Summary
Vacuolar और साइटोसोलिक पीएच रहते खमीर में मापा जा सकता है (
Abstract
Vacuolar और पीएच साइटोसोलिक अत्यधिक खमीर कोशिकाओं में विनियमित और समग्र पीएच homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका पर कब्जा कर रहे हैं. हम कोटर या साइटोसॉल के लिए स्थानीय पीएच के प्रति संवेदनशील fluorophores का उपयोग vivo में पीएच की ratiometric माप के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है. Vacuolar पीएच अपने acetoxymethyl एस्टर रूप में कोशिकाओं में शुरू की जब खमीर में रिक्तिका लिए localizes जो BCECF, का उपयोग कर मापा जाता है. साइटोसोलिक पीएच एक खमीर प्रमोटर, खमीर pHluorin के नियंत्रण में व्यक्त एक पीएच के प्रति संवेदनशील GFP के साथ मापा जाता है. एक fluorimeter में खमीर सेल निलंबन में प्रतिदीप्ति अनुपात की माप के लिए तरीके से वर्णित हैं. इन प्रोटोकॉल के माध्यम से, अलग अलग परिस्थितियों में या अलग खमीर म्यूटेंट में पीएच की एक समय बिंदु माप तुलना की गई है और समय के साथ पीएच में परिवर्तन नजर रखी गई है. इन तरीकों में भी उच्च throughput प्रयोगों के लिए एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया गया है. अन्य एपी से अधिक ratiometric पीएच माप के लाभवर्तमान में उपयोग, संभावित प्रयोगात्मक समस्याओं और समाधान, और इन तकनीकों का उपयोग भविष्य के लिए संभावनाओं में proaches भी वर्णित हैं.
Introduction
पीएच homeostasis को सभी जीवों 1,2 में एक गतिशील और उच्च विनियमित प्रक्रिया है. जैव रासायनिक प्रक्रियाओं कस पीएच द्वारा विनियमित रहे हैं, और intracellular वातावरण निवासी एंजाइमों का इष्टतम गतिविधि की अनुमति के लिए संकीर्ण पीएच सीमाओं को देखते हैं. हालांकि, intracellular पीएच homeostasis को पर्यावरण पीएच, चयापचय परिवर्तन, और कुछ संकेत दे रास्ते में तेजी से बदलाव के द्वारा चुनौती दी जा सकती है. इसके अलावा, intracellular पीएच एक महत्वपूर्ण संकेत के रूप में ही सेवा कर सकते हैं. अंत में, कई organelles के organelle विशिष्ट कार्यों के लिए आसपास के cytosol से अलग और आवश्यक हैं कि lumenal पीएच मान बनाए रखने के लिए.
उच्च यूकेरियोट्स 2 के साथ पीएच समस्थिति तंत्र की खमीर के शेयर एक नंबर. लाइसोसोमल / endocytic मार्ग की अम्लीय organelles में, पीएच मुख्य रूप से कई exchan के साथ मिलकर में अभिनय, अत्यधिक संरक्षित vacuolar प्रोटॉन translocating ATPase (वि ATPase) द्वारा नियंत्रित किया जाता हैपीएच ढाल पर निर्भर Gers. सभी कोशिकाओं को भी प्रोटॉन निर्यात तंत्र है. में फफूंद और पौधों, प्लाज्मा झिल्ली पर एक दूसरा, अलग प्रोटॉन पंप, Pma1, निर्यात चयापचय प्रोटॉन और साइटोसोलिक पीएच और प्लाज्मा झिल्ली क्षमता की प्रमुख निर्धारक माना जा रहा है. एस के आनुवंशिक लचीलापन cerevisiae और इसकी वाणिज्यिक महत्व, यह पीएच समस्थिति 2 के अध्ययन के लिए एक बहुत ही रोचक और महत्वपूर्ण मॉडल बना दिया है.
Organelle अम्लीकरण के प्राथमिक चालकों होने के अलावा, वि ATPases अत्यधिक एंजाइमों विनियमित रहे हैं और हमारे प्रयोगशाला वि ATPase विनियमन के तंत्र को समझने में दिलचस्पी है. इस लक्ष्य की दिशा में, हम vacuolar और साइटोसोलिक पीएच के vivo पीएच माप में उपयोग किया गया है: 1) परिवर्तन के प्रभाव है कि समझौता वि ATPase गतिविधि की जांच करने के लिए ग्लूकोज के अभाव और readdition, 2 के रूप में बदल बाह्य परिस्थितियों,) के लिए प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए, और 3) Coor पता लगाने के लिएorganelle और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटॉन पंप 3-5 की dination. इन प्रयोगों केवल खमीर कोशिकाओं में उपयोग करने के लिए उत्तरदायी मजबूत ratiometric पीएच संकेतकों के विकास के माध्यम से संभव हो गया. . स्तनधारी कोशिकाओं में साइटोसोलिक पीएच मापने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, जो, खमीर रिक्तिका में जम - संयंत्र एट अल पहली BCECF ((और 6) carboxyfluorescein 2'7'-बीआईएस (2 carboxyethyl) -5) से पता चला कि बजाय साइटोसॉल 6 की. BCECF स्थानीयकरण में यह अंतर BCECF-(ए. BCECF की acetoxymethyl एस्टर) और vacuolar प्रतिधारण 6 से acetoxy मिथाइल एस्टर की दरार के लिए संभावना जिम्मेदार हैं जो रिक्तिका में कई hydrolytic एंजाइमों, के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है. अली एट अल. 7 आगे BCECF उपयोग कर vacuolar पीएच माप विकसित और एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक प्रारूप करने के लिए इन मापों रूपांतरित किया. ब्रेट एट अल. एक प्लाज्मिड जनित आर व्यक्त खमीर में साइटोसोलिक पीएच मापने का एक साधन के रूप में खमीर pHluorin पेशएक खमीर विशिष्ट प्रमोटर 9 के नियंत्रण में atiometric पीएच संवेदनशील GFP 8.
BCECF और खमीर pHluorin दोनों की उत्तेजना स्पेक्ट्रा पीएच के प्रति संवेदनशील हैं, तो वे एक ही तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन पर मापा दो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, पर प्रतिदीप्ति के अनुपात पीएच 8,10 के एक उपाय प्रदान करता है जिसमें ratiometric पीएच संकेतक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. ये खमीर vacuolar और साइटोसोलिक पीएच सेंसर दोनों एकल कोशिका और जनसंख्या के आधार पर माप के लिए इस्तेमाल किया गया है. एकल कक्ष माप 6,11 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण से प्रदर्शन कर रहे हैं. दो तरंग दैर्ध्य में vacuolar या साइटोसोलिक प्रतिदीप्ति प्रत्येक कक्ष के लिए मापा जाता है. जनसंख्या के आधार पर माप उपयुक्त प्रतिदीप्ति क्षमताओं के साथ एक microplate रीडर या तो में या एक fluorimeter में प्रदर्शन कर रहे हैं. यह चुनाव के दौरान इस तरह के ग्लूकोज के रूप में घटकों के अलावा के लिए आसान पहुँच प्रदान करता है क्योंकि हम आम तौर पर, एक fluorimeter में हमारे मापन किया हैtinuous गतिज माप. Vacuolar और साइटोसोलिक पीएच की माप के लिए हमारे वर्तमान प्रयोगशाला प्रोटोकॉल नीचे सूचीबद्ध हैं, दोनों को भी आसानी से microplate assays के लिए अनुकूलित कर रहे हैं.
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Protocol
1. BCECF-AM उपयोग करना Vivo में vacuolar पीएच का मापन
- रातोंरात वांछित मध्यम में मापा जा खमीर तनाव का एक 50 मिलीलीटर तरल संस्कृति विकसित. लक्ष्य (OD600 (600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व) निलंबन के लिए लगभग 0.8 के माप) मध्य लॉग चरण में कोशिकाओं के लिए है.
- Centrifugation द्वारा गोली खमीर कोशिकाओं. मध्यम विकास और पहले से तौला गया है कि एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण 0.6 मिलीलीटर में गोली Resuspend. 60 सेकंड के लिए 2,000 XG पर एक microcentrifuge में फिर गोली कोशिकाओं. के रूप में पूरी तरह से संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें और फिर सेल गोली तौलना. 0.5 ग्राम / एमएल (w / वी) के अंतिम घनत्व को गोली Resuspend, इस मात्रा का एक संस्कृति एक लगभग 200 मिलीग्राम की सेल गोली, और बफर के 200 μl दे देंगे 400 μl के अंतिम मात्रा देने के लिए जोड़ दिया जाएगा.
- DMSO में तैयार एक 12 मिमी स्टॉक से 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में सेल निलंबन को BCECF-AM जोड़ें. अच्छी तरह से और फिर कांग्रेस मिक्स30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं यूबेट. एक कमाल मंच या रोलर ड्रम पर.
- कोशिकाओं incubating रहे हैं, अंशांकन बफ़र्स तैयार करते हैं. , 50 मिमी HEPES (4 - (2 hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड), 50 मिमी KCl, 50 मिमी NaCl, 0.2 एम अमोनियम एसीटेट, - अंशांकन बफर 50 मिमी एमईएस ((एन morpholino) ethanesulfonic एसिड 2) शामिल 10 मिमी सोडियम azide, और 10 मिमी 2-deoxyglucose, और पीएच को समायोजित किया जाता है NaOH या एचसीएल के साथ अपने अंशांकन रेंज के लिए उचित मूल्यों. (चेतावनी: सोडियम azide के बेहद जहरीला है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए.) जंगली प्रकार की कोशिकाओं में पीएच की माप के लिए, हम (6.5 करने के लिए, लेकिन एक और अधिक क्षारीय vacuolar पीएच है की उम्मीद म्यूटेंट के लिए 5.5 पीएच पर कई अंशांकन मिश्रण तैयार होगा VMA म्यूटेंट), हम अतिरिक्त, उच्च पीएच बफ़र्स तैयार होगा.
- अशेष 2 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में प्रत्येक पीएच के लिए अंशांकन बफर के मिलीलीटर, और अंतिम 110 माइक्रोन monensin की सांद्रता और 15 माइक्रोन nigericin, आर देने के लिए monensin (15 मिमी शेयर) और nigericin (2 मिमी शेयर) जोड़espectively. एक भंवर मिक्सर पर अच्छी तरह से मिलाएं. (चेतावनी: monensin और nigericin दोनों विषाक्त कर रहे हैं और ध्यान से संभाला जाना चाहिए.)
- एक microcentrifuge में 2,000 XG पर 30 सेकंड के लिए centrifugation द्वारा BCECF-AM ऊष्मायन समय पूरा हो गया है, गोली सेल निलंबन. कोशिकाओं Resuspend ऊपर के रूप में ग्लूकोज और अपकेंद्रित्र कमी मध्यम विकास के 1 मिलीग्राम है. एक बार इस धोने कदम दोहराएँ, और फिर ग्लूकोज बिना मध्यम विकास के 200 μl में गोली resuspend. बर्फ पर रखें.
- ऊपर तैयार प्रत्येक पीएच अंशांकन ट्यूब सेल निलंबन के 20 μl जोड़ें. 30-60 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. एक रोलर ड्रम पर.
- बारी - बारी से उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 450 एनएम और 490 एनएम, 535 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ दोनों को मापने के लिए fluorimeter सेट करें. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना कक्ष तापमान सेट क्युवेट में मिश्रण की निरंतर सरगर्मी के साथ सभी मापन प्रदर्शन करना.
- 1 मिमी एमईएस की 1.96 मिलीग्राम ('कोशिकाओं मध्यम विकास एक के पीएच के आधार पर पीएच 5 या 7 से समायोजित जोड़ेंएन डी प्रयोगात्मक डिजाइन). क्युवेट में सेल निलंबन के 20 μl जोड़ें. प्रतिदीप्ति माप आरंभ. हम निरंतर गतिज और विभिन्न प्रयोगों में समय बिंदु डेटा दोनों इकट्ठा. निरंतर गतिज डेटा के लिए, हम 5 मिनट के लिए हर 6 सेकंड मापन करते हैं, तो 50 मिमी के अंतिम ग्लूकोज एकाग्रता के लिए ग्लूकोज को जोड़ने, और 5-10 मिनट के लिए माप जारी है. एक समय बिंदु माप के लिए, हम आम तौर पर 1 पर माप लेने और 5 मिनट. क्युवेट के लिए कोशिकाओं के अलावा के बाद, काइनेटिक माप के रूप में ग्लूकोज को जोड़ने, और फिर एक और माप 5 मिनट ले. ग्लूकोज इसके बाद. ये अतिरिक्त विभिन्न जा सकता है, और अतिरिक्त घटक (निरोधक, आदि) को भी जोड़ा जा सकता है.
- प्रयोगात्मक माप पूरा कर रहे हैं, 30 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन से अंशांकन ट्यूब को हटाने और fluorimeter क्युवेट के लिए प्रत्येक के लिए पूरे 2 मिलीलीटर मात्रा स्थानांतरण. हर 5 सेकंड प्रत्येक नमूने के लिए 30 सेकंड की कुल से अधिक (1.8 देखें) एक ही सेटिंग में प्रतिदीप्ति उपाय.
- माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के लिए प्रतिदीप्ति डेटा निर्यात करें. (हमारे fluorimeter के लिए, इस एक्सेल में टैब सीमांकित फार्म और आयात में पाठ के रूप में डेटा के निर्यात की आवश्यकता है.) प्रत्येक अंशांकन मिश्रण के लिए 450 एनएम के लिए 490 एनएम प्रतिदीप्ति के अनुपात की गणना के द्वारा एक अंशांकन वक्र प्राप्त करते हैं. प्रतिदीप्ति अनुपात फिर एक अंशांकन वक्र पाने के लिए पीएच बनाम साजिश रची है.
- प्रतिदीप्ति अनुपात करने के लिए प्रयोगात्मक डेटा कन्वर्ट और मानक वक्र का उपयोग पीएच की गणना. Vacuolar पीएच तो समय (पीएच परिवर्तन के कैनेटीक्स) के खिलाफ साजिश रची है या विभिन्न स्थितियों (चित्रा 1) के अधीन या अलग उत्परिवर्ती उपभेदों में तुलना कर सकते हैं.
2. खमीर pHluorin का प्रयोग Vivo में साइटोसोलिक पीएच का मापन
- मानक प्रोटोकॉल द्वारा प्लाज्मिड खमीर pHluorin साथ वांछित खमीर तनाव रूपांतरण, और पूरक कम से कम मध्यम कमी uracil (अनुसूचित जाति uracil) पर transformants के लिए चयन करें.
- मध्य लॉग चरण (आयुध डिपो के लिए अनुसूचित जाति uracil में बदल कोशिकाओं की एक 50 मिलीलीटर तरल संस्कृति विकसित
- Vacuolar पीएच, लेकिन साइटोसोलिक पीएच माप, आम तौर पर पीएच 6-8 के लिए उपयुक्त एक पीएच श्रृंखला के लिए बफर के रूप में वर्णित अंशांकन मानकों को तैयार है. अंशांकन बफर की अशेष 2 मिलीलीटर कई 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में वांछित पीएच को समायोजित. (1.4) जैसा कि ऊपर वर्णित monensin और nigericin जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- ऊपर वर्णित के रूप में centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल, और मध्यम विकास के 600 μl में गोली resuspend. 30 सेकंड के लिए 5000 rpm पर centrifugation द्वारा एक तौला microcentrifuge ट्यूब, और गोली कोशिकाओं के लिए स्थानांतरण. फिर ग्लूकोज (अनुसूचित जाति uracil, ग्लूकोज), गोली कोशिकाओं के बिना विकास के माध्यम से 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और दोहराएँ. अंतिम Centrifugation के बाद, के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला हटाने और सेल गोली तौलना. कोई ग्लूकोज के साथ अनुसूचित जाति uracil में 0.5 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम घनत्व के लिए कोशिकाओं Resuspend.
- अंशांकन बफर के प्रत्येक ट्यूब सेल निलंबन के 20 μl जोड़ें और एक भंवर मिक्सर पर अच्छी तरह से मिलाएं. 3 सेते0 ° 60 मिनट के लिए एक कताई ड्रम रोटर पर सी.
- तरंग दैर्ध्य 405 और 485 एनएम उत्तेजना और 508 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए fluorimeter सेट करें. BCECF माप के लिए ऊपर वर्णित के रूप में एक समय बिंदु या गतिज माप और ग्लूकोज के अलावा के साथ आगे बढ़ें.
- अंशांकन नमूनों की प्रतिदीप्ति उपाय, और BCECF (1.10-1.11 देखें) के रूप में एक अंशांकन वक्र का निर्माण. प्रतिदीप्ति अनुपात बनाम पीएच की एक साजिश सबसे साइटोसोलिक पीएच माप (पीएच 6.0-8.0) 9 की सीमा पर रैखिक है, ताकि प्रयोगात्मक प्रतिदीप्ति अनुपात माप आसानी से पीएच में बदल रहे हैं.
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Representative Results
50 मिमी एमईएस के साथ पीएच 5 से बफर, चित्रा 1 अमीर मध्यम में उगाई जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं (YEPD खमीर निकालने peptone-dextran) पर प्राप्त vacuolar पीएच डेटा प्रस्तुत करता है. मध्यम के पीएच विशेष रूप से कम से कम मध्यम के लिए रातोंरात वृद्धि के दौरान काफी नाटकीय रूप से बदल सकते हैं, क्योंकि हम अक्सर बफर मध्यम में कोशिकाओं के विकास, और हम मध्यम विकास के पीएच vacuolar पीएच प्रतिक्रियाओं 3 को प्रभावित कर सकते हैं कि मिल गया है. कई प्रयोगों unbuffered मध्यम में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए हालांकि, यह भी स्वीकार्य है. चित्रा 1 ए से ऊपर प्रोटोकॉल द्वारा BCECF-AM साथ incubated कोशिकाओं के लिए एक अंशांकन वक्र से पता चलता है. BCECF प्रतिदीप्ति अनुपात और vacuolar पीएच के बीच संबंध एक व्यापक पीएच सीमा पर 7 अरैखिक है, यह इन प्रयोगात्मक माप के लिए प्रासंगिक रेंज में लगभग रैखिक है, और एक रेखीय ट्रेंडलाइन दिखाया गया है और प्रयोग के लिए पीएच मान की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जीएल से उत्पन्न vacuolar पीएच परिवर्तनग्लूकोज से वंचित कोशिकाओं को ucose अलावा चित्रा 1 बी में दिखाया गया. दौरान vacuolar पीएच बढ़ जाती कोशिकाओं को ग्लूकोज से वंचित हैं क्योंकि BCECF-AM लेबलिंग, लेकिन दुबारा जोड़ना 3,4 के माध्यम से वि ATPase सक्रियण का एक परिणाम के रूप में शायद, ग्लूकोज readdition के बाद कम हो जाती है. Vacuolar पीएच में एक मामूली वृद्धि 50 मिमी KCl, ग्लूकोज इसके बाद तीन मिनट के अलावा पर मनाया जाता है. एक बड़े अध्ययन में, हम आम तौर पर कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (जैविक replicates) चलाने के लिए और हर हालत में 3-5 के औसत पीएच ± एसई दिखा.
ग्लूकोज इसके साथ साइटोसोलिक पीएच परिवर्तन के कैनेटीक्स चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस प्रयोग के लिए, जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं 50 मिमी एमईएस के साथ पीएच 5 से बफर, uracil (अनुसूचित जाति uracil) की कमी सिंथेटिक पूरा मध्यम में बड़े हो रहे थे. यह मध्यम, phosphoglycerate kinase (PGK) प्रमोटर के नियंत्रण में प्लाज्मिड युक्त खमीर phluorin के रखरखाव के लिए उपयुक्त हैजो हम हाल ही में 3,5 इस्तेमाल किया है, अन्य प्लास्मिडों अलग चयन स्थितियों की आवश्यकता हो सकती है. अंशांकन वक्र (2A चित्रा) पीएच को pHluorin की ratiometric प्रतिक्रिया पीएच की एक विस्तृत रेंज पर रैखिक है कि पता चलता है, आम तौर पर किसी भी physiologically प्रासंगिक साइटोसोलिक पीएच को कवर. यहाँ दिखाया जंगली प्रकार की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया बहुत विशेषता है, पीएच 7.2-7.4 करने के लिए एक वृद्धि के बाद पीएच में एक तत्काल कमी आई है.
हम प्रत्येक तनाव के लिए और हर प्रयोग में अंशांकन घटता निर्माण. हम ब्रेट एट अल द्वारा वर्णित सीटू अंशांकन मिश्रण में एक का उपयोग करें. 9 BCECF और pHluorin माप दोनों के लिए. इस मिश्रण को कई झिल्लियों में पीएच ढ़ाल ढहने में सक्षम सेल permeant अमोनियम एसीटेट शामिल हैं, सोडियम azide और deoxyglucose एटीपी उत्पादन को रोकने और + पंप, और monensin और nigericin, ionophores खमीर स्रावी / VAC में पीएच ढ़ाल के पतन में फंसा एच बाधित करने के लिएuolar परिवहन क्रमशः 12 और mitochondrial भीतरी झिल्ली 13, रास्ते. यह हम vacuolar या साइटोसोलिक पीएच माप के लिए unlabeled कोशिकाओं के लिए एक पृष्ठभूमि मूल्य घटाना नहीं है कि ध्यान देने योग्य है. कोशिकाओं के कुछ आंतरिक autofluorescence क्या है, हम सीधे साथ और अंशांकन और प्रयोगात्मक नमूने पर पृष्ठभूमि सुधार के बिना पीएच माप की तुलना में है और अंतिम मूल्यों में कोई अंतर नहीं देखा है. पृष्ठभूमि घटाव steeper अंशांकन घटता में परिणाम होगा, और प्रतिदीप्ति संकेत शोर अनुपात करने के लिए कम और संकेत कर रहे हैं, जहां परिस्थितियों में एक समस्या बन जाता है वांछनीय हो सकता है. उदाहरण के लिए, एक कम कुल संकेत देता है जो एक Golgi / इंडोसोम स्थानीयकृत pHluorin 5 से मापने में, हम सब माप से पृष्ठभूमि संकेत घटाना था.
चित्रा 1. MeasurYEPD, पीएच 5. कोशिकाओं (SF838-5Aα) जंगली प्रकार में उगाई जंगली प्रकार की कोशिकाओं में vacuolar पीएच प्रतिक्रियाओं के ement मापा दिखाने के रूप में ऊपर वर्णित BCECF-AM. ए अंशांकन वक्र के साथ incubated तो मध्य लॉग चरण के लिए और बड़ा हो गया विभिन्न पीएच पर 450 एनएम (I450) (दोनों 535 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में मापा) में उत्तेजना से तीव्रता के लिए 490 एनएम (I490) में उत्तेजना से प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात. एक रेखीय ट्रेंडलाइन दिखाया गया है. एक संक्षिप्त ग्लूकोज अभाव ही, लेबल सेल निलंबन (कोई ग्लूकोज) के एक हिस्से में मापा गया था बी vacuolar पीएच के बाद. ग्लूकोज तो 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है और प्रतिदीप्ति अनुपात 5 मिनट (5 '+ ग्लूकोज) के बाद मापा गया था. 50 मिमी KCl तो जोड़ा गया था और प्रतिदीप्ति अनुपात 3 मिनट के बाद मापा और पीएच (3 '+ KCl) को परिवर्तित कर दिया गया.
चित्रा 2. CYT की काइनेटिक्सजंगली प्रकार की कोशिकाओं में ग्लूकोज के अलावा. जंगली प्रकार की कोशिकाओं को osolic पीएच प्रतिक्रिया phosphoglycerate kinase (PGK) प्रमोटर और ऊपर वर्णित के रूप में हो transformants की नियंत्रण में खमीर pHluorin के साथ बदल रहे थे. ए अंशांकन वक्र 405 पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का मापा अनुपात दिखा 485 एनएम (I485) बनाम पीएच कम तीव्रता. बी साइटोसोलिक पीएच को एनएम (I405) हर 6 सेकंड लिया प्रतिदीप्ति तीव्रता माप से निकाली थी. 6 मिनट से अधिक. ग्लूकोज (50 मिमी अंतिम) संकेत समय पर क्युवेट में कोशिकाओं को जोड़ा गया है.
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Discussion
हम पीएच homeostasis के पहलुओं की संख्या पता करने के लिए इन प्रोटोकॉल का उपयोग किया है. उदाहरण के लिए, हम 4,5 जंगली प्रकार और वि ATPase की कमी उत्परिवर्ती कोशिकाओं की साइटोसोलिक और पीएच प्रतिक्रियाओं की तुलना में है. हम भी ग्लूकोज 3 से vacuolar पीएच प्रतिक्रिया पर बदल विकास की स्थिति, विशेष रूप से बाह्य पीएच, के प्रभाव की जांच की है. महत्वपूर्ण बात है, हम निरीक्षण प्रतिक्रियाओं दोनों मात्रात्मक पीएच माप के अन्य तरीकों के साथ और प्रोटॉन पंप की बदल गतिविधियों का वर्णन जैव रासायनिक डेटा के साथ संगत कर रहे हैं.
विवो पीएच माप के प्रकार के दो सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं का वर्णन यहाँ की fluorophore स्थानीयकरण और संकेत के स्तर पर हैं, इन दोनों में से किसी के साथ समस्याओं विशिष्ट अनुप्रयोग या उत्परिवर्ती के लिए विधि के संशोधन की आवश्यकता है. BCECF की vacuolar स्थानीयकरण 6 कुछ हद तक आकस्मिक है, लेकिन अलग म्यूटेंट की एक संख्या में संरक्षित है, सहितvacuolar हाइड्रोलिसिस के स्तर को कम कर दिया है जो VMA म्यूटेंट 4,. खमीर रिक्तिकाएं Nomarski प्रकाशिकी के तहत माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से कल्पना कर रहे हैं, और हम प्रत्येक तनाव के लिए डाई की vacuolar स्थानीयकरण की पुष्टि करें. pHluorin विशेष रूप से शारीरिक पीएच रेंज (2A चित्रा) की सबसे अधिक अपनी जवाबदेही को देखते हुए एक पीएच संवेदक के रूप में अधिक बहुमुखी है. यह अन्य को लक्षित जानकारी का अभाव है क्योंकि हम इस्तेमाल किया है कि खमीर pHluorin मुमकिन है, विशेष रूप से साइटोसोलिक प्रतीत होता है. हालांकि, pHluorin उचित टोपोलॉजी देने के लिए halorhodopsin से झिल्ली क्षेत्रों में से एक अतिरिक्त प्रविष्टि (; 14 पीएच Gef1) के साथ Golgi क्लोराइड ट्रांसपोर्टर Gef1 से दृश्यों के साथ टैगिंग द्वारा Golgi उपकरण को निशाना बनाया गया है. Orij एट अल. सफलतापूर्वक चयापचय 15 से मितोचोन्द्रिअल पीएच परिवर्तन मितोचोन्द्रिअल मैट्रिक्स को pHluorin निशाना बनाया और मापा है. इन परिणामों से अच्छी तरह से डिजाइन संलयन प्रोटीन यह possib बना सकता हैले कई organelles में पीएच प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए. vacuolar BCECF के शोर के स्तर को संकेत हम जांच की है कि खमीर उपभेदों के अधिकांश में काफी अधिक है. व्यक्त pHluorin प्रोटीन से संकेत pHluorin अभिव्यक्ति ड्राइविंग प्रमोटर के माध्यम से चालाकी से किया जा सकता है. मूल साइटोसोलिक pHluorin निर्माण में 9, अभिव्यक्ति एक गर्मी झटका तत्व युक्त प्रमोटर द्वारा संचालित और बहुत अधिक नहीं था. हालांकि, PGK प्रमोटर, TEF1 प्रमोटर, और actin के प्रमोटर से बाद में अभिव्यक्ति निर्माणों अभिव्यक्ति 3,15,16 के उच्च स्तर देने के लिए दिखाई देते हैं. Golgi विशेष pHluorin पीएच Gef1 एक inducible प्रमोटर 14 से व्यक्त किया है. अभिव्यक्ति की क्षणिक प्रेरण निरंतर उच्च स्तर अभिव्यक्ति डिब्बे पीएच में mislocalization या भी perturbations, अन्य प्रोटीन की धीमी गति से विकास या mislocalization के माध्यम से प्रकट pHluorin लिए ले जा सकता है, जहां स्रावी और endocytic रास्ते के छोटे डिब्बों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है.
<पी वर्ग = "jove_content"> fluorophores की विशेषताओं के अलावा, यह विवो पीएच माप में खमीर कोशिकाओं को खुद के विकास और चयापचय की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं कि पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस संवेदनशीलता physiologically प्रासंगिक और संभावित दिलचस्प है, लेकिन यह भी माप के बीच परिवर्तनशीलता का एक स्रोत हो सकता है. हम मध्य लघुगणक चरण के लिए जल्दी आम तौर पर, एक ही विकास के चरण में खमीर कोशिकाओं से माप तुलना करने के लिए ध्यान रखना. Vacuolar पीएच प्रतिक्रियाओं कोशिकी पीएच 3 के प्रति संवेदनशील हो सकता है, हम विशेष रूप से unbuffered माध्यम में विकसित कोशिकाओं के लिए, मध्यम विकास के पीएच की निगरानी. यह कई अलग अलग विकास मीडिया ratiometric पीएच माप के साथ संगत कर रहे हैं कि स्पष्ट है, वहीं मध्यम संरचना में अंतर निश्चित रूप से पीएच 17 को प्रभावित कर सकते हैं. कोशिकाओं काटा और माप के लिए तैयार हो जाने के बाद इसके अलावा, हम लंबे समय तक ग्लूकोज अभाव (घंटे) प्रारंभिक CYT कम हो जाती है कि न केवल मिल गया हैosolic पीएच और प्रारंभिक vacuolar पीएच बढ़ जाती है, लेकिन यह भी काफी ग्लूकोज के लिए प्रतिक्रियाओं धीमा कर देती है. इसलिए, हम आम तौर पर 30 मिनट के भीतर प्रयोगों आरंभ. ग्लूकोज अभाव शुरुआत की या कम.ऐसे quinacrine और acridine नारंगी के रूप में फ्लोरोसेंट lysosomotropic amines, का संचय खमीर कोशिकाओं में रहने वाले डिब्बे अम्लीकरण का आकलन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. इन तरीकों में तेजी से और सरल हैं, लेकिन पीएच के ratiometric माप की तुलना में बहुत अधिक गुणात्मक रूप में माना जाना चाहिए. सामान्य तौर पर, इस तरह के quinacrine तेज तरीके के रूप में यह एक अम्लीय डिब्बे में protonated है और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप 18 के तहत कल्पना की जा सकती है जब फँस हो जाते हैं जो की fluorophore बुनियादी रूप से झिल्ली पारगम्यता, पर भरोसा करते हैं. डाई के संचय झिल्ली भर में पीएच ढाल के अनुसार विभाजन पर निर्भर करता है, तो अम्लीय organelles में तेज organelle या acidificati के दोनों alkalinization से कमजोर किया जा सकता हैसाइटोसॉल की पर. इन विधियों उपयोगी रहेगा, लेकिन शायद अम्लीकरण के एक रिश्तेदार स्तर प्रदान करने के रूप में व्याख्या की जानी चाहिए.
खमीर में ratiometric फ्लोरोसेंट पीएच माप के आवेदन का विस्तार जारी है. ब्रेट एट अल. हाल ही में 4500 से अधिक गैर जरूरी खमीर विलोपन म्यूटेंट के संग्रह में vacuolar पीएच मापा और पीएच विनियमन 17 के उपन्यास तंत्र के एक नंबर खुला. BCECF और pHluorin 19,20 भी नए वि ATPase अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए प्रारूप छँटाई एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल करने के लिए अनुकूलित किया गया है. DECHANT एट अल. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में 11 का इस्तेमाल किया microfluidics ग्लूकोज अभाव और readdition की कई चक्र के माध्यम से एक साथ वि ATPase विधानसभा और साइटोसोलिक पीएच की निगरानी के लिए. इन परिणामों खमीर में पीएच की ratiometric माप पर्याप्त मजबूत है और प्रयोगों के कई प्रकार में लागू किया जाएगा बहुमुखी हैं कि सुझाव.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.
Acknowledgments
इस काम के प्रधानमंत्री केन को एनआईएच R01 GM50322 द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों हमारी प्रयोगशाला के लिए इन प्रोटोकॉल बाहर काम करने के लिए डॉ. Rajini राव, खमीर pHluorin प्लास्मिडों उपलब्ध कराने के लिए और ratiometric पीएच माप पर सलाह के लिए जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय, और डॉ. ग्लोरिया ए मार्टिनेज मुनोज़ धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
