Summary
Vacuolar und cytosolischen pH-Wert kann in lebende Hefe gemessen werden (
Abstract
Vacuolar und cytosolischen pH sind hoch in Hefezellen reguliert und nehmen eine zentrale Rolle in der Gesamtstrategie pH-Homöostase. Wir beschreiben Protokolle für ratiometrischen Messung von pH in vivo mit pH-sensitiven Fluorophoren lokalisiert zur Vakuole oder Cytosol. Vacuolar pH wird unter Verwendung BCECF, die in der Vakuole lokalisiert, wenn sie in Hefe-Zellen in ihrer Acetoxymethylester Form eingeführt. Cytosolischen pH-Wert mit einem pH-sensitive GFP unter Kontrolle eines Hefe-Promotors, Hefe pHluorin ausgedrückt gemessen. Verfahren zur Messung der Fluoreszenz-Verhältnisse in Hefe Zellsuspensionen in einem Fluorimeter beschrieben. Durch diese Protokolle haben einzigen Zeitpunkt Messungen des pH unter verschiedenen Bedingungen oder in verschiedenen Hefe-Mutanten verglichen und Veränderungen im pH im Laufe der Zeit wurden überwacht. Diese Methoden haben auch zu einem Fluoreszenz-Reader-Format für High-Throughput-Experimente angepasst. Vorteile von ratiometrischen pH-Messungen im Vergleich zu anderen apAnsätze derzeit im Einsatz, mögliche experimentelle Probleme und Lösungen und Perspektiven für die zukünftige Verwendung dieser Techniken werden ebenfalls beschrieben.
Introduction
pH-Homöostase ist ein dynamisches und stark regulierten Prozess in allen Organismen 1,2. Biochemische Prozesse sind eng durch pH-reguliert und intrazellulären Umgebungen zu engen pH-Bereich abgestimmt, um eine optimale Wirkung der Enzyme Bewohner zu ermöglichen. Allerdings kann intrazelluläre pH-Homöostase durch schnelle Änderungen der Umweltbedingungen pH-, Stoffwechsel-Verschiebungen und bestimmte Signalwege angefochten werden. Darüber hinaus können intrazelluläre pH selbst als ein wichtiges Signal dienen. Schließlich führen viele Organellen luminalen pH-Werten, die sich von der umgebenden Cytosol und wichtig für organellspezifisch Funktionen sind.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae Aktien eine Reihe von pH-Homöostase Mechanismen mit höheren Eukaryoten 2. In den sauren Organellen der endozytischen / lysosomalen Weg wird vor allem durch den pH-Wert hoch konserviert vacuolar Protonen-Translokation ATPase (V-ATPase) gesteuert wird, in Abstimmung mit den vielen exchangers abhängig vom pH-Gradienten. Alle eukaryotischen Zellen haben auch Protonen-Export-Mechanismen. In Pilzen und Pflanzen, eine zweite, deutlich Protonenpumpenhemmer an der Plasmamembran, PMA1 Exporte metabolische Protonen und ist vermutlich die wichtigste Determinante der cytosolischen pH-und Plasma-Membran Potenzial. Die genetische Flexibilität S. cerevisiae und seine wirtschaftliche Bedeutung, haben es ein sehr interessantes und wichtiges Modell für die Untersuchung pH 2 Homöostase.
Abgesehen davon, dass die primären Treiber der Organellen Versauerung, sind V-ATPasen hoch Enzyme reguliert und wird in unserem Labor zu verstehen Mechanismen der V-ATPase Regulierung interessiert. Mit diesem Ziel haben wir in vivo Messungen von pH Vakuole und cytosolischen pH wurde mit: 1), um Antworten auf veränderte extrazelluläre Bedingungen, wie Glukose Deprivation und Neuansatz, 2) zu überwachen, um die Auswirkungen von Mutationen, dass ein Kompromiss V-ATPase-Aktivität zu untersuchen, und 3) zur Erkundung der Koorrung der Organellen und Plasmamembran Protonenpumpen 3-5. Diese Experimente wurden erst durch die Entwicklung von robusten ratiometrischen pH-Indikatoren zugänglich in Hefezellen nutzen möglich. . Pflanze et al zeigten erstmals, dass BCECF (2'7'-Bis-(2-Carboxyethyl) -5 - (und 6)-Carboxyfluorescein), das verwendet wurde, weitgehend auf cytosolischen pH in Säugetierzellen zu messen, in der Hefe Vakuole akkumuliert anstatt das Cytosol 6. Dieser Unterschied in der BCECF Lokalisierung hat der vielen hydrolytischen Enzymen in die Vakuole, die geeignet sind, die für die Spaltung der Acetoxy-Methylester aus BCECF-AM (Acetoxymethylester BCECF) und Vakuolen Retention 6 zurückgeführt. Ali et al. 7 weiterentwickelt vacuolar pH-Messung mit BCECF und angepasst diese Messungen mit einem Fluoreszenz-Reader Format. Brett et al. Eingeführt Hefe pHluorin als Mittel zur Messung der cytosolischen pH in Hefe durch Expression einer Plasmid-borne ratiometric pH-sensitive GFP 8 unter der Kontrolle eines Hefe-Promotors 9.
Die Anregungsspektren sowohl BCECF und Hefe pHluorin sind pH-empfindlich, so dass sie als ratiometrische pH-Indikatoren, wobei das Verhältnis der Fluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen, in einer einzigen Emissionswellenlänge gemessen, ein Maß von pH 8,10 verwendet. Diese Hefe Vakuole und cytosolischen pH-Sensoren sind sowohl für Single-Cell-und bevölkerungsbezogenen Messungen verwendet worden. Einzel-Zell-Messungen 6,11 werden durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse durchgeführt. Vacuolar oder cytosolische Fluoreszenz bei den beiden Wellenlängen für jede Zelle gemessen. Die Bevölkerung-basierten Messungen werden entweder in einem Mikroplatten-Reader mit entsprechenden Fluoreszenz-Funktionen oder in einem Fluorimeter durchgeführt. Wir haben unsere Messungen im Allgemeinen in einem Fluorimeter durchgeführt, weil sie einen einfachen Zugang für die Zugabe von Komponenten, wie Glucose während con bietetkontinuierlichen kinetischen Messungen. Unsere aktuellen Labor-Protokolle für die Messung der Vakuole und cytosolischen pH sind unten aufgeführt, beide sind auch leicht zu Mikrotiterplatten-Assays angepasst.
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Protocol
Ein. Messung von pH Vacuolar In Vivo Mit BCECF-AM
- Grow a 50 ml Flüssigkeit Kultur der Hefestamm in der gewünschten Medium gemessen über Nacht werden. Ziel ist es, Zellen in der mittleren logarithmischen Phase haben (OD600 (optische Dichte bei 600 nm) Messung von ca. 0,8 für die Suspension).
- Pellet die Hefezellen durch Zentrifugation. Das Pellet in 0,6 ml Wachstumsmedium und Transfer zu einem Mikrozentrifugenröhrchen, die gewogen hat vorher. Pellet die Zellen wieder in einer Mikrozentrifuge bei 2.000 xg für 60 sec. Entfernen Sie den Überstand so vollständig wie möglich und dann wiegen das Zellpellet. Das Pellet auf eine endgültige Dichte von 0,5 g / ml (w / v), einer Kultur dieses Bandes wird ein Zellpellet von etwa 200 mg und 200 ul Puffer geben würde hinzugefügt, um ein Endvolumen von 400 ul zu ergeben.
- In BCECF-AM zu der Zellsuspension in einer Endkonzentration von 50 mM aus einer 12 mM Stammlösung in DMSO hergestellt. Gut mischen und dann incUbate die Zellen bei 30 ° C für 30 min. auf einem Schaukelstuhl Plattform oder Bandage.
- Während die Zellen Inkubation, bereiten Kalibrierpuffern. Die Kalibrierung Puffer enthält 50 mM MES (2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure), 50 mM HEPES (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M Ammoniumacetat, 10 mM Natriumazid und 10 mM 2-deoxyglucose, und ist der pH-eingestellten Werte für Ihre Kalibrierbereich mit NaOH oder HCl. (Vorsicht: Natriumazid ist sehr giftig und sollte mit Sorgfalt behandelt werden.) Für die Messung des pH-Wertes in Wildtyp-Zellen, würden wir mehrere Mischungen Kalibrierung bei pH 5,5 bis 6,5 zubereiten, aber für Mutanten erwartet, dass eine mehr alkalische pH vacuolar haben ( vma-Mutanten), würden wir uns vorbereiten zusätzliche, höhere pH-Puffer.
- Aliquot 2 ml Puffer Kalibrierung für jede pH in 15 ml konische Röhrchen, und fügen Monensin (15 mM stock) und Nigericin (2 mM Lager), um Endkonzentrationen von 110 pM und 15 pM Monensin Nigericin, r gebenespectively. Mischen Sie gut auf einem Vortex-Mischer. (Achtung: Sowohl Monensin und Nigericin sind giftig und sollten mit Vorsicht behandelt werden.)
- Wenn die BCECF-AM Inkubationszeit abgeschlossen ist, Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation für 30 sec bei 2.000 xg in einer Mikrozentrifuge. Resuspendieren der Zellen 1 ml Wachstumsmedium Glucose mangelt und zentrifugiert wie oben. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, und dann das Pellet in 200 ul Wachstumsmedium ohne Glucose. Platz auf dem Eis.
- In 20 ul der Zellsuspension jedem pH Kalibrierungsröhre oben hergestellt. Inkubation bei 30 ° C für 30-60 min. auf einer Bandage.
- Stellen Sie die Fluorimeter abwechselnd bei Anregungswellenlängen 450 nm und 490 nm, jeweils mit einer Emissionswellenlänge von 535 nm zu messen. Stellen Sie den Probenraum Temperatur auf 30 ° C. Alle Messungen unter ständigem Rühren der Mischung in die Küvette.
- In 1,96 ml 1 mM MES (eingestellt auf pH 5 oder 7 in Abhängigkeit vom pH-Wert der Zellen Wachstumsmedium einernd das experimentelle Design). In 20 ul Zellsuspension in der Küvette. Initiieren Fluoreszenzmessungen. Wir sammeln sowohl kontinuierliche kinetische und Zeit-Punkt-Daten in verschiedenen Experimenten. Zur kontinuierlichen kinetischen Daten wir Messungen alle 6 Sekunden für 5 min, dann addieren Glucose zu einer endgültigen Konzentration von Glucose 50 mM und weiterhin Messung für 5-10 min. Für einzelne Zeit-Punkt-Messungen, nehmen wir grundsätzlich Messungen bei 1 und 5 min. nach Zugabe von Zellen in die Küvette, fügen Glucose als in den kinetischen Messungen, und dann eine weitere Messung 5 min. nach Glukose hinaus. Diese Zusätze können variiert werden, und zusätzliche Komponenten (Inhibitoren usw.) können ebenfalls zugegeben werden.
- Nachdem die experimentellen Messungen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Kalibrierung Rohre aus dem 30 ° C Inkubation und übertragen das gesamte Volumen von 2 ml für jede der Fluorimeters Küvette. Messen der Fluoreszenz bei den gleichen Einstellungen (siehe 1.8) alle 5 Sek. über insgesamt 30 sec für jede Probe.
- Exportieren Fluoreszenz Daten in Microsoft Excel. (Für unsere Fluorimeters erfordert dies den Export von Daten als Text in durch Tabulatoren getrennte Form und Import in Excel.) Gewinne eine Eichkurve, indem das Verhältnis der Fluoreszenz bei 490 nm bis 450 nm für jede Kalibrierung Mischung. Die Fluoreszenz-Verhältnis wird dann gegen pH aufgetragen, um eine Eichkurve zu erhalten.
- Konvertieren Sie die experimentellen Daten zur Fluoreszenz-Verhältnis und pH berechnen anhand der Standardkurve bestimmt. Vacuolar pH-Wert kann dann gegen die Zeit aufgetragen (Kinetik der pH-Änderungen) oder im Vergleich unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung 1) oder in verschiedenen Mutanten.
2. Die Messung der cytosolischen pH In Vivo Mit Hefe pHluorin
- Verwandeln Sie den gewünschten Hefestamm mit der Hefe pHluorin Plasmid durch Standardprotokolle, und wählen Sie für die Transformanten auf Minimalmedium ergänzt ohne Uracil (SC-Uracil).
- Grow a 50 ml Flüssigkeit Kultur der transformierten Zellen in SC-Uracil bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD
- Kalibrierstandards für vacuolar pH, sondern Puffer auf einen pH-Bereich geeignet cytosolischen pH-Messungen, in der Regel pH 6-8 beschrieben. Aliquot 2 ml Puffer Kalibrierung auf den gewünschten pH-Wert in mehrere 15 ml konischen Röhrchen eingestellt. In Monensin und Nigericin wie oben (1.4) beschrieben und gut mischen.
- Ernten der Zellen durch Zentrifugation wie oben beschrieben, und das Pellet in 600 ul des Wachstumsmediums. Transfer zu einem gewogen Mikrozentrifugenröhrchens und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 rpm für 30 sec. Resuspendieren des Pellets in 1 ml Wachstumsmedium ohne Glucose (SC-Uracil-glucose), Pellet-Zellen und wiederholen. Nach der letzten Zentrifugation den Überstand so gründlich wie möglich und wiegen das Zellpellet. Die Zellen auf eine endgültige Dichte von 0,5 g / ml in SC-Uracil ohne Glucose.
- In 20 ul Zellsuspension in jedes Röhrchen der Kalibrierung Puffer und gut mischen auf einem Vortex-Mischer. Inkubation bei 30 ° C auf einer sich drehenden Trommel Rotor für 60 min.
- Richten Sie die Fluorimeters zur Anregung bei Wellenlängen 405 und 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 508 nm auf. Fahren Sie mit dem einzigen Zeitpunkt oder kinetische Messungen und Zugabe von Glucose, wie oben für BCECF Messung beschrieben.
- Messen Fluoreszenz Kalibrierproben und kann eine Kalibrationskurve für BCECF (siehe 1,10-1,11). Eine Auftragung der Fluoreszenz gegen pH Verhältnis linear über den Bereich der am cytosolischen pH-Messungen (pH 6,0-8,0) 9 sind so experimentellen Fluoreszenzverhältnis einfache Messung pH umgewandelt.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt vacuolar pH Daten auf Wildtyp-Hefezellen in reiche Medium (Hefeextrakt-Pepton-Dextran; YEPD) erhalten, gepuffert auf pH 5 mit 50 mM MES. Oft werden die Zellen in einer gepufferten Medium, weil der pH-Wert des Mediums dramatisch ändern kann während dem Wachstum über Nacht, insbesondere für Minimalmedium, und wir haben festgestellt, dass der pH-Wert des Nährmediums kann sich vacuolar pH 3 Reaktionen. Es ist jedoch auch annehmbar, für viele Experimente, um die Zellen in ungepufferten Medium wachsen. 1A zeigt eine Eichkurve für Zellen mit BCECF-AM durch das Protokoll über inkubiert. Obwohl die Beziehung zwischen BCECF-Fluoreszenz-Verhältnis und Vakuolen pH nicht linear über einen breiteren pH-Bereich 7 ist es nahezu linear im relevanten Bereich für diese experimentellen Messungen und einem linearen Trendlinie dargestellt und verwendet werden, um pH-Werte für das Experiment zu berechnen. Vacuolar pH-Änderungen aus glucose neben Glucose-entbehrenden Zellen sind in 1B gezeigt. Vacuolar steigendem pH-Wert während BCECF-AM Kennzeichnung, da die Zellen Glukose entzogen, sondern nimmt nach Glukose Neuansatz, vermutlich als Folge der V-ATPase-Aktivierung durch Zusammenbau 3,4. Eine geringfügige Erhöhung vacuolar pH wird durch Zugabe von 50 mM KCl, drei Minuten nach der Glukose-Zugabe beobachtet. In einer größeren Studie, wir laufen in der Regel mindestens drei unabhängigen Experimenten (biologische Replikate) und zeigen die durchschnittliche pH ± SE für jeden Zustand 3-5.
Die Kinetik der cytosolischen pH-Änderung mit Glucose Zusätzlich sind in Abbildung 2 dargestellt. Für dieses Experiment wurden Wildtyp-Hefezellen in synthetischen Vollmedium ohne Uracil (SC-Uracil) gewachsen, gepuffert auf pH 5 mit 50 mM MES. Dieses Medium ist für die Wartung der Plasmid enthaltende Hefe phluorin unter Kontrolle des Phosphoglycerat-Kinase (PGK)-Promotor,denen wir vor kurzem 3,5 verwendet, andere Plasmide können verschiedene select Bedingungen erfordern. Die Eichkurve (Figur 2A), dass die ratiometrische Reaktion des pHluorin auf pH linear über einen breiten Bereich von pH-Wert, in der Regel zu verdecken physiologisch relevanten pH cytosolischen. Die Reaktion der Wildtyp-Zellen gezeigt hier ist sehr charakteristisch, es ist eine sofortige Abnahme der pH-Wert durch eine Erhöhung auf pH 7,2-7,4 gefolgt.
Wir konstruieren Kalibrierkurven für jeden Stamm und in jedem Experiment. Wir verwenden eine in situ Kalibrierung Mischung von Brett et al. 9 sowohl für BCECF und pHluorin Messungen. Diese Mischung enthält Zell-permeant Ammoniumacetat fähig einstürzenden pH-Gradienten über mehrere Membranen, um Natriumazid und deoxyglucose stoppen ATP-Produktion und hemmen die H +-Pumpen und Monensin und Nigericin, lonophore in Zusammenbruch des pH-Gradienten in der Hefe sekretorischen / vac verwickeltuolar Transportwege 12 und inneren Mitochondrien-Membran 13, beziehungsweise. Es ist erwähnenswert, dass wir nicht subtrahieren einen Hintergrund für unmarkierte Zellen für die Vakuole oder zytosolischen pH-Messungen. Obwohl die Zellen eine gewisse intrinsische Autofluoreszenz zu tun, haben wir direkt pH-Messungen mit und ohne Hintergrund Korrektur der Kalibrierung und der experimentellen Proben verglichen und haben gesehen, keinen Unterschied in der endgültigen Werte. Hintergrund Subtraktion wird in steiler Eichkurven führen und unter Umständen wünschenswert sein, unter Bedingungen, wo Fluoreszenz-Signale niedrig sind und das Signal-Rausch-Verhältnis zu einem Problem. Zum Beispiel bei der Messung von einem Golgi / endosome lokalisierte pHluorin 5, die ein insgesamt niedrigeres Signal gibt, haben wir subtrahieren die Hintergrund-Signal von allen Maßen.
Abbildung 1. Messement der Vakuole pH Antworten in Wildtyp-Zellen in YEPD, pH 5. Wildtyp (SF838-5Aα) Zellen gezüchtet wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet und dann inkubiert mit BCECF-Uhr wie oben beschrieben. A. Eichkurve gemessen Verhältnis der Intensität der Fluoreszenz Anregung bei 490 nm (I490), um die Intensität von Anregung bei 450 nm (I450) (beide bei einer Emissionswellenlänge von 535 nm gemessen) bei verschiedenen pH-Werten. Eine lineare Trendlinie gezeigt. B. Vacuolar pH nach einer kurzen Glukoseentzug in einem Teil desselben, gekennzeichnet Zellsuspension (keine Glucose) gemessen. Glucose wurde dann auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben und die Fluoreszenz-Verhältnis nach 5 min (5 '+ Glucose) gemessen. 50 mM KCl wurde dann zugegeben und die Fluoreszenz-Verhältnis wurde nach 3 min gemessen und auf pH-Wert (3 '+ KCl).
Abbildung 2. Kinetik cytosolic pH auf Glucose zusätzlich in Wildtyp-Zellen. Wildtyp-Zellen wurden mit Hefe pHluorin unter Kontrolle des Phosphoglycerat-Kinase (PGK)-Promotor und die Transformanten wie oben beschrieben gezüchtet umgewandelt. A. Eichkurve gemessene Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei 405 nm (I405), um die Intensität bei 485 nm (I485) vs pH. B. Cytosolic pH-Wert wurde von Fluoreszenzintensitätsmessungen genommen alle 6 sec abgeleitet. über 6 min. Glucose (50 mM final) wurden zu den Zellen in der Küvette bei der angegebenen Zeit zugesetzt.
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Discussion
Wir haben diese Protokolle verwendet, um eine Reihe von Aspekten der pH-Homöostase adressieren. Zum Beispiel haben wir cytosolischen pH und Antworten von Wildtyp-und V-ATPase-defizienten mutierten Zellen 4,5 verglichen. Wir haben auch die Auswirkungen von Veränderungen der Wachstumsbedingungen, insbesondere extrazellulären pH auf pH vacuolar Reaktion auf Glukose 3 untersucht. Wichtig ist, dass die Antworten, die wir beobachten, sowohl im Einklang mit anderen Methoden der quantitativen pH-Messung und mit biochemischen Daten beschreiben veränderten Aktivitäten der Protonen-Pumpen.
Die zwei wichtigsten Eigenschaften von der Art der in vivo-pH-Messungen hier beschriebenen Lokalisierung der Fluorophor und der Pegel des Signals, Probleme mit einem dieser eine Modifikation des Verfahrens für die jeweilige Anwendung oder Mutante. Die Vakuolen Lokalisation BCECF etwas zufälligen 6, jedoch in einer Reihe von verschiedenen Mutanten erhalten, einschließlich dervma-Mutanten 4, die Ebenen der Vakuole Hydrolasen reduziert haben. Hefe-Vakuolen sind leicht sichtbar durch Mikroskopie unter Nomarski Optik, und wir bestätigen vacuolar Lokalisation des Farbstoffes für jeden Stamm. pHluorin ist vielseitiger als ein pH-Sensor, insbesondere angesichts seiner Reaktionsfähigkeit über den größten Teil des physiologischen pH-Bereich (Abbildung 2A). Die Hefe pHluorin dass wir verwendet haben, zu sein scheint ausschließlich cytosolische, vermutlich, weil es andere Targeting-Informationen fehlt. Allerdings hat pHluorin zum Golgi-Apparat wurde durch Markieren gezielt mit Sequenzen aus dem Golgi Chloridtransporter GEF1, zusammen mit einer zusätzlichen Einsetzen Membran Segmente Halorhodopsin die richtige Topologie zu (pH-GEF1, 14). Orij et al. Erfolgreich pHluorin der mitochondrialen Matrix gezielt und gemessen mitochondrialen pH-Änderungen mit dem Stoffwechsel 15. Diese Ergebnisse legen nahe, dass richtig ausgelegt Fusionsproteine kann es possible auf pH Reaktionen in vielen Organellen überwachen. Das Signal-Rausch-Niveau der Vakuole BCECF ist ziemlich hoch in den meisten der Hefe-Stämme, die wir untersucht haben. Signal vom ausgedrückt pHluorin Proteine können über den Promotor, der Expression pHluorin manipuliert werden. In der ursprünglichen cytosolischen pHluorin Konstrukt 9 wurde die Expression durch einen Hitzeschock Element enthaltenden Promotor gesteuert und war nicht sehr hoch. Allerdings scheinen später Expressionskonstrukte aus dem PGK-Promotor, Promotor TEF1 und Actin-Promotor zu einer höheren Expression 3,15,16 geben. Der Golgi-spezifische pHluorin pH-GEF1 aus einem induzierbaren Promotor 14 ausgedrückt. Transient Induktion der Expression kann besonders hilfreich für kleinere Fächer der sekretorischen und endozytischen Wege, wo anhaltend hohe Expression führen zu Fehllokalisation oder sogar Störungen in Fach pH, manifestiert durch langsames Wachstum oder Fehllokalisation anderer Proteine pHluorin könnte.
<p class = "jove_content"> Zusätzlich zu den Eigenschaften der Fluorophore, ist es wichtig zu erkennen, dass in vivo-pH-Messungen sind empfindlich für das Wachstum und die metabolische Bedingungen der Hefezellen sich. Diese Empfindlichkeit ist physiologisch relevant und potentiell interessant, aber kann auch eine Quelle der Variabilität zwischen den Messungen sein. Wir kümmern uns um Messungen von Hefezellen in der gleichen Wachstumsphase vergleichen, in der Regel Anfang bis Mitte der logarithmischen Phase. Da vacuolar pH Reaktionen können empfindlich gegenüber extrazellulären pH 3 beobachten wir pH-Wert des Wachstumsmediums, insbesondere für Zellen in ungepufferten Medium gezüchtet. Es ist zwar klar, dass viele verschiedene Nährmedien mit ratiometrischen pH-Messung sind, können Unterschiede in der Zusammensetzung des Mediums auf jeden Fall beeinflussen pH 17. Darüber hinaus, nachdem die Zellen geerntet und bereit für die Messung haben wir festgestellt, dass ein längerer Glukoseentzug (Stunden) verringert nicht nur die anfängliche cytosolic pH-Wert und erhöht die anfängliche vacuolar pH-Wert, sondern auch deutlich verlangsamt Antworten auf Glucose. Deshalb haben wir in der Regel innerhalb von 30 Experimente initiieren min. oder weniger von Beginn der Glukose Deprivation.Die Akkumulation von fluoreszierenden lysosomotropen Amine wie quinacrine und Acridinorange, wurde ausführlich in Kammer Ansäuerung in lebenden Hefezellen Beurteilung verwendet. Diese Methoden sind schnell und einfach, sollte aber so viel mehr qualitative als ratiometrischen Messungen von pH angesehen werden. Im Allgemeinen setzen Methoden wie quinacrine Aufnahme auf Membranpermeabilität der Grundform des Fluorophors, die eingeschlossen, wenn es in einem sauren Raum protoniert wird und unter einem Fluoreszenzmikroskop 18 visualisiert werden zu werden. Akkumulation des Farbstoffes beruht auf Abtrennung nach der pH-Gradient durch die Membran, so dass die Aufnahme in den sauren Organellen kann entweder durch Alkalisierung des Organelle oder acidificati geschwächtauf der Cytosol. Diese Verfahren bleibt nützlich, aber ist vermutlich als eine relative Höhe der Ansäuerung interpretiert werden.
Die Anwendungen der ratiometrischen fluoreszierenden pH-Messungen in Hefe weiter expandieren. Brett et al. Zuletzt gemessene pH Vakuole in der Sammlung von mehr als 4500 nicht-essentielle Hefe Deletionsmutanten und deckte eine Reihe von neuen Mechanismen der pH-Regulation 17. BCECF und pHluorin 19,20 haben auch zu einer Fluoreszenz-activated cell sorting Format Screening für neue V-ATPase-Inhibitoren erleichtern angepasst. Dechant et al. Verwendet Mikrofluidik 11 in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie zur V-ATPase Montage und cytosolischen pH gleichzeitig überwachen durch mehrere Zyklen von Glukose Deprivation und Neuansatz. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ratiometrische Messungen des pH-Wertes in Hefe ausreichend robust und vielseitig in vielen Arten von Experimenten angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NIH R01 GM50322, um PM Kane unterstützt. Die Autoren danken Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University für die Bereitstellung der Hefe-pHluorin Plasmiden und für Erfahrungsberichte zu ratiometrische pH-Messungen, und Dr. Gloria A. Martinez Munoz für das Arbeiten out diese Protokolle für unsere lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
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