Summary
PH vacuolare e di citosolica può essere misurata in lieviti vivi (
Abstract
Vacuolare e di pH citosolica sono altamente regolamentati in cellule di lievito e di occupano un ruolo centrale nella complessiva omeostasi pH. Noi descriviamo i protocolli per la la misurazione raziometrica di del pH in vivo usando di pH-sensibili fluorofori localizzate al il vacuolo o di citosol. PH vacuolar viene misurata usando BCECF, che localizza al la vacuolo in lievito quando introdotto in cellule nella sua forma estere acetossimetil. PH citosolico è misurata con un GFP pH-sensibile al espressa sotto controllo di un promotore lievito, lievito pHluorin. Metodi di misura della rapporti di fluorescenza in sospensioni cellulari lievito negli una fluorimetro sono descritte. Attraverso questi protocolli, le misurazioni singole punto di tempo di pH in condizioni diversi o in differenti mutanti di lievito sono stati confrontati e di le variazioni di pH nel corso del tempo sono stati monitorati. Questi metodi sono stati anche adattati a una formato di lettore di piastre di fluorescenza per gli esperimenti di ad alta-di throughput. Vantaggi di misure di pH raziometrici oltre altri apsono anche descritti procci attualmente in uso, i potenziali problemi sperimentali e soluzioni, e le prospettive per uso futuro di queste tecniche.
Introduction
pH omeostasi è un processo dinamico e di altamente regolato in tutti gli organismi 1,2. Processi biochimici sono strettamente regolati da pH, e di ambienti di intracellulari sono sintonizzati ai range di di pH strette per consentire attività ottimale delle le enzimi residenti. Tuttavia, intracellulare pH omeostasi può essere contestata da rapidi cambiamenti in pH ambientale, turni di metabolici, e di alcuni vie di segnalazione. In aggiunta, pH intracellulare può servire di per sé come un segnale importante. Infine, molti organelli mantengono valori pH lumenal che sono distinti dal citosol circostante e essenziale per le funzioni organello-specifici.
Le lieviti Saccharomyces condivide cerevisiae un certo numero di meccanismi omeostasi pH con con eucarioti superiori 2. In gli organelli acide del il pathway endocitica / lisosomiale, pH è controllato in primo luogo dalla altamente conservata vacuolare protone-translocating ATPasi (V-ATPasi), agendo in tandem con molti scamgers dipendenti dal gradiente di di pH. Tutte le cellule eucariotiche hanno anche meccanismi di esportazione protonica. In funghi e piante, un secondo, pompa di protonica distinto a livello della membrana plasmatica, Pma1, le esportazioni protoni metaboliche e si crede di essere il maggiore fattore determinante di pH citosolica e di potenziale di membrana plasmatica. La flessibilità genetica di S. cerevisiae e la sua importanza commerciale, hanno reso esso un modello molto interessante e importante per lo studio pH l'omeostasi 2.
In Oltre ad essere i driver di primari di organello acidificazione, V-ATPasi di sono altamente regolamentati enzimi di e la il nostro laboratorio di è interessato a meccanismi di regolazione V-ATPasi la comprensione. Verso questo obiettivo, abbiamo sono state utilizzando in misure di pH in vivo di pH vacuolare e di citosolica: 1) a monitorare le risposte al mutevoli condizioni extracellulari, come ad esempio deprivazione glucosio e readdition, 2) ai esaminare gli effetti di mutazioni che compromesso di attività V-ATPasi, e di 3) per esplorare la coordinamento di degli organelli e di al plasma a membrana pompe protoniche 3-5. Questi esperimenti divennero possibile solo attraverso lo sviluppo di solidi indicatori di pH raziometrici suscettibili di utilizzare in cellule di lievito. . Pianta et al primo luogo ha mostrato che BCECF (2'7'-Bis-(2-carbossietil) -5 - (e 6)-carbossifluoresceina), che è stato usato ampiamente per misurare il pH citosolico in cellule di di mammifero, accumula nel vacuolo lievito anziché il citosol 6. Questa differenza nella BCECF localizzazione è stata attribuita ad le molte enzimi idrolitici in il vacuolo, che sono probabilmente responsabile per il clivaggio dell'estere metilico acetossi da BCECF-AM (estere acetossimetil di BCECF) e ritenzione vacuolare 6. Ali et al. 7 ulteriormente sviluppato di misura del pH vacuolare usando BCECF e adattati queste misurazioni per un formato di lettore di piastre di fluorescenza. Brett et al. Introdotta lievito pHluorin come un mezzo di misurare pH citosolico in lievito da esprimendo un r plasmide-borneatiometric GFP pH-sensibile al 8 sotto controllo di un lievito-specifico promotore 9.
La spettri di eccitazione di entrambi BCECF e di lievito pHluorin sono sensibili ai pH, in modo da essi sono utilizzati come indicatori di pH raziometrici in cui il rapporto di di fluorescenza presso due lunghezze d'onda di eccitazione, misurati ad una singola lunghezza d'onda di emissioni, fornisce una misura di pH 8,10. Questi sensori di pH vacuolari e di citosolica di lievito sono stati utilizzati per entrambe le misurazioni a cella singola e di basato sulla popolazione. Misurazioni monocellulari 6,11 sono eseguite da microscopia a fluorescenza e analisi di immagine. Fluorescenza vacuolar o citosolico presso i due lunghezze d'onda è misurato per ogni cella. Le misurazioni basati sulla popolazione vengono eseguite sia in un lettore di micropiastra con adeguate capacità di fluorescenza o in un fluorimetro. Noi abbiamo generalmente fatto i nostri misurazioni di in un fluorimetro, perché fornisce un facile accesso per aggiunta di componenti di come ad esempio glucosio durante condizionatamisurazioni di cinetiche continuo. I nostri protocolli di di laboratorio attuali per la misurazione di del pH vacuolare e di citosolica sono elencati di qui di seguito; entrambi sono anche facilmente adattati a saggi di per micropiastre.
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Protocol
1. Misurazione del pH vacuolare In Vivo Uso di BCECF-AM
- Grow un 50 ml coltura liquida del il ceppo di lievito per essere misurato in il supporto desiderato durante la notte. L'obiettivo è di avere le cellule in di fase mid-log (OD600 (densità ottica a 600 nm) la misurazione di approssimativamente 0,8 per la sospensione).
- A pellet le cellule di lievito per centrifugazione. Risospendere il pellet in 0,6 ml del terreno crescita e trasferimento ad un provetta microcentrifuga che è stato pesato precedenza. A pellet le cellule di nuovo in un microcentrifuga a 2.000 xg per 60 sec. Rimuovere il surnatante il più completamente possibile e poi pesare il pellet di cellule. Risospendere il pellet ad una densità finale di 0,5 g / ml (w / v); una cultura di questo volume vi darà un pellet di cellule di approssimativamente 200 mg, e la 200 microlitri di buffer di sarebbe aggiunto alla dare un volume finale di 400 microlitri.
- Aggiungere BCECF-AM per la sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 50 mM da un 12 mM magazzino preparata in DMSO. Mescolare bene e poi incUbate le cellule a 30 ° C per 30 min. su una piattaforma dondolo o di tamburo rullo.
- Mentre le cellule sono incubando, preparare tamponi di calibrazione. Il buffer calibrazione contiene 50 mM MES (2 - (N-morfolino) acid etansolfonico), 50 mM HEPES (4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acid), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M acetato ammonio, 10 sodio azide mM, e di 10 mM 2-desossiglucosio, e corretta al fine il pH valori appropriati per il la vostra gamma di calibrazione con NaOH o HCl. (Attenzione: Sodio azide è altamente tossico e deve essere maneggiato con cura.) Per la misura di del pH in cellule di wild-type, ci saremmo preparare parecchi miscele di taratura a pH 5,5 a 6.5, ma per i mutanti attesi di avere una vacuolare pH più alcalino ( vma mutanti), ci saremmo preparare aggiuntivi, tamponi pH più elevati.
- Aliquotare 2 ml di tampone di di calibrazione per ogni del pH in 15 ml provette coniche, e di aggiungere monensin (15 mM magazzino) e di nigericina (2 mM magazzino) per dare concentrazioni finali di 110 mcM monensin e 15 mM Nigericina, respectively. Mescolare bene su un miscelatore vortex. (Attenzione: Sia la monensin e la nigericina sono tossici e di dovrebbero essere maneggiati con cura.)
- Quando il tempo di incubazione BCECF-AM è completato, pellet la sospensione cellulare mediante centrifugazione per 30 sec presso 2.000 xg in una microcentrifuga. Risospendere le cellule è di 1 ml di mezzo di crescita carente glucosio e centrifugare come sopra. Ripetere questa fase di lavaggio una volta, e quindi risospendere il pellet in 200 pl di mezzo di crescita senza di glucosio. Posto sul ghiaccio.
- Aggiungere 20 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta calibrazione pH preparato sopra. Incubare a 30 ° C per 30-60 min. su un tamburo rullo.
- Impostare il fluorimetro per misurare alternativamente presso di eccitazione lunghezze d'onda di 450 nm e 490 nM, entrambi i con una lunghezza d'onda di 535 nm emissione di. Impostare la temperatura camera del campione a 30 ° C. Eseguire tutte le misurazioni con agitazione continua della miscela, in il cuvetta.
- Aggiungere 1.96 ml su 1 mM MES (regolata a pH 5 o 7 seconda del pH delle crescita di medio delle cellule 'unand il disegno sperimentale). Aggiungere 20 l di sospensione cellulare nella cuvetta. Initiate misure di fluorescenza. Noi raccogliamo entrambi cinetica continuo e di dati tempo di punti d'ancoraggio in differenti esperimenti di. Per dati cinetici continui, prendiamo misurazioni ogni 6 sec per 5 min, quindi aggiungere glucosio per una concentrazione finale di glucosio di 50 mM, e continuare misurazione per 5-10 min. Per le misurazioni singoli di tempo-point, noi generalmente prendiamo misurazioni di presso 1 e di 5 min. dopo aggiunta delle cellule ai della cuvetta, aggiungere glucosio come nelle le misure cinetiche, e poi prendere un'altra misurazione 5 min. dopo addizione glucosio. Queste aggiunte possono essere variate, e componenti addizionali (inibitori, etc) possono anche essere aggiunte.
- Dopo le misure sperimentali sono completi, togliere le provette di calibrazione da 30 ° C incubazione e trasferire l'intero volume 2 ml per ciascun alla cuvetta fluorimetro. Misurare fluorescenza presso le stesse impostazioni (cfr. 1.8) ogni 5 s sopra un totale di 30 sec per ogni campione.
- Esportare dati di fluorescenza a Microsoft Excel. (Per il nostro fluorimetro, questo richiede l'esportazione dei dati come testo in forma delimitato da tabulazioni e l'importazione in Excel.) Procurarsi una curva di calibrazione da parte il calcolo del rapporto di di fluorescenza a 490 nm a 450 nm per ciascun miscela di calibrazione. Il rapporto di fluorescenza viene poi tracciata vs pH per ottenere una curva di calibrazione.
- Convertire i dati sperimentali ai rapporto di fluorescenza e calcolare pH usando la curva standard. PH vacuolar può allora tramato contro tempo (cinetica di modifiche del pH) né confrontato sotto varie condizioni (figura 1) o in differenti ceppi mutanti.
2. Misurazione del pH citosolico In Vivo Uso di Lievito pHluorin
- Trasforma il ceppo di lievito desiderato con il pHluorin lievito plasmide da parte protocolli standard, e selezionare per la trasformanti su completati minima quantità di terreno uracile carente (SC-uracile).
- Grow un 50 ml coltura liquida delle cellule trasformate in SC-uracile a di fase mid-log (OD
- Preparare gli standard di calibrazione come descritto per il pH vacuolare, ma buffer di ad una gamma di pH appropriato per misure di pH citosolici, generalmente di pH 6-8. Aliquotare 2 ml di tampone di calibrazione regolata alla pH desiderato in parecchie provette coniche 15 ml. Aggiungi monensin e di nigericina come descritto sopra (1.4) e mescolare bene.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione come descritto sopra, e risospendere il pellet in 600 microlitri della mezzo di crescita. Trasferire in un provetta da microcentrifuga pesato, e le cellule pellet per centrifugazione a 5.000 rpm per 30 sec. Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di crescita senza il glucosio (SC-uracile,-glucosio), le cellule a pellet di nuovo e ripetere. Dopo che il centrifugazione finale, rimuovere il surnatante come a fondo il più possibile e pesare il pellet di cellule. Risospendere celle a una densità finale di 0,5 g / ml in SC-uracile con nessuna glucosio.
- Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare a ciascuna provetta di tampone di calibrazione e di mescolare bene su un miscelatore vortex. Incubare a 30 ° C su un rotore tamburo di filatura per 60 min.
- Impostare up il fluorimetro per la eccitazione a lunghezze d'onda 405 e 485 nm e di un lunghezza d'onda di 508 nm emissione di. Procedere con punto di singola volta o di misurazioni di cinetiche e la aggiunta di glucosio come descritto sopra per la misurazione BCECF.
- Misurare fluorescenza dei campioni di taratura, e costruire una curva di calibrazione da per BCECF (cfr. 1,10-1,11). Un appezzamento di rapporto di di fluorescenza vs del pH è lineare sopra la gamma di la maggior parte delle misure di pH citosoliche (pH 6.0-8.0) 9, in modo sperimentali le misure del rapporto di fluorescenza sono facilmente convertiti a pH.
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Representative Results
La Figura 1 presenta i dati di pH vacuolari ottenuti su cellule di lievito wild-type coltivate in ricco di medie (di lievito estratto di-peptone-destrano; YEPD) memorizzati nel buffer pH 5 con 50 mM MES. Abbiamo Spesso cresciamo le cellule in mezzo tamponato perché il pH del mezzo può cambiare abbastanza drammaticamente durante la crescita durante la notte, particolarmente per terreno minimo, e abbiamo trovato che il pH del mezzo di crescita può influenzare risposte di pH vacuolari 3. Tuttavia, è inoltre accettabile per molte esperimenti per crescere le cellule in terreno senza buffer. La Figura 1A mostra una curva di calibrazione per cellule incubate con BCECF-AM dal protocollo qui sopra. Anche se il rapporto tra rapporto BCECF fluorescenza e pH vacuolare è non-lineare sopra una gamma di pH più larga 7, è quasi lineare nell'intervallo pertinente per queste misurazioni sperimentali, ed un trendline lineare viene visualizzato ed utilizzato per calcolare valori di pH per l'esperimento. Variazioni di pH vacuolare che derivi dalla glOltre ucose alle celle glucosio-indigenti sono mostrati in Figura 1B. Vacuolare aumenti di pH durante BCECF-AM all'etichettatura, in quanto cellule sono il glucosio privi, ma diminuisce dopo readdition di glucosio, presumibilmente come risultato di attivazione V-ATPasi attraverso riassemblaggio 3,4. Un leggero aumento dei pH vacuolare di si osserva upon aggiunta di 50 mM KCl, a tre minuti dopo l'glucosio addizione. In uno studio più ampio, abbiamo in genere corriamo almeno tre esperimenti indipendenti (biologici si replica) e mostriamo la pH media ± a SE per ogni condizione di 3-5.
La cinetica di citosolico cambiamento di pH con aggiunta glucosio sono mostrati in Figura 2. Per questo esperimento, cellule di lievito wild-type sono state coltivate in terreno completo sintetico carente uracile (SC-uracile), tamponata in pH 5 con 50 mM MES. Questo mezzo è adatte alla manutenzione del plasmide pHluorin lievito contenente sotto controllo del fosfoglicerato chinasi (PGK) promotore,la quale abbiamo utilizzato di recente 3,5; altri plasmidi possono richiedere diversi select condizioni di. Il curva di calibrazione (Figura 2A) mostra che la risposta raziometrica del pHluorin per pH è lineare in una vasta gamma di di pH; generalmente coprano qualsiasi fisiologicamente rilevante pH citosolico. La risposta delle cellule wild-type indicate qui è molto caratteristico; vi è un diminuzione immediato in pH seguito da un aumento a pH 7.2-7.4.
Noi costruiamo curve di calibrazione per ogni ceppo e in ogni esperimento. Noi usiamo un in miscela di calibrazione situ descritto da Brett et al. 9 per la sia per BCECF e di misurazioni di pHluorin. Questa miscela include di acetato di di ammonio cella di-permeante capace di collassare gradienti di di pH attraverso più le membrane, di sodio azide e di desossiglucosio di fermare la produzione ATP e inibiscono la H +-pompe, e le di monensina e di nigericina, gli ionofori implicato in crollo di gradienti di di pH nel il lievito di birra secretoria / vactrasporti uolar pathways 12 e mitocondriali membrana interna 13, rispettivamente. Vale la pena notare che noi non sottraiamo un valore di di sfondo per celle di senza etichetta per le misure di pH vacuolari o di citosolico. Anche se le celle di che fare avere un qualche autofluorescenza intrinseco, noi abbiamo confrontato direttamente misure di pH con e senza correzione del fondo sulla il di calibrazione e la campioni sperimentali e di abbiamo veduto alcuna differenza nei i valori finali. Sottrazione dello sfondo si tradurrà in curve di calibrazione più ripidi, e può essere auspicabile in condizioni dove le segnali di fluorescenza sono bassi e rapporto segnale-rumore diventa un problema. Per esempio, in misurando da una Golgi / endosome-localizzata pHluorin 5, che dia un segnale complessivo inferiore, noi facevamo sottrarre il segnale sfondo da tutte le misurazioni.
Figura 1. Measurement di vacuolari risposte di di pH nei cellule di wild-type coltivate in YEPD, pH 5. Wild-di tipo (SF838-5Aα), le cellule sono state coltivate a di fase mid-log e poi incubate con BCECF-AM come descritto sopra. A. Curva di calibrazione che mostra misurato rapporto dei intensità di fluorescenza da eccitazione a 490 nm (I490) a intensità provenienti eccitazione a 450 nm (I450) (entrambe misurata ad un lunghezza d'onda di 535 nm emissione) presso variegata pH. È mostrato Una linea di tendenza lineare. B. Vacuolar pH dopo una breve deprivazione glucosio stata misurata in una porzione del della stessa, sospensione di cella etichettata (nessuna glucosio). Glucosio veniva poi aggiunto a una concentrazione finale di 50 mM e di rapporto di fluorescenza è stata misurata dopo il 5 min (5 '+ glucosio). 50 mM KCl stato poi aggiunto e rapporto di fluorescenza è stata misurata dopo 3 min e convertita a pH (3 '+ KCl).
Figura 2. Cinetica di cytrisposta pH osolic all'addizione glucosio nelle cellule wild-type. cellule Wild-di tipo sono state trasformate con lievito pHluorin sotto controllo del chinasi fosfoglicerato (PGK) promotore e trasformanti coltivate come descritto sopra. A. Curva Calibration mostrando rapporto misurato di intensità di fluorescenza a 405 nm (I405) a intensità presso 485 nm (I485) vs di pH. B. Cytosolic pH è stato derivato da misure di intensità di fluorescenza scattate ogni 6 sec. sopra 6 min. Glucosio (50 mM finale) stato aggiunto al alle cellule nella cuvette all'ora indicata.
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Discussion
Noi abbiamo utilizzato questi protocolli per affrontare un certo numero di gli aspetti della pH omeostasi. Ad esempio, noi abbiamo confrontato le risposte citosoliche e di pH di cellule mutanti wild-type e V-ATPasi-carente 4,5. Abbiamo inoltre esaminato gli effetti delle condizioni di crescita alterati, di pH particolarmente extracellulare, sulla risposta del pH vacuolare al glucosio 3. È importante sottolineare che, le risposte che osserviamo sono entrambi coerenti con altri metodi di misurazione del pH quantitativa e con i dati di biochimici che descrivono le attività alterati di le pompe protoniche.
Le due più importanti caratteristiche della tipo di in misurazioni del pH in vivo qui sono descritti sono localizzazione del fluoroforo e il livello di di segnale; problemi sia con di questi richiedono modifica del metodo per la specifica applicazione o mutante. La localizzazione vacuolar di BCECF è in qualche fortuita 6, ma è conservato in una certo numero di differenti mutanti, compresa ilvma mutanti 4, che hanno ridotto livelli di idrolasi vacuolari. Vacuoli di lievito sono prontamente, visualizzabili al microscopio sotto Nomarski l'ottica, e ci siamo confermano la localizzazione vacuolare del colorante per ogni ceppo. pHluorin è più versatile come un sensore di pH, particolare considerata la sua responsività su gran parte del range fisiologico pH (Figura 2A). Il pHluorin lievito che abbiamo usato appare essere esclusivamente citosolico, presumibilmente perché manca di di altre informazioni di targeting. Tuttavia, pHluorin è stata mirato al l'apparato Golgi by tagging con le sequenze dalla Golgi cloruro transporter GEF1, insieme con an inserzione aggiuntiva di segmenti di membrana da halorhodopsin che invia topologia corretta (pH-GEF1; 14). Orij et al. Hanno preso di mira con successo pHluorin alla matrice mitocondriale e la misurato variazioni di pH mitocondriali con il metabolismo 15. Questi risultati suggeriscono che proteine di fusione progettate correttamente possono rendere esso possibLe per monitorare le risposte di pH in molti organelli. Il segnale al livello di rumorosità di vacuolar BCECF è piuttosto elevato nella maggior parte delle ceppi di lievito che abbiamo esaminato. Segnale dalla le proteine pHluorin espresse può essere manipolato tramite il promotore di guida espressione pHluorin. Nel l'originale citosolica pHluorin costrutto di 9, espressione è stata trainata da uno shock di calore elemento di-contenente promotore e non era molto alto. Tuttavia, più tardi costrutti di espressione provenienti da il promotore PGK, TEF1 promotore, e promotore actina appaiono per dare livelli più elevati di espressione 3,15,16. Il Golgi-specifico pHluorin pH-GEF1 è espressa da un promotore inducibile 14. Induzione Transient di espressione può essere particolarmente utile per più piccoli compartimenti della le secretori e di endocitico percorsi di, dove espressione sostenuta ad alto livello potrebbe portare a pHluorin mislocalization o di addirittura perturbazioni in pH scompartimento, si manifestano attraverso la crescita lenta o mislocalization di altre proteine.
<class p = "jove_content"> Oltre alla le caratteristiche dei fluorofori, essa è importante riconoscere che in misurazioni del pH in vivo sono sensibili alla crescita e condizioni metaboliche delle le cellule di lievito stesse. Questa sensibilità è fisiologicamente pertinente e potenzialmente interessante, ma può anche essere una fonte di variabilità tra le misurazioni. Ci prendiamo cura per confrontare i misurazioni di provenienti da cellule di lievito nella stessa fase di crescita, di solito inizio e la metà di fase logaritmica. A causa risposte di di pH vacuolari possono essere sensibili a pH extracellulare 3, monitoriamo pH del mezzo di crescita, in particolare per i cellule coltivate in di medie senza buffer. Mentre è chiaro che molte mezzi di crescita differenti sono compatibili con misurazione pH raziometrica, differenze nella composizione gamma medio possono definitivamente impatto del pH 17. In aggiunta, dopo che le cellule sono raccolte e preparate per la misura, abbiamo trovato che deprivazione il glucosio prolungata (orario) diminuisce non solo l'iniziale cytpH osolic e aumenta il pH vacuolare iniziale, ma anche rallenta significativamente risposte a glucosio. Pertanto, abbiamo generalmente Avviamo esperimenti di all'interno di 30 min. o meno e cominciare l'deprivazione glucosio.L'accumulo di ammine lysosomotropic fluorescenti, come ad esempio quinacrina e di arancio di acridina, è stata usata estesamente per valutare la l'acidificazione compartimento in cellule di lievito viventi. Questi metodi sono una rapida e semplici, ma dovrebbero essere considerate come molto di più qualitativa che misurazioni di raziometrici di pH. In generale, metodi quali uptake quinacrine affidano già a membrana permeabilità della forma base del fluoroforo, che diventano intrappolò quando viene protonato in un vano acida e può essere visualizzò sotto un microscopio fluorescenza 18. Accumulo del colorante si affida sul partizionamento secondo l'gradiente di pH attraverso la membrana, così assorbito all'interno dei organuli acide può essere indebolita da ciascuna alcalinizzazione delle organelle o di acidificatisulla del citosol. Questi metodi rimarranno utile, ma dovrebbero probabilmente essere interpretato come fornendo un livello relativo di l'acidificazione.
Le applicazioni di raziometrici le misure di pH fluorescenti in lievito continuano ad espandersi. Brett et al. Di recente misurato pH vacuolare nella la collezione di oltre 4500 non essenziali mutanti di delezione di lievito e di scoperto un certo numero di nuovi meccanismi d'pH regolamentazione 17. BCECF e pHluorin 19,20 sono stati anche adattato a una cella fluorescenza-attivato classificare gli format a facilitare screening per nuovi inibitori V-ATPasi. 11 utilizzati microfluidica, in combinazione con microscopia a fluorescenza Dechant et al. Di monitorare V-ATPasi di assemblaggio e di del pH citosolica simultaneamente attraverso cicli multipli di deprivazione glucosio e di readdition. Questi risultati suggeriscono che le misurazioni raziometriche di pH urinario in lievito sono sufficientemente robuste e versatile da applicarsi in molti tipi di esperimenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 GM50322 a PM Kane. Gli autori ringraziano il Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University per la fornitura di le di lievito pHluorin plasmidi e di per un consiglio su misure di pH raziometriche, e di il Dr. Gloria A. Martinez Munoz per lavorare fuori questi protocolli per il nostro laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
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