Summary
Vacuolær og cytosol pH kan måles i levende gær (
Abstract
Vacuolær og cytosoliske pH er stærkt reguleret i gærceller og indtager en central rolle i den samlede pH homøostase. Vi beskriver protokoller til ratiometrisk måling af pH i vivo under anvendelse af pH-følsomme fluoroforer lokaliseret til vakuolen eller cytosolen. Vacuolær pH måles med BCECF, som lokaliseres til vakuolen i gær, når den indføres i celler i sin acetoxymethylester formular. Cytosolisk pH måles med en pH-følsom GFP udtrykkes under kontrol af en gærpromotor, gær pHluorin. Metoder til måling af fluorescens nøgletal i gær celle suspensioner i et fluorimeter beskrevet. Gennem disse protokoller, enkeltdoser tidspunkt målinger af pH under forskellige forhold eller i forskellige gærmutanter blevet sammenlignet, og ændringer i pH over tid er blevet overvåget. Disse metoder er også blevet tilpasset til en fluorescenspladelæser format for høj-throughput eksperimenter. Fordele ved ratiometrisk pH målinger over andre APindfaldsvinkler bruges i øjeblikket, potentielle eksperimentelle problemer og løsninger, og udsigterne til fremtidig brug af disse teknikker er også beskrevet.
Introduction
pH homeostase er en dynamisk og stærkt reguleret proces i alle organismer 1,2. Biokemiske processer er stramt reguleret af pH, og intracellulære miljøer er tunet til smalle pH-områder for at tillade optimal aktivitet af de residente enzymer. Dog kan intracellulær pH homeostase blive udfordret af hurtige ændringer i miljøet pH, metaboliske forskydninger, samt visse signalveje. Desuden kan intracellulær pH i sig selv tjene som et vigtigt signal. Endelig har mange organeller opretholde luminale pH-værdier, som er forskellige fra den omgivende cytosolen og afgørende for organel-specifikke funktioner.
Gær Saccharomyces cerevisiae deler en række pH homeostase mekanismer med højere eukaryoter 2. I de sure organeller i endocytiske / lysosomale vejen er pH primært styret af højkonserveret vakuolær proton-translocating ATPase (V-ATPase), der optræder sammen med mange exchangers afhængige af pH-gradienten. Alle eukaryote celler også proton eksport mekanismer. I svampe og planter, et sekund, der adskiller proton pumpe på plasmamembranen, Pma1, eksport metaboliske protoner og menes at være den afgørende faktor for cytosol pH og plasma membran potentiale. Den genetiske fleksibilitet S. cerevisiae og dens kommercielle betydning, har gjort det til en meget interessant og vigtig model for at studere pH homeostase 2..
Ud over at være de primære drivkræfter for organel forsuring, er V-ATPaser stærkt reguleret enzymer og vores lab er interesseret i at forstå mekanismerne i V-ATPase regulering. Til dette mål, har vi brugt in vivo pH målinger af vacuolær og cytosol pH: 1) at overvåge reaktioner på skiftende ekstracellulære forhold, såsom glucose afsavn og readdition, 2) at undersøge virkningerne af mutationer, der kompromitterer V-ATPase aktivitet, og 3) at udforske koordinering af organel og plasma membran protonpumperne 3-5. Disse eksperimenter blev kun mulig gennem udvikling af robuste ratiometrisk pH indikatorer medgørlig at bruge i gærceller. . Plant m.fl. først viste at BCECF (2'7'-bis-(2-carboxyethyl) -5 - (og 6)-carboxyfluorescein), der har været anvendt bredt til at måle cytosolisk pH i pattedyrceller, ophobes i gær vakuolen i stedet for cytosol 6.. Denne forskel i BCECF lokalisering er blevet tilskrevet de mange hydrolytiske enzymer i vakuolet, som sandsynligvis er ansvarlig for spaltning af acetoxy-methylester fra BCECF-AM (acetoxymethyl ester af BCECF) og vacuolær tilbageholdelse 6.. Ali et al. 7. videreudviklet vacuolær pH-måling med BCECF og tilpasset disse målinger til en fluorescenspladelæser format. Brett et al. Indført gær pHluorin som et middel til at måle cytosolisk pH i gær ved at udtrykke en plasmidbåret ratiometric pH-følsom GFP 8 under styring af en gær-promotor 9.
Excitation spektre af både BCECF og gær pHluorin er følsomme over for pH, så de anvendes som ratiometrisk pH indikatorer, hvor forholdet af fluorescens ved to excitationsbølgelængder, målt på en enkelt emissionsbølgelængde, giver et mål for pH 8,10. Disse gær vakuolære og cytosol pH-sensorer er blevet brugt til både encellede og populations-baserede målinger. Encellede målinger 6,11 udføres af fluorescens mikroskopi og billedanalyse. Vacuolær eller cytosoliske fluorescens ved to bølgelængder måles for hver celle. De populationsbaserede Målingerne er udført i enten en mikropladeaflæser med passende fluorescens evner eller i et fluorimeter. Vi har generelt gjort vores målinger i et fluorimeter, fordi det giver nem adgang for tilsætning af komponenter såsom glucose under conbende kinetiske målinger. Vores nuværende lab protokoller for måling af vacuolær og cytosoliske pH er listet nedenfor, begge er også let tilpasses til mikroplatte assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Måling af vacuolær pH in vivo under anvendelse BCECF-AM
- Dyrk en 50 ml flydende kultur af gærstammen, der skal måles i det ønskede medium natten over. Målet er at have celler i midten-log-fase (OD600 (optisk tæthed ved 600 nm) måling af cirka 0,8 til suspensionen).
- Pellet gærcellerne ved centrifugering. Pellet resuspenderes i 0,6 ml af vækstmediet og overførsel til et mikrocentrifugerør, der er blevet vejet tidligere. Pellet cellerne igen i en mikrocentrifuge ved 2.000 xg i 60 sek. Fjern supernatanten så fuldstændigt som muligt og vejes cellepelleten. Pelleten resuspenderes til en endelig densitet på 0,5 g / ml (w / v) en kultur af denne mængde vil give en cellepellet på ca 200 mg, og 200 pi puffer vil blive tilføjet for at give et endeligt volumen på 400 ul.
- Tilføj BCECF-AM til cellesuspensionen til en endelig koncentration på 50 mM fra en 12 mM stamopløsning fremstillet i DMSO. Bland godt og derefter incUbate cellerne ved 30 ° C i 30 min. på en vippende platform eller rulle tromlen.
- Mens cellerne inkubere, forberede kalibreringsbuffere. Kalibreringen buffer indeholder 50 mM MES (2 - (N-morpholino) ethansulfonsyre), 50 mM HEPES (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre), 50 mM KCI, 50 mM NaCl, 0,2 M ammoniumacetat, 10 mM natriumazid og 10 mM 2-deoxyglucose og justeres til pH-værdierne passer til din kalibreringsområde med NaOH eller HCl. (Forsigtig: Natriumazid er meget giftigt og bør håndteres med forsigtighed.) Til måling af pH i vildtypeceller, ville vi forberede flere kalibrerings blandinger ved pH 5,5 til 6,5, men for mutanter forventes at have en mere basisk vakuolær pH ( VMA mutanter), ville vi forberede yderligere, højere pH buffere.
- Alikvot 2 ml kalibrering buffer for hver pH i 15 ml koniske rør og tilføje monensin (15 mM materiel) og nigericin (2 mM lager) for at give de endelige koncentrationer på 110 uM monensin og 15 uM nigericin, respectively. Bland godt på en vortex-blander. (Advarsel: Både monensin og nigericin er giftige og bør håndteres med forsigtighed.)
- Når BCECF-AM inkubationstid er afsluttet, pellet cellesuspensionen ved centrifugering i 30 sekunder ved 2.000 xg i en mikrocentrifuge. Cellerne er 1 ml vækstmedium mangler glucose og centrifugeres som ovenfor. Gentag denne vasketrin gang, og derefter pellet resuspenderes i 200 pi vækstmedium uden glucose. Sted på is.
- Tilsæt 20 ul af cellesuspensionen til hver pH-kalibrering rør fremstillet ovenfor. Inkuber ved 30 ° C i 30-60 min. på en rulle tromle.
- Sæt fluorimeteret der måles skiftevis på excitationsbølgelængder 450 nm og 490 nm, begge med en emission bølgelængde på 535 nm. Indstil prøvekammeret temperaturen til 30 ° C. Udfør alle målinger med kontinuerlig omrøring af blandingen i kuvetten.
- Tilføj 1,96 ml 1 mM MES (justeret til pH 5 eller 7, afhængigt af pH af cellernes vækstmedium ennd det eksperimentelle design). Tilsæt 20 ul cellesuspension i kuvetten. Indled fluorescens målinger. Vi indsamler både kontinuerlig kinetisk og tid-punkt data i forskellige eksperimenter. For kontinuerlige kinetiske data, tager vi målinger hver 6 sek til 5 min, hvorefter der tilsættes glucose til en endelig glucosekoncentration på 50 mM, og fortsætte målingen i 5-10 minutter. For enlige tid punkts målinger, vi generelt tager målinger ved 1 og 5 min. efter tilsætning af celler til kuvetten, tilføje glucose som i de kinetiske målinger, og derefter tage endnu en måling 5 min. efter glucose tilsætning. Disse tilføjelser kan varieres, og yderligere komponenter (inhibitorer, osv.) kan også tilsættes.
- Efter de eksperimentelle målinger er færdig, fjernes kalibrering rør fra 30 ° C inkubation og overføre hele 2 ml volumen for hver at fluorimeteret kuvette. Måle fluorescens ved de samme indstillinger (se 1.8) hver 5 sek over en periode på 30 sek for hver prøve.
- Eksport fluorescens data til Microsoft Excel. (For vores fluorimeter kræver denne eksport af data som tekst i tabulatorsepareret form og import i Excel.) Anskaf en kalibreringskurve ved at beregne forholdet af fluorescens ved 490 nm til 450 nm for hver kalibrering blanding. Den fluorescens forhold afbildes derefter mod pH for at få en kalibreringskurve.
- Konverter de eksperimentelle data til fluorescens ratio og beregne pH ved hjælp af standardkurven. Vacuolær pH kan derefter afbildes mod tiden (kinetik af pH-ændringer) eller sammenlignet under forskellige betingelser (figur 1) eller i forskellige mutantstammer.
2. Måling af cytosolisk pH in vivo under anvendelse Gær pHluorin
- Omdanne den ønskede gærstamme med gæren pHluorin plasmidet ved standardprotokoller, og selektere for transformanter på suppleret minimalmedium uden uracil (SC-uracil).
- Dyrk en 50 ml flydende kultur af transformerede celler i SC-uracil til midt-log-fase (OD
- Forbered kalibreringsstandarder som beskrevet for vacuolær pH, men puffer til en pH-område passende til cytosoliske pH-målinger, generelt pH 6-8. Aliquot 2 ml kalibrering puffer justeret til den ønskede pH-værdi i flere 15 ml koniske rør. Tilføj monensin og nigericin som beskrevet ovenfor (1.4) og bland godt.
- Cellerne høstes ved centrifugering som beskrevet ovenfor, og pellet resuspenderes i 600 ul af vækstmediet. Overførsel til en afvejet mikrocentrifugerør, og pellet cellerne ved centrifugering ved 5.000 rpm i 30 sek. Pellet resuspenderes i 1 ml vækstmedium uden glucose (SC-uracil-glucose), pellet cellerne igen og gentage. Efter den sidste centrifugering, supernatanten fjernes så grundigt som muligt og vejer cellepelleten. Resuspender celler til en endelig densitet på 0,5 g / ml i SC-uracil uden glucose.
- Tilsæt 20 gl cellesuspension til hvert rør for kalibrering buffer og bland godt på en vortex-blander. Inkuber ved 30 ° C på en roterende tromle rotor i 60 min.
- Opsætning fluorimeteret for excitation ved bølgelængder 405 og 485 nm og emission bølgelængde på 508 nm. Fortsæt med enkelt tidspunkt eller kinetiske målinger og tilsætning af glucose som beskrevet ovenfor for BCECF måling.
- Mål fluorescens kalibreringsprøver, og konstruere en kalibreringskurve som for BCECF (se 1,10-1,11). Et plot af fluorescens forholdet vs pH er lineær i intervallet for de fleste cytosole pH-målinger (pH 6,0-8,0) 9, er så eksperimenterende fluorescens forhold målinger nemt omdannes til pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser vakuolære pH fremkomne data om vildtype gærceller dyrket i rigt medium (gærekstrakt-peptonagtig dextran, YEPD) til pH 5 med 50 mM MES. Vi ofte vokser cellerne i pufret medium, da pH-værdien af mediet kan ændre sig dramatisk i løbet af natten vækst, navnlig for minimalmedium, og vi har fundet, at pH af vækstmediet kan påvirke vakuolære pH reaktioner 3.. Men det er også acceptabelt for mange eksperimenter at dyrke cellerne i bufferet medium. 1A viser en kalibreringskurve for celler inkuberet med BCECF-AM af protokollen ovenfor. Selvom sammenhængen mellem BCECF fluorescens ratio og vacuolær pH er ikke-lineær over et bredere pH-område 7, er det næsten lineær i det relevante område for disse eksperimentelle målinger, og en lineær tendenslinje er vist og anvendes til at beregne pH-værdier for eksperimentet. Vakuolær pH-ændringer som følge af glucose tilsætning til glucose-berøvede celler er vist i figur 1B. Vakuolær pH stiger under BCECF-AM mærkning fordi cellerne er glukose berøvet, men falder efter glukose readdition, formentlig som et resultat af V-ATPase aktivering via genmontering 3,4. En svag stigning i vacuolær pH observeret ved tilsætning af 50 mM KCI tre minutter efter glukose tilsætning. I en større undersøgelse, vi typisk kørt mindst tre uafhængige forsøg (biologiske gentagelser) og vise den gennemsnitlige pH ± SE for hver betingelse 3-5.
Kinetikken af cytosolisk pH-ændring med glucose tilsætning er vist i figur 2.. Til dette eksperiment blev vildtype gærceller dyrkes i syntetisk komplet medium uden uracil (SC-uracil), pufret til pH 5 med 50 mM MES. Dette medium er egnet til opretholdelse af plasmidet indeholdende gær phluorin under kontrol af den phosphoglyceratkinase (PGK)-promotoren,som vi har brugt for nylig 3,5, andre plasmider kan kræve forskellige udvalgte forhold. Kalibreringskurven (figur 2A) viser, at ratiometrisk respons pHluorin til pH er lineær over et bredt pH, generelt omfatter enhver fysiologisk relevant cytosolisk pH. Svaret fra de vildtypeceller vist her er meget karakteristisk, og der er en umiddelbar reduktion i pH efterfulgt af en stigning til pH 7,2-7,4.
Vi konstruerer kalibreringskurver for hver stamme og hvert forsøg. Vi anvender en in situ kalibrering beskrevne blanding af Brett et al. 9 for både BCECF og pHluorin målinger. Denne blanding omfatter celle-gennemtrængende ammoniumacetat kan kollapse pH-gradienter på tværs af flere membraner, at natriumazid og deoxyglucose standse ATP-produktion og hæmmer H +-pumper, og monensin og nigericin, ionoforer impliceret i kollaps af pH-gradienter i gær sekretoriske / vacuolar transportveje 12 og mitokondrie indre membran 13, hhv. Det er værd at bemærke, at vi ikke trækker en baggrund værdi for umærkede celler til vakuolære eller cytosol pH-målinger. Selvom cellerne har nogle iboende autofluorescens, vi har direkte sammenlignes pH-målinger med og uden baggrunden korrektion på kalibrering og eksperimentelle prøver og har set nogen forskel i de endelige værdier. Baggrund subtraktion vil resultere i stejlere kalibreringskurver, og kan være ønskeligt under betingelser, hvor fluorescenssignaler er lave og signal-støjforhold bliver et problem. For eksempel, ved måling af en Golgi / endosom lokaliseret pHluorin 5, hvilket giver en lavere samlet signal vi subtrahere baggrunden signal fra alle målinger.
Figur 1. Måleement af vakuolære pH reaktioner i vildtypeceller dyrket i YEPD, pH 5.. Vildtype (SF838-5Aα) celler blev dyrket til midt-log-fase og derefter inkuberet med BCECF-AM som beskrevet ovenfor. A. Kalibreringskurve viser målt Forholdet mellem fluorescensintensiteten fra excitation ved 490 nm (I490) til intensitet fra excitation ved 450 nm (I450) (begge målt ved en emissionsbølgelængde på 535 nm) ved varieret pH. En lineær tendenslinje er vist. B. vacuolær pH efter en kort glucosemangel blev målt i en del af den samme, mærket cellesuspension (ingen glucose). Glucose blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 50 mM og fluorescens-forholdet blev målt efter 5 minutter (5 '+ glucose). 50 mM KCI blev derefter tilsat, og fluorescens-forholdet blev målt efter 3 min og omdannes til pH (3 '+ KCI).
Figur 2. Kinetik af cytosolic pH reaktion på glucose tilsætning i vildtypeceller. Vildtype-celler blev transformeret med gær pHluorin under kontrol af den phosphoglyceratkinase (PGK)-promotoren, og transformanter dyrkes som beskrevet ovenfor. A. Kalibreringskurve viser målte forhold af fluorescensintensiteten ved 405 nm (I405) til intensitet ved 485 nm (I485) vs pH. B. cytosolisk pH blev afledt fra fluorescensintensitets målinger hver 6 sek. over 6 min. Glucose (50 mM endelig) blev tilsat til cellerne i kuvetten på det angivne tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udnyttet disse protokoller for at løse en række aspekter af pH homeostase. For eksempel har vi sammenlignet cytosol og pH reaktioner vildtype og V-ATPase-mutant celler 4,5. Vi har også undersøgt virkningerne af ændrede vækstbetingelser, især ekstracellulære pH, om vakuolær pH respons på glukose 3.. Vigtigere er det, de svar vi observerer er både i overensstemmelse med andre metoder til kvantitativ måling af pH og biokemiske data, der beskriver ændrede aktiviteter protonpumperne.
De to vigtigste funktioner af den type af in vivo pH målinger beskrevet her, er lokalisering af fluoroforen og niveauet af signalet, problemer med enten disse kræver modifikation af fremgangsmåden for den specifikke anvendelse eller mutanten. Den vacuolær lokalisering af BCECF er noget tilfældig 6, men er bevaret i en række forskellige mutanter, herunderVMA mutanter 4, som har reducerede niveauer af vakuolære hydrolaser. Gær vakuoler er let visualiseres ved mikroskopi under Nomarski optik, og vi bekræfter vacuolær lokalisering af farvestoffet for hver stamme. pHluorin er mere alsidig som en pH-sensor, især i betragtning af dets evne over det meste af det fysiologiske pH-område (figur 2A). Gæren pHluorin som vi har brugt synes at være udelukkende cytosol, formentlig fordi den mangler andre målretningsoplysninger. Imidlertid har pHluorin været målrettet til Golgi apparatet ved tagging med sekvenser fra Golgi chlorid transportøren Gef1, sammen med en yderligere indsættelse af membran-segmenter fra halorhodopsin at give ordentlig topologi (pH-Gef1, 14). Orij et al. Har med succes målrettet pHluorin til det mitokondrielle matrix og målte mitokondrie pH-ændringer med stofskiftet 15. Disse resultater tyder på, at korrekt udformet fusionsproteiner kan gøre det possible til at overvåge pH reaktioner i mange organeller. Signalet til støjniveau vacuolær BCECF er ganske høj i de fleste af de gærstammer, som vi har undersøgt. Signal fra udtrykte pHluorin proteiner kan manipuleres via promotor driver pHluorin udtryk. I den oprindelige cytosoliske pHluorin konstruktion 9, blev ekspression drevet af en varmechok element-holdig promotor og var ikke meget høj. Men senere ekspressionskonstrukter fra PGK promotor, TEF1 promotoren og actinpromotor synes at give højere niveauer af udtryk 3,15,16. Golgi-specifikke pHluorin pH-Gef1 udtrykkes fra en inducerbar promotor 14.. Forbigående induktion af udtryk kan være særligt nyttigt for mindre rum af sekretoriske og endocytic veje, hvor vedvarende højniveauekspression kunne føre til pHluorin mislocalization eller endda forstyrrelser i rum pH, manifestere gennem langsom vækst eller mislocalization af andre proteiner.
<p class = "jove_content"> Ud over egenskaberne ved de fluoroforer, er det vigtigt at erkende, at in vivo pH-målinger er følsomme for vækst og metaboliske tilstande af gærcellerne selv. Denne følsomhed er fysiologisk relevant og potentielt interessant, men kan også være en kilde til variabilitet mellem målingerne. Vi sørger for at sammenligne målinger fra gærceller i samme vækstfase, som regel begyndelsen til midten logaritmisk fase. Fordi vakuolære pH reaktioner kan være følsomme over for ekstracellulær pH 3, vi overvåger pH af vækstmediet, især for celler dyrket i bufferet medium. Mens det er klart, at mange forskellige vækstmedier er forenelige med ratiometrisk pH-måling, kan forskellene i medium sammensætning definitivt påvirke pH 17. Desuden, efter cellerne er høstet og forberedt til måling har vi fundet, at langvarig glucosemangel (timer) ikke blot reducerer den oprindelige cytosolic pH og øger den indledende vacuolær pH, men også signifikant langsommere reaktioner på glucose. Derfor vi generelt indlede eksperimenter inden for 30 min. eller mindre begynder glucosemangel.Akkumulering af fluorescerende lysosomotropic aminer, såsom quinacrin og acridinorange, er blevet anvendt i udstrakt grad til at vurdere rum forsuring i levende gærceller. Disse metoder er hurtig og enkel, men bør betragtes som meget mere kvalitativ end ratiometrisk målinger af pH. I almindelighed afhængige metoder såsom quinacrine optagelse på membranpermeabilitet af den basiske form af fluoroforen, som bliver fanget, når det er protoneret i et surt rum og kan visualiseres under et fluorescensmikroskop 18. Akkumulering af farvestoffet afhængig partitionering ifølge pH-gradient over membranen, så optagelse i sure organeller kan blive svækket ved enten alkalisk organellet eller forsuringpå af cytosolen. Disse metoder vil forblive nyttige, men bør nok tolkes som at give en relativ grad af forsuring.
De anvendelser af ratiometrisk fluorescerende pH-målinger i gær fortsætter med at ekspandere. Brett et al. Nylig målt vakuolær pH i samling af over 4500 ikke-væsentlige gær deletionsmutanterne og afdækkede en række nye mekanismer pH-regulering 17.. BCECF og pHluorin 19,20 er også blevet tilpasset til en fluorescens-aktiveret celle sortering format for at lette screening for nye V-ATPase-inhibitorer. Dechant et al. 11 brugte microfluidics i kombination med fluorescens mikroskopi til at overvåge V-ATPase samling og cytosol pH samtidigt gennem flere cyklusser af glukose afsavn og readdition. Disse resultater antyder, ratiometrisk målinger af pH i gær er tilstrækkeligt robuste og alsidige skal anvendes i mange typer af eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter til at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM50322 til PM Kane. Forfatterne takker Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University til at give gær pHluorin plasmider og rådgivning om ratiometrisk pH-målinger, og Dr. Gloria A. Martinez Munoz for at arbejde ud af disse protokoller for vores lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
