Summary
可以测量活酵母液泡膜和细胞内pH值（
Abstract
在酵母细胞中液泡和胞质pH值受到高度监管和整体pH值稳态占据了核心作用。我们描述了协议的比例测量pH值在体内使用pH敏感的荧光团本地化液泡或细胞质。 BCECF，乙酰甲酯形式导入细胞时，它定位在酵母液泡液泡pH值是衡量使用。细胞质pH值的测量是对pH敏感的绿色荧光蛋白表达的酵母启动子的控制下，酵母pHluorin所指示。在荧光计中的酵母细胞悬浮液的荧光比的测量方法进行说明。通过这些协议，单一时间点的pH值测量不同条件下或在不同的酵母突变体进行了比较，并已监测pH值的变化随着时间的推移。这些方法也适合于高通量实验的荧光板读数器的格式。比例比其他AP的pH测量的优点接近目前的用途，潜在实验的问题和解决方案，以备将来使用这些技术的前景也有所说明。
Introduction
pH值的平衡是一个充满活力和高度调节的过程中，在所有的生物1,2。生化过程严格监管的pH值，细胞内环境的调整，以使优化常住酶的活性狭窄的pH值范围。然而，细胞内pH稳态可以挑战的快速变化环境的pH值，代谢变化，以及某些信号传导通路。此外，细胞内pH值本身可以作为一个重要的信号。最后，许多细胞器保持腔的pH值是不同于周围的胞质溶胶和必需的细胞器的特定功能。
酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）股数与高等真核生物2的pH的体内平衡机制。酸性细胞内吞/溶酶体途径，pH值主要控制高度保守的空泡质子转运ATP酶（V-ATP酶），随许多EXCHAN蒙古包依赖于pH梯度。所有真核细胞中也有质子出口机制。在真菌和植物，在质膜上的第二，不同的质子泵，PMA1，出口代谢质子和被认为是细胞内pH值和细胞膜电位的主要决定因素。 S.遗传灵活性酵母和其商业上的重要性，提出了一个非常有趣和重要的研究pH值稳态模型2。
除了细胞器酸化的主要驱动，V-ATP酶被高度管制的酶和我们实验室的兴趣了解V-ATPase的调节机制。为了实现这一目标，我们一直在使用液泡和胞质pH值在体内 pH值的测量：1）监测反应改变外条件，如葡萄糖的剥夺和readdition，2）审查突变，妥协V-ATPase活性的影响， 3）探索COORdination细胞器和质膜质子泵3-5。这些实验通过强劲的比例适合于使用在酵母细胞中的pH值指标的发展才成为可能。厂房等人首先表明，BCECF（2'7'-二（2 -羧基乙基）-5 - （6） -羧基荧光素），它已被广泛应用，以测量细胞内pH值在哺乳动物细胞中，积聚在酵母液泡而不是在细胞质6。这种差异在BCECF本地化已被归因于液泡中的水解酶，这是有可能负责裂解乙酰氧甲基酯BCECF-AM（乙酰氧基甲基酯，BCECF）和液泡保留6。阿里等人进一步开发的液泡pH测量使用BCECF，适应这些测量荧光酶标仪格式。布莱特等人介绍了酵母pHluorin所指示由表达质粒源性ŗ的在酵母细胞内pH值的测定作为一种手段pH敏感的绿色荧光蛋白atiometric 8酵母特异性启动子的控制下9。
BCECF酵母pHluorin所指示的激发光谱是对pH敏感的，因此它们被用作比例的pH值如下：两个激发波长，在一个单一的发射波长测量，荧光的比例提供了一个衡量的pH为8,10。这些酵母液泡和胞质pH传感器已用于单细胞和人口为基础的测量。 6,11测量单细胞进行荧光显微镜和图像分析。液泡膜或胞浆上面的两个波长的荧光的测量为每个小区。人口为基础的测量进行适当的荧光功能酶标仪或荧光计中。我们通常是在荧光计测量，因为它提供了方便添加组件，如葡萄糖在con连续动力学测量。下面列出我们目前实验室协议液泡和胞质pH值的测量，二者也容易适应微孔板检测。
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Protocol
1。 BCECF-AM 在体内使用液泡pH值测量
- 长出一个50毫升的液体培养过夜所需的媒体要被测量的酵母菌株。我们的目标是有细胞数中期（OD值（在600nm处的光密度）为约0.8的悬浮液中的测量）。
- 颗粒通过离心分离酵母细胞。悬浮颗粒0.6毫升培养基中生长和转移到已称重的离心管。颗粒细胞再次离心2,000 XG，持续60秒。尽可能完全去除上清，然后权衡细胞沉淀。重悬沉淀至最终密度为0.5克/毫升（重量/体积），将被添加到本卷文化将得到约200毫克的细胞沉淀，加入200μl缓冲液使最终体积为400μl。
- 添加BCECF-AM的细胞悬浮液从12毫米的股票，在DMSO中制备终浓度为50mM的。拌匀，然后公司ubate细胞在30℃下30分钟。在摇摆平台或辊筒。
- 虽然细胞培育，准备校准缓冲区。校准的缓冲液含有50mM的MES（2 - （N-吗啉代）乙磺酸），50mM的HEPES（4 - （2 - 羟基乙基）-1 - 哌嗪乙磺酸），50mM的氯化钾，氯化钠的50mM乙酸铵，0.2M，的10mM叠氮化钠，10mM的2 - 脱氧葡萄糖，并已被调整，以将pH值适当的校准范围内，用NaOH或HCl。 （注意：叠氮化钠是剧毒，应小心处理。）在野生型细胞中的pH值的测量，我们会准备几个校准混合物在pH值5.5至6.5，但预计将有更碱性空泡，pH值的突变体（ VMA突变），我们会准备更多，更高的pH缓冲液。
- 各pH校准缓冲分装2毫升到15毫升锥形管，并添加莫能菌素（15毫米的股票）和尼日利亚菌素（2毫股票）给最终浓度莫能110微米和15微米尼日利亚菌素，Respectively。拌匀的旋涡混合器。 （注意：莫能菌素，尼日利亚菌素是有毒的，应谨慎处理。）
- 当BCECF-AM孵育时间完成后，沉淀细胞悬浮液通过离心分离，持续30秒，在2000×g离心微量离心。重悬细胞为1毫升生长培养基中缺乏葡萄糖和离心机如上。重复该洗涤步骤一次，然后将沉淀重悬于200微升生长培养基中不含葡萄糖。置于冰上。
- 的细胞悬浮液中加入20μl上述制备的各pH校正管。在30°C孵育30-60分钟。辊式转鼓上。
- 设置的荧光计，交替测量在激发波长450纳米和490纳米的发光波长为535 nm。样品室的温度设定至30℃。在连续搅拌下将混合物在比色皿中执行的所有测量。
- 加入1.96毫升1 mM的MES（调整至pH为5或7的pH值取决于细胞的生长培养基中的一个ND实验设计）。到试管中，加入20μl的细胞悬液。启动荧光测量。我们同时收集连续的动能和时间点在不同的实验数据。对于连续的动力学数据，每6秒测量5分钟，然后添加葡萄糖至最终的50mM的葡萄糖浓度，并继续测量5-10分钟。对于单一时间点的测量，我们一般采取的测量在1和5分钟。加入比色皿的细胞后，添加葡萄糖在动力学测量，然后进行下一次测量5分钟。后加入葡萄糖。这些增加的可以是多种多样的，并且，也可以添加额外的组件（抑制剂等）。
- 实验测量完成后，取出校准管从30°C孵育，整个2毫升的量为每次转移的荧光计比色皿。荧光测量在相同的设置（见1.8），每隔5秒，共30秒以上，每个样品。
- 荧光数据导出到Microsoft Excel。 （对于我们的荧光计，这要求出口数据作为制表符分隔的形式导入到Excel中的文本。）获得校准曲线计算荧光的比例在490纳米至450纳米每个校准混合物。的荧光的比率，然后与pH值的关系作图得到的校准曲线。
- 实验数据转换荧光比使用标准曲线计算pH值。液泡膜的pH值，然后随时间（动力学的pH值的变化），或者在各种条件下（ 图1），或在不同的突变株相比。
2。 在体内使用酵母pHluorin所指示胞内pH值的测量
- 变换pHluorin所指示质粒标准协议与酵母所需的酵母菌株，并选择补充基本培养基缺乏尿嘧啶（SC-尿嘧啶）的转化。
- SC-尿嘧啶转化细胞长出了50毫升液体培养数中期（OD
- 准备校准标准所描述的液泡中的pH值，但缓冲区适当的pH值范围为胞质pH测量，一般pH值6-8。等分试样2毫升校准缓冲液调节到所需的pH值到15毫升锥形管的一些。添加莫能菌素，尼日利亚菌素（1.4）如上所述，拌匀。
- 如上所述通过离心收集细胞，将沉淀重悬于600微升生长培养基中。转移至称量微量离心管中，沉淀细胞，在5,000 rpm离心30秒。将沉淀重悬于1毫升生长培养基中没有葡萄糖（SC-尿嘧啶，葡萄糖），再次沉淀细胞，并重复。最后离心后，除去上清液尽可能彻底和权衡细胞沉淀。重悬细胞至最终密度为0.5克/毫升的SC-尿嘧啶没有葡萄糖。
- 加入20μl的细胞悬液，每管校准缓冲的旋涡混合器拌匀。孵育30℃60分钟，一个旋转的鼓形转子。
- 设置为在波长405和485nm的激发和发射波长为508 nm的荧光计。继续进行，单一的时间点或动力学测量和BCECF测量上述用于添加葡萄糖。
- 测量荧光校准样品，并构建BCECF（1.10-1.11）的校准曲线。 A地块的荧光比与pH值线性范围最胞质pH值测量值（PH值6.0-8.0）9，实验很容易转换荧光比率测量pH值。
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Representative Results
图1给出营养丰富的培养基中生长的野生型酵母细胞（酵母提取物，蛋白胨-葡聚糖YEPD）与50毫米的MES缓冲pH值至5液泡pH值获得的数据。我们经常在缓冲介质中生长的细胞，因为培养基的pH变化相当显着的期间，特别是对基本培养基中生长过夜，我们已经发现，生长培养基的pH值可能会影响液泡pH值的反应3。然而，也可以接受多次实验，在非缓冲培养基中生长的细胞。 图1A显示了细胞与BCECF-AM由协议所示的校准曲线。虽然BCECF荧光比值和液泡pH值之间的关系是非线性的，在更宽的pH范围内7，它几乎是线性的有关范围内的这些实验测量，示出的线性趋势线，并用来计算实验的pH值。液泡pH值的变化，导致从GLucose除了葡萄糖剥夺细胞， 如图1B所示。液泡pH值增加过程中的BCECF-AM标记，因为细胞缺糖，但会降低糖readdition后，大概是由于通过重组3,4 V-ATP酶的活化的结果。除了50毫米氯化钾，三分钟后，加入葡萄糖后观察到液泡pH值略有增加。在一个更大的研究中，我们通常运行至少三个独立的实验（生物）和3-5每个条件显示pH平均值±SE。
的动力学与葡萄糖此外，细胞内pH值的变化如图2所示。在这个实验中，野生型酵母细胞生长在缺乏尿嘧啶（SC-尿嘧啶）的合成完全培养基，用50mM MES缓冲至pH5。此介质是适当的维护pHluorin所指示的磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子控制下的含质粒的酵母，我们已经使用了最近3,5;其他的质粒可能需要不同的选择条件。校准曲线（ 图2A），表明pHluorin所指示的比例反应pH值在很宽的pH范围内是线性的，一般覆盖任何生理上相关的胞液的pH。此处所示的野生型细胞的响应非常有特点，有增加至pH为7.2-7.4的pH值，然后立即减少。
每个菌株和在每一个实验中，我们构建校准曲线。我们使用一个由布莱特等人描述的现场校准混合物。9 BCECF pHluorin所指示测量。这种混合物包括细胞透性的铵醋酸能够跨多个膜pH梯度崩溃的叠氮化钠和脱氧停止生产ATP抑制的H +泵，莫能菌素，尼日利亚菌素，离子载体牵连崩溃pH梯度的酵母分泌/ VACuolar运输途径分别为12和线粒体内膜13，。值得注意的是，我们不减去背景值未标记细胞空泡或细胞内pH值的测量。虽然有一些固有的自体荧光的细胞，我们已经直接比较与无背景校正的校准和实验样品的pH测量，并没有看到在最终值的差异。背景相减将导致校准曲线较陡，可能是可取的条件下荧光信号的低信号噪声比成为一个问题。例如，在测量从高尔基/内体本地化pHluorin所指示，这给出了一个较低的总体信号，我们做了所有测量值中减去背景信号。
图1。测量键相生长在YEPD培养基，pH值为5。野生型细胞（SF838-5Aα）中的野生型细胞中的液泡的pH响应数中期生长，然后温育与BCECF-AM，如上所述。A.校正曲线示出测量从激发的荧光强度比，在490 nm处的强度（I490），以从激发在450nm处（I450）（包括在发光波长为535 nm）测定在多样化的pH值。所示的线性趋势线经过短暂的葡萄糖剥夺B.液泡pH值测定中一样，标记的细胞悬浮液（无葡萄糖）的一部分。然后加入终浓度为50mM的葡萄糖和5分钟（5'+葡萄糖）后，测定荧光强度。然后加入50mM的氯化钾，3分钟后，测定荧光强度，并转换为pH值（3'+氯化钾）。
图2。细胞色素动力学pH响应，在野生型细胞中，野生型细胞的葡萄糖除了osolic转化的酵母pHluorin所指示的磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子和转化上述生长的控制下，A.的校正曲线示出在405nm测得的荧光强度比纳米（I405）的强度在485纳米（I485）与pH值B.胞质pH值来自荧光强度测量每6秒。超过6分钟。葡萄糖（50mM的最终）加入到细胞中，在指定的时间的比色皿中。
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Discussion
我们利用这些协议处理若干方面的pH稳态。例如，我们已经比较4,5野生型和V-ATP酶缺陷的突变细胞的细胞质和pH响应。我们还研究改变生长条件，尤其是细胞外pH值，葡萄糖3液泡pH响应的影响。重要的是，我们观察到的响应都与其它方法定量的pH测量和一致的生化数据，描述改变质子泵活动。
这里所描述的两个最重要的功能不同的体内 pH测量的荧光基团的本地化和信号的电平，使用其中任一问题需要修改的特定应用程序的方法或突变。 BCECF在液泡中有点偶然的6，但保留在许多不同的突变体，包括vma的突变体4，空泡水解酶的水平降低。酵母的空泡是容易的Nomarski光学显微镜下可视化，我们确认每一株液泡中的染料。 pHluorin所指示作为pH传感器的功能更加多样化，特别是考虑到其在大部分的生理pH范围内（ 图2A）的响应。酵母pHluorin所指示我们已经使用似乎是专门胞浆，大概是因为它缺乏其他的定位信息。然而，pHluorin所指示已经有针对性地高尔基体高尔基体氯转运GEF1的从序列标记，以及一个额外的插入从halorhodopsin膜分部给予适当的拓扑（pH值GEF1 14）。成功锁定orij 等 pHluorin所指示的线粒体基质和测量线粒体代谢15的 pH值的变化。这些结果表明，设计适当的融合蛋白可能使possib文件监控pH值在许多细胞器的响应。液泡BCECF噪声电平的信号是相当高的，在大多数的酵母菌株，我们已审查。 pHluorin所指示蛋白表达的信号可以被操纵，通过启动子驱动pHluorin所指示的表达。在原来的胞浆pHluorin所指示构造9，热休克元素含有启动子驱动的表达，不是很高。然而，后来出现从PGK启动子，TEF1发起人，和肌动蛋白启动子的表达结构的表达3,15,16给予更高的水平。 pHluorin所指示的高尔基体特定的pH值GEF1表达诱导型启动子14。瞬态诱导表达可能是特别有用分泌和内吞途径，持续高水平表达可能导致pHluorin所指示的错误定位，甚至扰动室pH值通过缓慢增长或其他蛋白质的错误定位，体现的小隔间。
<P类=的“jove_content”>除的荧光基团的特性，重要的是要认识到， 在体内的pH测量是敏感的酵母细胞本身的生长和代谢条件。这种敏感性是生理上相关的，潜在的有趣的，但也可以是一个测量值之间的变异源。我们照顾测量从酵母细胞进行比较，在相同的成长阶段，通常是早期到中期对数生长期。由于液泡pH值响应可以是敏感的细胞外pH值3，我们监测生长培养基的pH值，特别是对无缓冲介质中生长的细胞。虽然很明显，许多不同的生长介质兼容比例测量pH值，培养基成分的差异，绝对可以影响pH值17。此外，后收获细胞并准备测量时，我们已经发现，长时间葡萄糖剥夺（小时）不仅降低了初始的细胞色素osolic pH值和增加的初始的液泡中的pH值，而且还显着地减慢对葡萄糖的反应。因此，我们一般会在30分钟内开始实验。或开始葡萄糖剥夺。荧光的溶酶体营养胺，如喹吖和吖啶橙，积累已被广泛使用，以评估在活酵母细胞中的隔室酸化。这些方法是快速，简便，但应被视为比比例测量的pH值的定性等等。奎纳克林摄取的方法，如在一般情况下，依赖于膜透性的荧光基团的基本形式，当它被质子化的酸性隔室，并且可以在荧光显微镜下18可视化成为包埋。染料的积累依赖于根据穿过膜的pH梯度的分区，因此可减弱酸性细胞摄取到由细胞器或acidificati的任一碱化对细胞质。这些方法将保持有用的，但应该被解释为提供一个相对电平酸化。
在酵母的比例荧光pH测量中的应用不断扩大。布雷特等最近液泡pH值测量，收集超过4500非必要的酵母缺失突变，并发现了一些新机制调节pH 17。 BCECF和pHluorin所指示19,20也适于荧光激活细胞分选的格式，以方便为新的V-ATP酶抑制剂的筛选。 等德坎特11荧光显微镜结合使用微流体监测同时V-ATPase的组件和胞质pH值通过多个周期缺糖readdition的。这些结果表明，在酵母中的比例测量的pH值是足够强大的多功能被应用在许多类型的实验。
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Disclosures
作者有没有利益冲突的披露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院R01 GM50322支持到PM凯恩。作者感谢pHluorin所指示的酵母质粒和建议比例pH值测量的约翰斯·霍普金斯大学博士饶Rajini，，凯莱博士A.马丁内斯·穆尼奥斯这些协议，我们的实验室工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
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