Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידה של pH vacuolar וCytosolic Published: April 19, 2013 doi: 10.3791/50261
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, SUNY Upstate Medical University

Summary

pH vacuolar וcytosolic ניתן למדוד בשמרי חיים (

Abstract

Vacuolar וcytosolic pH הם מאוד מוסדר בתאי שמרים ותופס תפקיד מרכזי באיזון חומציות בכללותה. אנו מתארים פרוטוקולים למדידת ratiometric של pH in vivo באמצעות pH רגיש fluorophores המקומי לvacuole או cytosol. pH vacuolar נמדד באמצעות BCECF, שlocalizes לvacuole בשמרים כאשר הוכנסו לתאים בצורת אסתר acetoxymethyl שלה. pH cytosolic נמדד עם GFP pH רגיש הביע תחת שליטה של ​​אמרגן שמרים, שמרי pHluorin. שיטות למדידת יחס הקרינה בהשעיות תא שמרים בfluorimeter מתוארות. באמצעות פרוטוקולים אלה, מדידות נקודת זמן יחידה של ה-pH בתנאים שונים או בשמרי מוטנטים שונים כבר השוואה ושינויים ב-pH לאורך הזמן היו במעקב. שיטות אלה גם הותאמו לפורמט קורא צלחת הקרינה לניסויי תפוקה גבוהה. יתרונות של מדידות pH ratiometric מעל AP האחרproaches כיום בשימוש, בעיות פוטנציאליות ניסיוניות ופתרונות, וסיכויים לשימוש עתידי של טכניקות אלה גם תאר.

Introduction

הומאוסטזיס pH הוא תהליך דינמי ופיקוח הדוק בכל 1,2 אורגניזמים. תהליכים ביוכימיים מוסדרים היטב על ידי חומציות, וסביבות תאיות מכוונים לטווחי pH צרים כדי לאפשר פעילות אופטימלית של אנזימי התושב. עם זאת, ניתן יהיה לערער על הומאוסטזיס pH תאי על ידי שינויים מהירים בחומציות סביבתית, משמרות מטבוליים, ומסלולי איתות מסוימים. בנוסף, ה-pH תאי יכול עצמו לשמש כאות חשובה. לבסוף, אברונים רבים לשמור על ערכי pH lumenal הנבדלים מסביבת cytosol וחיוניים לתפקודי אברון ספציפיים.

מניות cerevisiae Saccharomyces שמרי מספר מנגנוני הומאוסטזיס pH עם אאוקריוטים גבוהים יותר 2. באברונים חומציים של מסלול endocytic / lysosomal, pH נשלט בעיקר על ידי vacuolar פרוטון translocating-ATPase השמור ביותר (V-ATPase), הפועל במקביל עם רבים exchanGers תלויה בשיפוע PH. כל התאים אוקריוטים גם מנגנוני יצוא פרוטון. הוא האמינו בפטריות וצמחים, משאבת מימן שנייה, ברורה בקרום הפלזמה, Pma1, פרוטונים מטבוליות יצוא ולהיות הקובע העיקרי של ה-pH cytosolic ופוטנציאל קרום פלזמה. הגמישות הגנטית של ס ' cerevisiae והחשיבות המסחרית שלה, הפכו אותו למודל מאוד מעניין וחשוב ללימוד pH הומאוסטזיס 2.

בנוסף להיותו מניעים העיקריים של החמצת אברון, V-ATPases מאוד מוסדר אנזימים והמעבדה שלנו היא מעוניינת בהבנת מנגנוני ויסות V-ATPase. למען מטרה זו, יש לנו כבר משתמשים במדידות pH vivo של pH vacuolar וcytosolic: 1) לעקוב אחר תגובות לתנאים תאיים משתנים, כגון גלוקוז וקיפוח readdition, 2) כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות שפשרת פעילות V-ATPase, ו 3) לחקור coordination של אברון ופלזמת משאבות פרוטונים בממברנה 3-5. ניסויים אלה התאפשרו רק באמצעות הפיתוח של אינדיקטורים pH ratiometric חזקים המתאימים לשימוש בתאי שמרים. . צמח ואח' הראשון הראה כי BCECF (2'7'-Bis (2-carboxyethyl) -5 - (ו 6), carboxyfluorescein), שכבר בשימוש נרחב למדידת חומציות cytosolic בתאי יונקים, מצטבר בvacuole השמרים במקום 6 cytosol. הבדל זה בלוקליזציה BCECF יוחס לאנזימים הרבים hydrolytic בvacuole, אשר עשוי אחראים למחשוף של תיל אסטר acetoxy מBCECF-AM (אסתר acetoxymethyl של BCECF) וvacuolar שימור 6. עלי ואח'. 7 מפותח יותר מדידת חומציות vacuolar באמצעות BCECF ומותאם מדידות אלה לפורמט קורא צלחת פלואורסצנטי. ברט ואח'. הציג pHluorin שמרים כאמצעי למדידת חומציות cytosolic בשמרים בהבעת R פלסמיד שמקורןGFP atiometric pH רגיש 8 תחת שליטה של אמרגן שמרים ספציפי 9.

ספקטרום העירור של שני BCECF ושמרי pHluorin רגיש לחומציות, ולכן הם משמשים כאינדיקטורים pH ratiometric שבה היחס של הקרינה בשני אורכי גל עירור, הנמדדים באורך גל פליטה יחידה, מספק מדד לרמת חומציות 8,10. חיישני pH vacuolar וcytosolic אלה שמרים שמשו במשך שתי מדידות התא בודדות ומבוססות אוכלוסייה. מדידות תא בודד 6,11 מבוצעות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח תמונה. הקרינה vacuolar או cytosolic בשני אורכי הגל נמדדת לכל תא. המדידות מבוססות אוכלוסייה מבוצעות בשני קורא microplate עם יכולות הקרינה מתאימות או בfluorimeter. בדרך כלל יש לנו לעשות מדידות שלנו בfluorimeter, משום שהיא מספקת גישה קלה לתוספת של רכיבים כגון גלוקוז בקוןמדידות הקינטית tinuous. פרוטוקולי המעבדה הנוכחיים שלנו למדידת חומציות vacuolar וcytosolic מפורטים להלן; הן מותאמים גם למבחנים בקלות microplate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מדידה של pH vacuolar In Vivo שימוש BCECF-AM

  1. לגדול תרבות נוזלית 50 מ"ל של זן השמרים שיש למדוד במדיום הרצוי למשך הלילה. המטרה היא לקבל את תאים בשלב אמצע יומן (OD600 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר) מדידה של כ 0.8 להשעיה).
  2. גלולה תאי השמרים על ידי צנטריפוגה. Resuspend גלולה ב0.6 מ"ל של מדיום הגידול וההעברה לצינור microcentrifuge שכבר שקל בעבר. גלולה התאים שוב בmicrocentrifuge XG ב 2000 עבור 60 שניות. הסר את supernatant מלא ככל האפשר, ולאחר מכן לשקול את התא גלולה. Resuspend גלולה לצפיפות סופית של 0.5 גר '/ מ"ל ​​(w / v); תרבות של נפח זה תיתן לי תא גלולה של כ 200 מ"ג, 200 וμl של חיץ תהיה הוסיפה לתת נפח סופי של 400 μl.
  3. הוסף BCECF-AM להשעית התא בריכוז סופי של 50 מ"מ ממניות 12 מ"מ הערוך DMSO. מערבבים היטב ולאחר מכן incubate התאים על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. על פלטפורמת נדנדה או תוף גלגלת.
  4. בעוד התאים דוגרים, להכין מאגרי כיול. חיץ הכיול מכיל 50 מ"מ MES (2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה), 50 HEPES מ"מ (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה), 50 מ"מ KCl, 50 מ"מ NaCl, 0.2 אמוניום אצטט M, 10 מ"מ אזיד הנתרן, ו10 מ"מ 2-deoxyglucose, ומותאם לרמת חומציות הערכים מתאימים לטווח הכיול שלך עם NaOH או HCl. (זהירות: אזיד הנתרן הוא רעילה ביותר ויש לטפל בזהירות.) למדידת חומציות בתאי הבר מסוג, היינו להכין כמה תערובות כיול ב-pH 5.5 ל 6.5, אבל למוטציות צפויות להיות pH vacuolar בסיסי יותר ( מוטציות VMA), היינו להכין תמיסות בופר נוספות, גבוהות יותר.
  5. 2 מיליליטר aliquot של חיץ כיול עבור כל pH ל15 צינורות חרוטי מ"ל, ולהוסיף monensin (מלאי 15 מ"מ) וnigericin (מניית 2 מ"מ) כדי לתת ריכוזים סופיים של monensin מיקרומטר 110 ו -15 מיקרומטר nigericin, respectively. מערבבים היטב במיקסר מערבולת. (זהירות: שני monensin וnigericin הם רעילים ויש לטפל בזהירות.)
  6. כאשר זמן הדגירה BCECF-AM הושלם, גלולה ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה למשך 30 שניות XG ב 2000 בmicrocentrifuge. Resuspend התאים הוא 1 מ"ל של מדיום גידול חסר גלוקוז ו צנטריפוגות כאמורה לעיל. חזור על שלב זה לשטוף פעם אחת, ולאחר מכן resuspend גלולה ב200 μl של מדיום גידול ללא סוכר. מניח על קרח.
  7. הוסף 20 μl של ההשעיה תא צינור אחד כיול pH שהוכן לעיל. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. על תוף גלגלת.
  8. הגדר את fluorimeter למדוד לסירוגין באורכי גל עירור 450 ננומטר ו 490 ננומטר, שני עם אורך גל של 535 ננומטר פליטה. הגדר את טמפרטורת תא הדגימה עד 30 ° C. לבצע את כל המדידות עם ערבוב רצוף של התערובת בקובט.
  9. הוסף 1.96 מ"ל של 1 מ"מ MES (מותאם pH 5 או 7 תלוי ברמת החומציות של הצמיחה בינונית של התאיםND עיצוב ניסיוני). הוסף 20 μl של השעיה תא לתוך קובט. ליזום מדידות הקרינה. אנו אוספים גם הקינטית רציף ונתוני נקודת זמן בניסויים שונים. לנתונים קינטיים רציפים, אנחנו לוקחים את המדידות בכל 6 שניות במשך 5 דקות, ולאחר מכן להוסיף סוכר לריכוז הגלוקוז סופי של 50 מ"מ, ולהמשיך מדידה למשך 5-10 דקות. למדידות בזמן נקודה אחת, אנחנו בדרך כלל לוקחים את המדידות ב1 ו -5 דקות. לאחר תוספת של תאים לקובט, להוסיף סוכר כמו במדידות הקינטית, ולאחר מכן לקחת דקות אחר מדידת 5. לאחר תוספת סוכר. יכולות להיות מגוונות תוספות אלה, וניתן גם להוסיף רכיבים נוספים (מעכבים, וכו ').
  10. לאחר המדידות הניסיוניות הן מוחלטת, הסר את הצינורות מכיול 30 מעלות צלזיוס הדגירה ולהעביר את כל נפח 2 מ"ל לכל לקובט fluorimeter. למדוד הקרינה בבית באותן ההגדרות (ראה 1.8) כל 5 שניות על סך של 30 שניות לכל דגימה.
  11. יצוא נתוני הקרינה ל-Microsoft Excel. (לfluorimeter שלנו, זה מחייב יצוא של הנתונים כטקסט בצורת טאבים ויבוא לתוך Excel.) לקבל עקומת כיול על ידי חישוב היחס של הקרינה ב 490 ננומטר ל -450 ננומטר עבור כל תערובת כיול. יחס הקרינה אז זמם לעומת pH כדי לקבל עקומת כיול.
  12. להמיר את נתוני ניסוי ליחס הקרינה ולחשב pH באמצעות עקומת הסטנדרט. לאחר מכן ה-pH vacuolar יכול זממה נגד זמן (קינטיקה של שינויי pH) או בהשוואה בתנאים שונים (איור 1), או בזנים מוטנטים שונים.

2. מדידה של pH Cytosolic In Vivo שימוש pHluorin שמרים

  1. להפוך את זן השמרים הרצויים עם pHluorin שמרי פלסמיד ידי פרוטוקולים סטנדרטיים, ובחר לtransformants על חסר אורציל מדיום מינימאלי בתוספת (SC-אורציל).
  2. לגדול תרבות נוזלית 50 מ"ל של תאים הפכו בSC-אורציל לשלב אמצע יומן (OD
  3. הכנת תקני כיול כפי שתואר עבור pH vacuolar, אבל חיץ לטווח pH מתאים למדידות pH cytosolic, בדרך pH 6-8. Aliquot 2 מ"ל של חיץ כיול מותאם לרמת החומציות הרצויה למספר 15 צינורות חרוטי מ"ל. הוסף monensin וnigericin כמתואר לעיל (1.4) ומערבבים היטב.
  4. קציר התאים על ידי צנטריפוגה כפי שתואר לעיל, וresuspend גלולה ב600 μl של מדיום הגידול. העברה לשקל צינור microcentrifuge, ותאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 5000 סל"ד במשך 30 שניות. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום גידול ללא סוכר (SC-אורציל,-גלוקוז), תאים גלולה שוב וחוזר חליל. לאחר צנטריפוגה הסופית, להסיר את supernatant באופן יסודי ככל האפשר, ולשקול את התא גלולה. Resuspend תאים לצפיפות סופית של 0.5 גר '/ מ"ל ​​בSC-אורציל ללא סוכר.
  5. הוסף 20 μl של השעיה תא צינור אחד של חיץ כיול ומערבבים היטב במיקסר מערבולת. לדגור על 30 ° C ב הרוטור תוף מסתובב במשך 60 דקות.
  6. הגדרת fluorimeter לעירור באורכי גל 405 ננומטר ו485 ואורך גל פליטה של ​​508 ננומטר. להמשיך עם נקודה אחת בזמן או מדידות קינטיים ותוספת של גלוקוז כמתואר לעיל למדידת BCECF.
  7. למדוד הקרינה של דגימות כיול, ולבנות עקומת כיול כלBCECF (ראה 1.10-1.11). עלילה של יחס לעומת pH הקרינה היא ליניארי על פני הטווח של רוב מדידות pH cytosolic (pH 6.0-8.0) 9, מומרות מדידות הקרינה יחס כל כך בקלות לניסוי ה-pH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את הנתונים המתקבלים על pH vacuolar wild-type תאי שמרים גודלו במדיום עשיר (שמרי תמצית-peptone-dextran; YEPD) נאגרו לחומציות 5 עם 50 מ"מ MES. לעתים קרובות אנו מגדלים את התאים במדיום שנאגרו בגלל החומציות של המדיום יכולה לשנות באופן דרמטי למדי במהלך צמיחה בין לילה, במיוחד למדיום מינימאלי, ומצאנו כי ה-pH של מדיום הגידול יכול להשפיע על תגובות pH vacuolar 3. עם זאת, היא גם מקובל בניסויים רבים לגדול תאים במדיום unbuffered. איור 1 א מציג עקום כיול לתאי מודגרות עם BCECF-PM על ידי הפרוטוקול לעיל. למרות שהקשר בין יחס BCECF הקרינה וחומציות vacuolar הוא לא ליניארי על פני טווח רחב יותר pH 7, זה כמעט ליניארית בטווח הרלוונטי למדידות הניסיוניות הללו, וקו מגמה ליניארי מוצג ומשמשת לחישוב ערכי ה-pH לצורך הניסוי. שינויי pH vacuolar נובעים מGLבנוסף ucose לתאי גלוקוז-מקופחים מוצגים באיור 1. עליות pH vacuolar במהלך BCECF-AM תיוג בגלל שתאים הם גלוקוז מקופחים, אך פוחתת לאחר readdition גלוקוז, ככל הנראה כתוצאה מהפעלת V-ATPase דרך הרכבה מחדש 3,4. עלייה קלה ברמת חומציות vacuolar הוא ציין על תוספת של 50 מ"מ KCl, שלוש דקות לאחר תוספת הסוכר. במחקר גדול יותר, שאנחנו בדרך כלל לרוץ לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (ביולוגי משכפל) ולהראות את ה-pH הממוצע ± SE עבור כל תנאי 3-5.

קינטיקה של שינוי pH cytosolic עם תוספת סוכר מוצגת באיור 2. לצורך ניסוי זה, תאי שמרים פראיים מסוג שגדלו במדיום שלם סינטטי חסרי אורציל (SC-אורציל), נאגר לחומציות 5 עם 50 מ"מ MES. המדיום הזה מתאים לתחזוקה של pHluorin השמרים המכיל פלסמיד תחת שליטה של ​​אמרגן קינאז phosphoglycerate (PGK),שיש לנו בשימוש לאחרונה 3,5; פלסמידים אחרים עשויים לדרוש תנאים נבחרים שונים. עקומת הכיול (איור 2 א) מראה כי תגובת ratiometric של pHluorin ל-pH היא ליניארי על פני טווח רחב של pH; בדרך כלל מכסה את כל pH cytosolic רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. התגובה של התאים פראיים מסוג שמוצגים כאן היא מאוד אופיינית, יש ירידה מיידית ברמת חומציות ואחרי עלייה לרמת חומציות 7.2-7.4.

אנו בונים עקומים כיול עבור כל זן ובכל ניסוי. אנו משתמשים בתערובת כיול באתרו שתוארה על ידי ברט ואח'. 9 עבור מדידות pHluorin BCECF ו. תערובת זו מכילה אמוניום אצטט תא permeant מסוגלת קריסה הדרגתיים pH על פני ממברנות מרובות, אזיד הנתרן וdeoxyglucose כדי לעצור את ייצור ה-ATP ולעכב את H +-משאבות, וmonensin וnigericin, יונופורים מעורבים בקריסה הדרגתיים pH בפרשת השמרים / VACהתחבורה uolar משעולים 12 וקרום המיטוכונדריה פנימי 13, בהתאמה. ראוי לציין שאנחנו לא לחסר ערך רקע לתאים ללא תווית למדידת ערך pH vacuolar או cytosolic. למרות שעושים את התאים יש לי כמה autofluorescence פנימי, יש לנו בהשוואה ישירות מדידות pH עם ובלי תיקון רקע על הכיול ודגימות ניסוי ולא ראינו שום הבדל בערכים הסופיים. רקע החיסור יגרום עקומות כיול תלולה יותר, ועשוי להיות רצוי בתנאים שבו אותות הקרינה הם נמוכים ויחס אות לרעש הופך לבעיה. לדוגמה, במדידה מגולגי / pHluorin endosome-5 מקומי, אשר נותן אות כוללת נמוכים יותר, עשינו להחסיר אות רקע מכל המדידות.

איור 1
איור 1. Measurement של תגובות pH vacuolar בwild-type תאים שגודלו בYEPD, pH 5. תאים פרוע מהסוג (-SF838 5Aα) גדלו ליומן אמצע שלב ואז טופח עם BCECF-AM כפי שתואר לעיל. עקומת כיול א 'מראה שנמדד יחס בין עוצמת הקרינה מעירור ב 490 ננומטר (I490) לעצמה מעירור ב 450 ננומטר (I450) (הן נמדדות באורך גל פליטה של ​​535 ננומטר) ב-pH המגוון. קו מגמה ליניארי מוצג. PH vacuolar ב 'אחרי קיפוח גלוקוז קצר נמדד בחלק מאותה, ההשעיה תא שכותרתו (ללא סוכר). גלוקוז נוספו לאחר מכן לריכוז סופי של 50 מ"מ ויחס הקרינה נמדד לאחר 5 דקות (5 '+ גלוקוז). 50 מ"מ KCl נוספו לאחר מכן ויחס הקרינה נמדד לאחר 3 דקות והמיר לרמת חומציות (3 '+ KCl).

איור 2
איור 2. קינטיקה של CYTתגובה לחומציות osolic בנוסף גלוקוז בתאי wild-type. תאים פראי מסוג שהפכו עם pHluorin שמרים תחת שליטה של קינאז phosphoglycerate (PGK) האמרגן וtransformants גדל כפי שתואר לעיל. עקומת כיול א מראה יחס נמדד עוצמת הקרינה של ב405 ננומטר (I405) לעצמה ב485 ננומטר (I485) לעומת pH. pH Cytosolic ב 'נגזר ממדידות עוצמת הקרינה שצולמו בכל 6 שניות. מעל 6 דקות. גלוקוז (50 מ"מ סופי) התווסף לתאים בקובט בזמן שצוין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש לנו פרוטוקולים אלה מנוצלים כדי לטפל במספר היבטים של הומאוסטזיס-pH. לדוגמה, יש לנו לעומת תגובות cytosolic וה-pH של תאים שעברו מוטציה ופראי מסוג V-ATPase לקוי 4,5. גם אנחנו בדקנו את ההשפעות של תנאים שהשתנו צמיחה, במיוחד pH תאי, בתגובה לגלוקוז vacuolar pH 3. חשוב מכך, את התגובות שאנו רואים הן גם עולים בקנה אחד עם שיטות אחרות של מדידת חומציות כמותי ועם נתונים ביוכימיים המתארים פעילויות שינה של משאבות הפרוטונים.

שתי התכונות החשובות ביותר של הסוג של במדידות pH vivo מתוארות כאן הן לוקליזציה של fluorophore והרמה של אות; בעיות עם כל אחד מהם דורשות שינוי של השיטה ליישום הספציפי או המוטציה. הלוקליזציה של vacuolar BCECF היא מקרית 6 במקצת, אך הוא השתמר במספר מוטציות שונות, ובכלל זהVMA מוטנטים 4, שרמות נמוכות של hydrolases vacuolar. vacuoles השמרים הם בקלות דמיינו ידי מיקרוסקופיה אופטית תחת Nomarski, ואנו מאשרים לוקליזציה vacuolar של צבע לכל זן. pHluorin הוא תכליתי יותר כחיישן ה-pH, במיוחד לנוכח ההיענות שלה על רוב טווח pH הפיזיולוגי (איור 2 א). PHluorin השמרים שיש לנו בשימוש נראה באופן בלעדי cytosolic, ככל הנראה משום שהוא חסר מידע מיקוד אחר. עם זאת, pHluorin כבר ממוקד למנגנון Golgi ידי תיוג עם רצפים מטרנספורטר כלוריד גולגי Gef1, יחד עם הכנסה נוספת של מגזרי קרום מhalorhodopsin לתת טופולוגיה התקינה (pH-Gef1; 14). Orij et al. היה ממוקד בהצלחה pHluorin למטריקס המיטוכונדריה ונמדד שינויי pH המיטוכונדריה עם חילוף חומרים 15. תוצאות אלו מצביעות על כך שחלבוני היתוך מתוכננים כראוי עלולים להפוך אותו possibLe לפקח תגובות pH באברונים רבים. האות לרמת רעש של vacuolar BCECF היא גבוהה למדי ברוב זני השמרים שעליהם עמדו. אות מחלבוני pHluorin הביעו ניתן להשפיע באמצעות אמרגן הנהיגה ביטוי pHluorin. בcytosolic המקורי pHluorin המבנה 9, הביטוי היה מונע על ידי אמרגן המכיל אלמנט הלם חום ולא היה גבוהה מאוד. עם זאת, מאוחר יותר תופיע בונה ביטוי מאמרגן PGK, TEF1 האמרגן, והאמרגן אקטין לתת רמות גבוהות יותר של ביטוי 3,15,16. PHluorin pH-Gef1 גולגי הספציפי בא לידי ביטוי מאמרגן מושרה 14. אינדוקציה חולפת ביטוי עשויה להיות מועילה במיוחד לתאים קטנים יותר של הפרשה וendocytic מסלולים, שבו ביטוי ברמה גבוהה מתמשך עלול להוביל לpHluorin mislocalization או אפילו הפרעות בחומציות תא, מניפסט באמצעות צמיחה או mislocalization האיטית של חלבונים אחרים.

<כיתת p = "jove_content"> בנוסף למאפיינים של fluorophores, חשוב להכיר בכך במדידות pH vivo רגישים לצמיחה ולתנאים מטבוליים של שמרי התאים עצמם. רגישות זו היא רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ופוטנציאל מעניין, אבל גם יכולה להיות מקור לשונות בין מדידות. אנחנו דואגים להשוות מדידות מתאי שמרים באותו שלב הצמיחה, בדרך כלל בתחילת שלב לוגריתמי לאמצע. בגלל תגובות pH vacuolar יכולות להיות רגישות ל-pH תאי 3, אנו עוקבים אחר pH של מדיום הגידול, במיוחד לתאים שגודלו במדיום unbuffered. למרות שזה ברור שתקשורת צמיחה רבות ושונות בקנה אחד עם מדידת חומציות ratiometric, הבדלים בהרכב בינוני יכולים בהחלט להשפיע על ה-pH 17. בנוסף, לאחר שהתאים נקצרים ומוכן למדידה, שמצאנו כי מניעת גלוקוז ממושכת (שעות) יורדת לא רק CYT הראשוניה-pH ומעלה את רמת חומציות osolic vacuolar הראשונית, אלא גם מאטה את התגובות באופן משמעותי לגלוקוז. לכן, אנחנו בדרך כלל ליזום ניסויים בתוך 30 דקות. או פחות מתחילת קיפוח גלוקוז.

הצטברות של אמינים lysosomotropic ניאון, כגון quinacrine וacridine כתום, כבר נעשתה שימוש נרחב על מנת להעריך החמצת תא בתאים חי שמרים. שיטות אלה הן מהירה ופשוט, אבל צריכה להיחשב הרבה יותר איכותיות מאשר מדידות ratiometric של pH. באופן כללי, שיטות כגון ספיגת quinacrine להסתמך על חדירות הממברנה של הצורה הבסיסית של fluorophore, אשר הופכים כאשר הוא לכוד בתא protonated חומצי ויכול להיות דמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 18. הצטברות של הצבע מסתמכת על חלוקה על פי שיפוע pH על פני הקרום, ולכן ספיגה לאברונים חומציים יכולה להיחלש או על ידי alkalinization של אברון או acidificatiעל של cytosol. השיטות אלה יישארו שימושיות, אבל כנראה צריכה להתפרש כמתן רמה היחסית של החמצה.

היישומים של מדידות pH ניאון ratiometric בשמרים להמשיך ולהרחיב. ברט ואח'. לאחרונה נמדד pH vacuolar באוסף של מעל 4500 מוטציות מחיקת שמרים שאינם חיוניות וחשף מספר מנגנוני רומן של pH בתקנה 17. BCECF וpHluorin 19,20 גם הותאמו לתא הקרינה המופעל פורמט מיון כדי להקל על הקרנה למעכבים חדשים V-ATPase. Dechant et al. מיקרופלואידיקה 11 להשתמש בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח V-ATPase הרכבה וחומציות cytosolic בו זמנית דרך מחזורים רבים של קיפוח וגלוקוז readdition. תוצאות אלו מצביעות על כך שמדידות של חומציות ratiometric בשמרים הן מספיק חזקות ותכליתיות שיש להחיל בסוגים רבים של ניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש החוקרים אין ניגודי האינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM50322 לPM קיין. המחברים מודים לד"ר ראג'יני ראו, אוניברסיטת ג'ונס הופקינס למתן פלסמידים pHluorin שמרים ועצה על מדידות pH ratiometric, וד"ר א 'גלוריה מרטינז מוניוס לעבודה מתוך פרוטוקולים אלה למעבדה שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Horiba Jobin Yvon Model Fluoromax-4 Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM Invitrogen/Molecular Probes B1150 Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin Sigma M5273 Toxic.
nigericin Sigma N7143 Toxic.
MES Sigma M8250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
  2. Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
  3. Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
  4. Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
  5. Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
  6. Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
  7. Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
  8. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  9. Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
  10. Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
  11. Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
  12. Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
  13. Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
  14. Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
  15. Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
  16. Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
  17. Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
  18. Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
  19. Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
  20. Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 74 ביוכימיה מיקרוביולוגיה ביולוגיה תאית ביופיזיקה vacuoles cytosol שמרים העברת חלבונים קרום משאבות יון fluorometry שמרים ה-pH תאי vacuole הקרינה רציומטרי
מדידה של pH vacuolar וCytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; בהשעיות תא שמרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diakov, T. T., Tarsio, M., Kane, P.… More

Diakov, T. T., Tarsio, M., Kane, P. M. Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions. J. Vis. Exp. (74), e50261, doi:10.3791/50261 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter