على العمل بها هذه البروتوكولات لمختبرنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
