Summary
Vacuolaire en cytosolische pH kan worden gemeten in levende gist (
Abstract
Vacuolaire en cytosolische pH zijn sterk gereguleerd in gistcellen en nemen een centrale rol in de totale pH homeostase. We beschrijven ratiometric protocollen voor het meten van pH in vivo middels pH-gevoelige fluoroforen gelokaliseerd in de vacuole of cytosol. Vacuolaire pH wordt gemeten met BCECF die lokaliseert de vacuole in gist als in cellen geïntroduceerd in de acetoxymethylester vorm. Cytosolische pH wordt gemeten met een pH-gevoelige GFP expressie onder controle van een gist promoter, gist pHluorin. Werkwijzen voor het meten van fluorescentie ratio in gist celsuspensies in een fluorimeter worden beschreven. Door middel van deze protocollen, hebben enkel tijdstip van de pH onder verschillende omstandigheden of in verschillende gist mutanten werden vergeleken en veranderingen in de pH in de tijd zijn gemonitord. Deze werkwijzen zijn ook aangepast om een fluorescentie plaatlezer format voor high-throughput experimenten. Voordelen van ratiometrisch pH-metingen ten opzichte van andere apbenaderingen die momenteel in gebruik, mogelijke experimentele problemen en oplossingen, en de vooruitzichten voor het toekomstige gebruik van deze technieken worden ook beschreven.
Introduction
pH homeostase is een dynamisch en sterk gereguleerd proces in alle organismen 1,2. Biochemische processen zijn strak gereguleerd door de pH, en intracellulaire omgevingen zijn afgestemd op smalle pH varieert om een optimale werking van de bewoner enzymen toestaan. Echter, kan intracellulaire pH homeostase worden aangevochten door snelle veranderingen in het milieu pH, metabole verschuivingen, en bepaalde signaalwegen. Bovendien intracellulaire pH kan zichzelf dienen als een belangrijk signaal. Tenslotte vele organellen handhaven luminale pH waarden verschillen van het omringende cytosol en essentieel voor organel-specifieke functies.
De gist Saccharomyces cerevisiae deelt een aantal pH homeostase mechanismen met hogere eukaryoten 2. In de zure organellen van de endocytische / lysosomale route, wordt de pH in de eerste plaats bepaald door de sterk geconserveerde vacuole proton-translocerende ATPase (v-ATPase), handelend in combinatie met vele exchangers afhankelijk van de pH gradiënt. Alle eukaryote cellen hebben ook proton export mechanismen. In schimmels en planten, een tweede, afzonderlijke protonpompremmers bij de plasmamembraan, Pma1, export metabole protonen en wordt beschouwd als de belangrijkste determinant van cytosolische pH en plasmamembraan potentie. De genetische flexibiliteit van S. cerevisiae en haar commerciële belang, hebben het tot een zeer interessant en belangrijk model voor het bestuderen van pH homeostase 2 gemaakt.
Naast de primaire bestuurders van organellen verzuring zijn V-ATPases sterk gereguleerde enzymen en ons lab is geïnteresseerd in het begrip van mechanismen van V-ATPase regulering. Naar dit doel, hebben we met behulp van in vivo pH-metingen van de vacuole en cytosolische pH: 1) om reacties op veranderende extracellulaire omstandigheden, zoals glucose deprivatie en readdition, 2) monitoren van de effecten van mutaties die compromissen V-ATPase activiteit te onderzoeken, en 3) aan de coör verkennencoördinatie van organel en plasmamembraan protonpompen 3-5. Deze experimenten werd pas mogelijk door de ontwikkeling van robuuste ratiometrisch pH indicatoren vatbaar voor gebruik in gistcellen. . Plant et al. toonde aan dat eerste BCECF (2'7'-bis-(2-carboxyethyl) -5 - (en 6)-carboxyfluoresceïne), die veelvuldig gebruikt cytosolische pH in zoogdiercellen meten, accumuleert in de gist vacuole in plaats van het cytosol 6. Dit verschil in lokalisatie BCECF wordt toegeschreven aan de vele hydrolytische enzymen in de vacuole, die waarschijnlijk verantwoordelijk voor splitsing van de acetoxy methylester van BCECF-AM (acetoxymethylester van BCECF) en vacuolaire retentie 6. Ali et al.. 7 verder ontwikkeld pH van de vacuole meting met BCECF en aangepast deze metingen naar een fluorescentieplaatlezer formaat. Brett et al.. PHluorin gist geïntroduceerd als een middel voor het meten cytosolische pH in gist door een expressie plasmide gedragen ratiometric pH-gevoelige GFP 8 onder controle van een gist-specifieke promoter 9.
De excitatie spectra van zowel BCECF en gist pHluorin zijn gevoelig voor pH, zodat ze worden gebruikt als ratiometric pH indicatoren waarin de verhouding van fluorescentie bij twee golflengten, gemeten bij een emissiegolflengte, verschaft een maat van pH 8,10. Deze gist vacuole en cytosolische pH-sensoren zijn gebruikt voor zowel single-cell en de bevolking op basis van metingen. Single-cell metingen 6,11 worden uitgevoerd door fluorescentie microscopie en beeldanalyse. Vacuolaire of cytosolische fluorescentie bij de twee golflengten wordt gemeten voor elke cel. De bevolking op basis van metingen worden uitgevoerd in een van beide een microplaataflezer met geschikte fluorescentie-mogelijkheden of in een fluorimeter. We hebben over het algemeen gedaan onze metingen in een fluorimeter, want het biedt gemakkelijke toegang voor toevoeging van componenten, zoals glucose tijdens concontinue kinetische metingen. Onze huidige lab protocollen voor het meten van de vacuole en cytosolische pH zijn hieronder vermeld, beide zijn ook gemakkelijk aangepast aan microplate assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Meting van vacuolaire pH in vivo gebruik BCECF-AM
- Kweek een 50 ml vloeibare kweek van de giststam te meten in het gewenste medium overnight. Het doel is om cellen te hebben in mid-log fase (OD600 (optische dichtheid bij 600 nm) gemeten van ongeveer 0,8 voor de ophanging).
- Pellet de gistcellen door centrifugeren. Resuspendeer de pellet in 0,6 ml groeimedium en transfer naar een microcentrifugebuis die eerder gewogen. Pellet de cellen opnieuw in een microcentrifuge bij 2000 xg gedurende 60 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof zo volledig mogelijk en weeg de cel pellet. Resuspendeer de pellet tot een uiteindelijke dichtheid van 0,5 g / ml (g / v), een cultuur van dit volume een celpellet van ongeveer 200 mg en 200 gl buffer geven worden toegevoegd tot een eindvolume van 400 gl te geven.
- Voeg BCECF-AM aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 50 mM van een 12 mM voorraad in DMSO bereid. Meng goed en dan incUbate de cellen bij 30 ° C gedurende 30 minuten. op een schommelende platform of roller trommel.
- Terwijl de cellen incuberen, bereiden kalibratie buffers. De kalibratie buffer bevat 50 mM MES (2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur), 50 mM HEPES (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M ammoniumacetaat, 10 mM natriumazide, en 10 mM 2-deoxyglucose en wordt aangepast aan de pH waarden die voor uw ijkreeks met NaOH of HCl. (Voorzichtig: Natriumazide is zeer giftig en worden behandeld.) Voor het meten van pH in wild-type cellen, zouden we verscheidene ijkgasmengselcomponent bereid bij pH 5,5 tot 6,5, maar mutanten wordt naar een meer basisch vacuolaire pH hebben ( vma mutanten), zouden wij extra, hogere pH buffers te bereiden.
- Aliquot 2 ml kalibratiebuffer voor elke pH in 15 ml conische buizen en voeg monensin (15 mM voorraad) en nigericine (2 mM voorraad) tot de uiteindelijke concentratie van 110 uM monensine en 15 uM nigericine, r gevenespectively. Goed mengen op een vortex-mixer. (Let op: Zowel monensine en nigericine zijn giftig en moet met zorg worden behandeld.)
- Wanneer de BCECF-AM incubatietijd is voltooid, pellet de celsuspensie door centrifugeren gedurende 30 seconden bij 2000 x g in een microcentrifuge. Resuspendeer de cellen 1 ml groei medium zonder glucose en gecentrifugeerd zoals hierboven. Herhaal deze wasstap eenmaal, en resuspendeer de pellet in 200 pl groeimedium zonder glucose. Plaats op het ijs.
- Voeg 20 ul van de celsuspensie elke pH kalibratiebuis hierboven bereide. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30-60 minuten. een roller trommel.
- Stel de fluorimeter afwisselend meten bij excitatie golflengten 450 nm en 490 nM, beide met een emissiegolflengte van 535 nm. Stel de monsterkamer temperatuur tot 30 ° C. Voer alle metingen onder continu roeren van het mengsel in de cuvette.
- Voeg 1,96 ml van 1 mM MES (pH 5 of 7 afhankelijk van de pH van het groeimedium cellen eennd de proefopzet). Voeg 20 ul van celsuspensie in de cuvette. Initiëren fluorescentie metingen. We verzamelen zowel continue kinetische en tijd-point data in verschillende experimenten. Voor continue kinetische data, nemen we metingen elke 6 seconden gedurende 5 min, voeg dan glucose tot een uiteindelijke glucoseconcentratie van 50 mM en verder meting gedurende 5-10 minuten. Voor enkele keer-point metingen, wij over het algemeen verrichten van metingen bij 1 en 5 minuten. na toevoeging van cellen aan de cuvet, voeg glucose in de kinetische metingen en meet nogmaals 5 minuten. na glucose toevoeging. Deze toevoegingen kunnen worden gevarieerd en aanvullende onderdelen (remmers, enz.) kunnen ook worden toegevoegd.
- Na de experimentele metingen zijn voltooid, verwijdert u de kalibratie buizen uit de 30 ° C incubatie en breng de hele 2 ml volume voor elk van de fluorometercuvette. Meet fluorescentie bij dezelfde instellingen (zie 1.8) om de 5 sec over een totaal van 30 sec voor elk monster.
- Fluorescentie gegevens te exporteren naar Microsoft Excel. (Voor onze fluorimeter, dit vereist exporteren van gegevens als tekst in tab-gescheiden vorm en de invoer in Excel.) Verkrijgen van een ijkgrafiek door het berekenen van de verhouding van de fluorescentie bij 490 nm tot 450 nm voor elke kalibratie mengsel. De fluorescentie-ratio wordt vervolgens uitgezet tegen de pH op een kalibratiecurve te krijgen.
- De experimentele data te converteren naar fluorescentieverhouding en bereken pH met behulp van de standaard curve. Vacuolaire pH kan vervolgens uitgezet tegen de tijd (kinetiek van pH veranderingen) of vergeleken onder verschillende omstandigheden (figuur 1) of in verschillende mutante stammen.
2. Meting van cytosolische pH in vivo gebruiken gist pHluorin
- Transformeren de gewenste giststam met de gist pHluorin plasmide door standaard protocollen, en kies voor de transformanten op aangevuld minimaal medium dat uracil (SC-uracil).
- Groeien een 50 ml vloeibare kweek van getransformeerde cellen in SC-uracil tot mid-log-fase (OD
- Bereid kalibratiestandaarden zoals beschreven voor vacuolaire pH, maar buffer een pH geschikt voor cytosolische pH metingen algemeen pH 6-8. Aliquot 2 ml kalibratiebuffer op de gewenste pH in verschillende 15 ml conische buizen. Voeg monensine en nigericine zoals hierboven (1.4) beschreven en meng.
- Oogst de cellen door centrifugeren zoals boven beschreven, en resuspendeer de pellet in 600 ui van het groeimedium. Transfer naar een gewogen microcentrifugebuis, en pellet cellen door centrifugeren bij 5000 rpm gedurende 30 sec. Resuspendeer de pellet in 1 ml groeimedium zonder glucose (SC-uracil-glucose), pellet cellen en herhaal. Na de laatste centrifugeren, de bovenstaande vloeistof zo goed mogelijk en weeg de cel pellet. Resuspendeer cellen tot een uiteindelijke dichtheid van 0,5 g / ml in SC-uracil zonder glucose.
- Voeg 20 ul celsuspensie aan elke buis van kalibratiebuffer en meng goed op een vortex mixer. Incubeer bij 30 ° C op een draaiende trommel rotor gedurende 60 minuten.
- Stel de fluorimeter voor excitatie bij golflengten 405 en 485 nm en een emissie golflengte van 508 nm. Ga door keer punt of kinetische en toevoeging van glucose als hierboven beschreven voor BCECF meting.
- Meten fluorescentie van ijkmonsters, en de bouw van een kalibratiecurve als voor BCECF (zie 1,10-1,11). Een grafiek van de fluorescentie verhouding versus pH is lineair over het bereik van meest cytosolische pH metingen (pH 6.0-8.0) 9, zodanig experimentele fluorescentieverhouding metingen gemakkelijk omgezet tot pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft pH van de vacuole gegevens verkregen over wild-type gistcellen gekweekt in rijk medium (gistextract-pepton-dextran; YEPD) gebufferd op pH 5 met 50 mM MES. We bieden meestal de cellen in gebufferd medium omdat de pH van het medium kan vrij dramatisch veranderen tijdens groei gedurende de nacht, in het bijzonder voor minimaal medium, en we hebben gevonden dat de pH van het groeimedium kunnen beïnvloeden vacuolaire pH reacties 3. Maar het is ook voor veel experimenten de cellen groeien in gebufferd medium. Figuur 1A toont een kalibratiecurve cellen geïncubeerd met BCECF-AM door het bovenstaande protocol. Hoewel de relatie tussen BCECF fluorescentieverhouding en vacuolaire pH niet lineair over een breder pH-gebied 7, is het bijna lineair in het relevante gedeelte van deze experimentele metingen, en een lineaire trendlijn wordt getoond en gebruikt om pH-waarden te berekenen voor het experiment. Vacuolaire pH als gevolg van veranderingen glucose Naast glucose-arme cellen worden getoond in Figuur 1B. PH van de vacuole stijgt tijdens BCECF-AM labelen omdat cellen zijn glucose beroofd, maar daalt na glucose readdition, vermoedelijk als gevolg van V-ATPase activering via hermontage 3,4. Een lichte stijging vacuolaire pH waargenomen bij toevoeging van 50 mM KCl, drie minuten na de glucose toevoeging. In een grotere studie, hebben we meestal minstens drie onafhankelijke experimenten (biologische repliceert) draaien en geven de gemiddelde pH ± SE voor elke aandoening 3-5.
De kinetiek van cytosolische pH-verandering met glucose toevoeging worden getoond in Figuur 2. Voor dit experiment, werden wild-type gist cellen gekweekt in synthetisch volledig medium zonder uracil (SC-uracil), gebufferd tot pH 5 met 50 mM MES. Dit medium is geschikt voor handhaving van het plasmide bevattende gist pHluorin onder besturing van het fosfoglyceraatkinase (PGK) promoter,waar we onlangs 3,5 hebben gebruikt; andere plasmiden kunnen verschillende select omstandigheden vereisen. De kalibratiecurve (Fig. 2A) blijkt dat de ratiometrische respons van de pHluorin tot pH is lineair over een breed pH; algemene wijze alle fysiologisch relevante cytosolische pH. De reactie van het wild-type cellen is hier zeer karakteristiek er onmiddellijk afname pH gevolgd door een verhoging tot pH 7.2-7.4.
Wij bouwen kalibratiecurven voor elke stam en in elk experiment. Hiervoor wordt een in situ calibratie mengsel beschreven door Brett et al.. 9 zowel BCECF en pHluorin metingen. Dit mengsel bevat cel-permeant ammoniumacetaatbuffer staat instortende pH gradiënten over meerdere membranen, natriumazide en deoxyglucose om ATP productie te stoppen en remmen de H +-pompen, en monensine en nigericine, ionoforen betrokken bij instorting van de pH gradiënten in de gist secretoire / vacuolar transport trajecten 12 en mitochondriale binnenste membraan 13, respectievelijk. Het is vermeldenswaard dat we niet aftrekken een achtergrondwaarde voor ongelabelde cellen voor de vacuole of cytosolische pH-metingen. Hoewel de cellen hebben een aantal intrinsieke autofluorescentie, hebben we direct vergeleken pH metingen met en zonder achtergrondcorrectie de kalibratie en experimentele monsters en geen verschil in de eindwaarden gezien. Achtergrond aftrekken resulteert in steilere kalibratiecurves en gewenst onder omstandigheden waarbij fluorescentiesignalen en lage signaal ruisverhouding wordt een probleem kan zijn. Bijvoorbeeld, bij het meten van een Golgi / endosoom gelokaliseerde pHluorin 5, dat een lagere totale signaal geeft, we aftrekken van de achtergrond signaal van alle metingen.
Figuur 1. Measurement van vacuolaire pH reacties in wildtype cellen gekweekt in YEPD, pH 5. Wildtype (SF838-5Aα) cellen werden gekweekt tot mid-log fase en vervolgens geïncubeerd met BCECF-AM zoals hierboven beschreven. A. ijkcurve die gemeten verhouding van fluorescentie-intensiteit van excitatie bij 490 nm (I490) de intensiteit van excitatie bij 450 nm (I450) (beide gemeten bij een emissiegolflengte van 535 nm) bij verschillende pH. Een lineaire trendlijn wordt weergegeven. B. vacuolaire pH na een korte glucosedeprivatie werd gemeten in een gedeelte van dezelfde, gelabelde celsuspensie (zonder glucose). Glucose werd toegevoegd tot een eindconcentratie van 50 mM toegevoegd en fluorescentie verhouding werd gemeten na 5 min (5 '+ glucose). 50 mM KCl werd vervolgens toegevoegd en de fluorescentie verhouding werd gemeten na 3 min en omgezet pH (3 '+ KCl).
Figuur 2. Kinetiek van CYTosolic pH reactie op glucose toevoeging in wild-type cellen. Wildtype cellen werden getransformeerd met gist pHluorin onder besturing van het fosfoglyceraatkinase (PGK) promoter en de transformanten gekweekt zoals hierboven beschreven. A. ijkcurve die gemeten verhouding van fluorescentie-intensiteit bij 405 nm (I405) naar intensiteit bij 485 nm (I485) versus pH. B. cytosolische pH werd afgeleid van fluorescentie-intensiteit metingen elke 6 sec. meer dan 6 minuten. Glucose (50 mM eind) werd in de cuvet op de aangegeven tijd aan de cellen toegevoegd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben deze protocollen gebruikt om enkele aspecten van pH homeostase pakken. Zo hebben we cytosolische en pH reacties van wild-type en v-ATPase-deficiënte mutantcellen 4,5 vergeleken. We hebben ook de effecten van veranderde groeiomstandigheden bijzonder extracellulaire pH op vacuolaire pH reactie op glucose 3 onderzocht. Belangrijk is dat de reacties die we waarnemen zijn beide consistent met andere methoden van kwantitatief pH-meting en biochemische data beschrijven gewijzigde activiteiten van het proton pompen.
De twee belangrijkste kenmerken van de soort in vivo pH metingen hier beschreven lokalisatie van de fluorofoor en het signaalniveau, problemen met een van deze vereisen modificatie van de werkwijze van de specifieke toepassing of mutant. De vacuolaire lokalisatie van BCECF enigszins toevallige 6, maar wordt bewaard in een aantal verschillende mutanten, inclusief devma mutanten 4, waarvan het gehalte aan vacuole hydrolases hebben verminderd. Gist vacuolen zijn gemakkelijk gevisualiseerd door microscopie onder Nomarski optica, en wij bevestigen vacuolaire lokalisatie van de kleurstof voor elke stam. pHluorin is veelzijdiger als een pH-sensor, met name gezien de responsiviteit over het grootste deel van de fysiologische pH-gebied (Figuur 2A). De gist pHluorin die we hebben gebruikt lijkt uitsluitend cytosol, waarschijnlijk omdat het geen andere betreft gegevens. Echter pHluorin is gericht op het Golgi apparaat met labels met sequenties uit het Golgi chloride transporter Gef1, samen met een bijkomende insertie van membraan segmenten halorhodopsin de juiste topologie geven (pH-Gef1, 14). Orij et al.. Hebben met succes gericht pHluorin naar de mitochondriale matrix en gemeten mitochondriale pH veranderingen met metabolisme 15. Deze resultaten suggereren dat goed ontworpen fusie-eiwitten het possib kan makenle tot pH respons moet worden gecontroleerd op vele organellen. De signaal geluidsniveau in vacuolen BCECF is vrij hoog in de meeste van de giststammen die we hebben onderzocht. Signaal van expressie pHluorin eiwitten kunnen worden gemanipuleerd via de promoter pHluorin expressie. In de oorspronkelijke cytosolische pHluorin construct 9 werd expressie aangedreven door een hitteschok-element bevattende promoter en was niet erg hoog. Echter, later expressie constructen van de PGK promoter, TEF1 promoter en actine promoter blijken hogere expressie 3,15,16 geven. Het Golgi-specifieke pHluorin pH-Gef1 wordt tot expressie gebracht vanaf een induceerbare promoter 14. Transiënte inductie van expressie kan bijzonder nuttig zijn voor kleinere compartimenten van secretorische en endocytotische wegen, waar een aanhoudende expressie op hoog niveau kunnen leiden tot mislocalization of verstoringen in compartiment pH, manifesteren door langzame groei of mislocalization van andere eiwitten pHluorin.
<p class = "jove_content"> Naast de kenmerken van de fluoroforen, is het belangrijk te erkennen dat in vivo pH metingen gevoelig voor de groei en metabole condities van de gistcellen zelf. Deze gevoeligheid is fysiologisch relevant en potentieel interessant, maar kan ook een bron van variabiliteit tussen metingen. Wij verzorgen om metingen uit gistcellen vergelijken in dezelfde groeifase, meestal begin tot midden logaritmische fase. Omdat vacuolaire pH reacties gevoelig extracellulaire pH 3 kan controleren we pH van het groeimedium, in het bijzonder voor cellen gekweekt in gebufferd medium. Hoewel het duidelijk is dat veel verschillende groeimedia zijn compatibel met ratiometrische pH meting kan verschillen in samenstelling van het medium zeker invloed pH 17. Bovendien, na cellen geoogst en voorbereid voor meting, hebben wij gevonden dat langdurige glucosedeprivatie (uur) vermindert niet alleen de eerste cytosolic pH en verhoogt de initiële pH van de vacuole, maar ook aanzienlijk vertraagt reacties op glucose. Daarom hebben we meestal experimenten binnen 30 minuten te starten. of minder vanaf de glucosedeprivatie.Accumulatie van fluorescente lysosomotrope aminen, zoals quinacrine en acridine oranje, is uitgebreid gebruikt in vakje aanzuring beoordelen levende gistcellen. Deze werkwijzen zijn snel en eenvoudig, maar moet zoveel meer kwalitatieve dan ratiometric van de pH worden beschouwd. In het algemeen werkwijzen zoals quinacrine opname afhankelijk membraan permeabiliteit van de basisvorm van de fluorofoor, die worden ingesloten wanneer het geprotoneerd in zuur compartiment en kan onder een fluorescentie microscoop 18 worden gevisualiseerd. Accumulatie van de kleurstof zich op afscherming volgens de pH-gradiënt over het membraan, zodat opname in zure organellen kan worden verzwakt door een basisch de organel of acidificatiop de cytosol. Deze methoden zullen blijven nuttig, maar moet waarschijnlijk worden opgevat als het verstrekken van een relatieve mate van verzuring.
De toepassingen van ratiometrisch fluorescente pH metingen in gist blijven uitbreiden. Brett et al.. Recent gemeten pH van de vacuole in de collectie van meer dan 4500 niet-essentiële gist deletiemutanten en ontdekt een aantal nieuwe mechanismen van de pH-regulering 17. BCECF en pHluorin 19,20 zijn ook aangepast om een fluorescentie-geactiveerde celsortering formaat te screenen op nieuwe V-ATPase remmers vergemakkelijken. Dechant et al.. 11 gebruikt microfluidics in combinatie met fluorescentie microscopie gelijktijdig te volgen V-ATPase assemblage en cytosolische pH via meerdere cycli van glucose ontbering en readdition. Deze resultaten suggereren dat ratiometric van de pH in gist voldoende robuust en veelzijdig in vele soorten experimenten worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM50322 naar PM Kane. De auteurs danken dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University voor het verstrekken van de gist pHluorin plasmiden en voor advies over ratiometrische pH-metingen, en dr. Gloria A. Martinez Munoz voor het uitwerken van deze protocollen voor ons lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
