Summary
Vacuolar og cytosolic pH kan måles i levende gjær (
Abstract
Vacuolar og cytosolic pH er sterkt regulert i gjærceller og okkupere en sentral rolle i den samlede pH homeostase. Vi beskriver protokoller for proporsjonal måling av pH in vivo ved hjelp av pH-sensitive fluorophores lokalisert til vakuole eller cytosol. Vacuolar pH er målt ved hjelp BCECF, som lokaliserer til vakuole i gjær når introdusert inn i celler i sin acetoksymetyl esterform. Cytosolic pH er målt med et pH-sensitive GFP uttrykt under kontroll av en gjær promoter, gjær pHluorin. Metoder for måling av fluorescens-forhold i gjærcelle-suspensjoner i et fluorimeter er beskrevet. Gjennom disse protokollene, enkeltdoser tidspunkt målinger av pH under forskjellige forhold eller i forskjellige gjær mutanter blitt sammenlignet og endringer i pH over tid har vært overvåket. Disse metoder har også blitt tilpasset til et fluorescens plateleser format for high-throughput eksperimenter. Fordeler med Ratiometrisk pH-målinger over andre apgangsmåter i bruk, potensielle eksperimentelle problemer og løsninger, og utsiktene for fremtidig bruk av disse teknikkene er også beskrevet.
Introduction
pH homeostase er en dynamisk og svært regulert prosess i alle organismer 1,2. Biokjemiske prosesser er strengt regulert av pH, og intracellulære miljøer er innstilt til smale pH områder for å tillate optimal aktivitet av de fastboende enzymer. Imidlertid kan intracellulær pH homeostase bli utfordret av raske endringer i miljø-pH, metabolske skift, og enkelte signalveier. I tillegg kan intracellulær pH i seg selv tjene som et viktig signal. Til slutt, mange organeller opprettholde lumenal pH-verdier som er forskjellig fra det omkringliggende cytosol og avgjørende for organeller-spesifikke funksjoner.
Gjær Saccharomyces cerevisiae aksjer en rekke pH homeostase mekanismer med høyere eukaryoter to. I de sure organeller i endocytic / lysosomale vei, er pH primært styrt av svært konservert vacuolar proton-translocating ATPase (V-ATPase), som opptrer i tandem med mange exchangers avhengig av pH-gradienten. Alle eukaryote celler har også proton eksport mekanismer. I sopp og planter, et sekund, distinkt proton pump på plasma membran, Pma1, eksport metabolske protoner og antas å være den viktigste determinant av cytosolic pH og plasma membran potensial. Den genetiske fleksibilitet S. cerevisiae og dens kommersielle betydning, har gjort det til en svært interessant og viktig modell for å studere pH homeostase to.
I tillegg til å være de viktigste driverne av organeller forsuring, er V-ATPaser sterkt regulert enzymer og vår lab er interessert i å forstå mekanismene for V-ATPase regulering. Mot dette målet, har vi brukt in vivo pH-målinger av vacuolar og cytosolic pH: 1) å overvåke svar til skiftende ekstracellulære forhold, for eksempel glukose savn og readdition, 2) å undersøke effekten av mutasjoner som kompromiss V-ATPase aktivitet, og 3) for å utforske coornering av organellesystemer og plasma membran protonpumpene 3-5. Disse eksperimentene bare ble mulig gjennom utvikling av robuste Ratiometrisk pH indikatorer mottagelig å bruke i gjærceller. . Plante et al først viste at BCECF (2'7'-bis-(2-karboksyetyl) -5 - (og 6)-karboksyfluorescein), som har blitt mye brukt for å måle cytosolisk pH i pattedyrceller, akkumuleres i gjær vakuole i stedet for den 6. cytosol. Denne forskjell i BCECF lokalisering er blitt tilskrevet de mange hydrolytiske enzymer i vakuole, som sannsynligvis er ansvarlig for spalting av acetoksy-metylester fra BCECF-AM (acetoksymetyl ester av BCECF) og vacuolar retensjon 6.. Ali et al. Syv videreutviklet vacuolar pH-måling med BCECF og tilpasset disse målingene til en fluorescens plateleser format. Brett et al. Innført gjær pHluorin som et middel for måling av cytosolisk pH i gjær ved å uttrykke et plasmid-borne ratiometric pH-sensitive GFP 8 under kontroll av en gjær-promoter ni.
Den eksitasjon spektra av begge BCECF og gjær pHluorin er følsomme for pH, slik at de brukes som Ratiometrisk pH-indikatorer hvor forholdet av fluorescens ved to eksitasjonsbølgelengdene, målt på en enkelt emisjonsbølgelengde, gir et mål på pH 8,10. Disse gjær vacuolar og cytosolic pH-sensorer har vært brukt til både encellede og populasjonsbasert målinger. Encellede målinger 6,11 er utført av fluorescens mikroskopi og bildeanalyse. Vacuolar eller cytosoliske fluorescens ved de to bølgelengder blir målt for hver celle. De befolkningsbaserte målinger er utført i enten en mikroplateleser med passende fluorescens evner eller i en fluorimeter. Vi har stort sett gjort våre målinger i en fluorimeter, fordi det gir enkel tilgang for tillegg av komponenter som glukose under conkontinuerlige kinetiske målinger. Vår nåværende lab protokoller for måling av vacuolar og cytosolic pH er listet nedenfor; begge er også lett tilpasses microplate analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Måling av vacuolar pH In Vivo hjelp BCECF-AM
- Driv en 50 ml væskekultur av gjærstammen som skal måles i det ønskede medium over natten. Målet er å ha celler i mid-log fase (OD600 (optisk tetthet på 600 nm) måling på ca 0,8 for suspensjon).
- Pellet gjærcellene ved sentrifugering. Resuspender pelleten i 0,6 ml vekstmedium og overføring til et mikrosentrifugerør som har blitt veiet tidligere. Pellet cellene igjen i en mikrosentrifuge ved 2000 xg i 60 sek. Supernatanten fjernes så fullstendig som mulig, og deretter veie cellepelleten. Resuspender pelleten til en endelig densitet på 0,5 g / ml (vekt / volum), en kultur av dette volum vil gi en cellepelleten på ca 200 mg, og 200 pl buffer ville bli tilsatt for å gi et endelig volum på 400 pl.
- Legg BCECF-AM til cellesuspensjonen til en endelig konsentrasjon på 50 mm fra en 12 mM stamløsning fremstilt i DMSO. Bland godt og deretter økesUbate cellene ved 30 ° C i 30 min. på en gyngende plattform eller rulle trommelen.
- Mens cellene ruger, forberede kalibrering buffere. Kalibreringen bufferen inneholder 50 mM MES (2 - (N-morfolino) etansulfonsyre), 50 mM HEPES (4 - (2-hydroksyetyl)-1-piperazin-etansulfonsyre), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M ammoniumacetat, 10 mM natrium-azid, og 10 mM 2-deoxyglucose, og er justert til pH-verdier som er egnet for måleområdet med NaOH eller HCl. (Advarsel: Natriumazid er svært giftig og må behandles med forsiktighet.) For måling av pH i vill type celler, vil vi forberede flere kalibrering blandinger ved pH 5.5 til 6.5, men for mutanter forventes å ha en mer basisk vacuolar pH ( VMA mutanter), ville vi lage flere, høyere pH-buffere.
- Delmengde 2 ml buffer kalibrering for hver pH-verdi inn i 15 ml koniske rør, og tilsett monensin (15 mM stamløsning) og nigericin (2 mM stamløsning) for å gi sluttkonsentrasjoner på 110 uM monensin og 15 uM nigericin, respectively. Bland godt på en vortex mixer. (Advarsel: Både monensin og nigericin er giftig og må behandles med forsiktighet.)
- Når den BCECF-AM inkubasjonstiden er fullført, pellet cellesuspensjonen ved sentrifugering i 30 sekunder ved 2000 xg i en mikrosentrifuge. Resuspender cellene er 1 ml vekstmedium mangler glukose og sentrifuge som ovenfor. Gjenta dette vasketrinn en gang, og deretter resuspender pelleten i 200 pl vekstmedium uten glukose. Legg på is.
- Tilsett 20 pl av cellesuspensjonen til hver pH-kalibrering rør fremstilt ovenfor. Inkuber ved 30 ° C i 30-60 min. på en berg trommelen.
- Sett fluorimeter å vekselvis måle på eksitasjonsbølgelengdene 450 nm og 490 nm, begge med et utslipp bølgelengde på 535 nm. Sett prøvekammeret temperaturen til 30 ° C. Utføre alle målinger med kontinuerlig omrøring av blandingen i kyvetten.
- Legg 1,96 ml 1 mM MES (justert til pH 5 eller 7, avhengig av pH på cellenes vekst medium ennd eksperimentell design). Tilsett 20 ul celle-suspensjon i kyvetten. Initiere fluorescens målinger. Vi samler både kontinuerlig kinetisk og tid-punkts data i ulike eksperimenter. For kontinuerlige kinetiske data, tar vi målinger hver 6 sek i 5 min, deretter legge glukose til en endelig glukose konsentrasjon på 50 mM, og fortsette måling for 5-10 min. For eneste gang-punktmålinger, vi vanligvis ta målinger på 1 og 5 min. etter tilsetning av celler til kuvetten, tilsett glukose som i de kinetiske målinger, og så ta en ny måling 5 min. etter glukose tillegg. Disse tilleggene kan varieres, og tilleggskomponenter (hemmere, etc) kan også legges til.
- Etter de eksperimentelle målingene er fullført, fjerner kalibrering rør fra 30 ° C inkubasjon og overføre hele 2 ml volum for hver til fluorimeter kyvetten. Måle fluorescens på de samme innstillingene (se 1.8) hver 5 sek over totalt 30 sek for hver prøve.
- Eksportere fluorescens data til Microsoft Excel. (For fluorimeter vår, krever dette eksport av data som tekst i tabulatordelt form og import til Excel.) Skaff en kalibrering kurve ved å beregne forholdet mellom fluorescens ved 490 nm til 450 nm for hver kalibrering blanding. Fluorescens-forholdet blir så plottet vs pH for å få en kalibreringskurve.
- Konvertere de eksperimentelle data til fluorescens ratio og beregne pH ved hjelp av standard kurve. Vacuolar pH kan deretter plottet mot tid (kinetikken for pH-endringer) eller sammenlignet under ulike betingelser (figur 1) eller i forskjellige mutante stammer.
2. Måling av cytosolisk pH In Vivo Bruke gjær pHluorin
- Transformere den ønskede gjærstamme med gjær pHluorin plasmid av standard protokoller, og velg for transformantene om supplert minimal medium mangler uracil (SC-uracil).
- Dyrk en 50 ml væske kultur av transformerte celler i SC-uracil til mid-log fase (OD
- Forbered kalibreringsstandarder som beskrevet for vacuolar pH, men med buffer til et pH-område som passer for cytosoliske pH-målinger, vanligvis pH 6-8. Delmengde 2 ml kalibrering buffer justert til den ønskede pH-verdi inn i flere 15 ml koniske rør. Legg monensin og nigericin som beskrevet ovenfor (1.4) og bland godt.
- Høste cellene ved sentrifugering som beskrevet ovenfor, og resuspender pelleten i 600 pl av vekstmediet. Overføring til en veid mikrosentrifugerør, og pellet-celler ved sentrifugering ved 5000 opm i 30 sek. Resuspender pellet i 1 ml vekstmedium uten glukose (SC-uracil-glukose), pellet-celler på nytt og gjentas. Etter den siste sentrifugering, fjern supernatanten så grundig som mulig og veie cellepelleten. Resuspender cellene til en endelig densitet på 0,5 g / ml i SC-uracil uten glukose.
- Tilsett 20 ul celle-suspensjon til hvert rør for kalibrering buffer og bland godt på en Vortex-blander. Inkuber ved 30 ° C på en roterende trommel rotor i 60 min.
- Sett opp fluorimeter for magnetisering ved bølgelengder 405 og 485 nm og en emisjon bølgelengde på 508 nm. Fortsett med ett tidspunkt eller kinetiske målinger og tilsetning av glukose som beskrevet ovenfor for BCECF måling.
- Måle fluorescens av kalibreringsprøvene, og konstruere en kalibrering kurve som for BCECF (se 01.10-01.11). Et plott av fluorescens-forhold g. pH er lineær i området av de cytosoliske pH-målinger (pH 6,0-8,0) 9, blir så eksperimentelle fluorescens ratio målingene lett omdannes til pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser vacuolar pH-data fremskaffet på vill-type gjær celler dyrket i rikt medium (gjærekstrakt-pepton dekstran YEPD) bufret til pH 5 med 50 mM MES. Vi ofte vokser cellene i bufret medium på grunn av pH i mediet kan endres ganske dramatisk under over natten vekst, spesielt for minimalt medium, og vi har funnet at pH i vekstmediet kan påvirke vacuolar pH responser 3. Imidlertid er det også akseptabelt for mange forsøk for å dyrke cellene i ikke-bufret medium. Figur 1A viser en kalibreringskurve for celler inkubert med BCECF-AM av protokollen ovenfor. Selv om forholdet mellom BCECF fluorescens-forhold og vacuolar pH er ikke-lineær over et bredere pH-område 7, er en nesten lineær i det relevante området for disse eksperimentelle målinger, og en lineær trendlinjene er vist, og brukes til å beregne pH-verdier for forsøket. Vacuolar pH-endringer som følge av glucose tillegg til glukose-belastede celler er vist i figur 1B. Vacuolar pH øker i BCECF-AM merking fordi cellene er glukose fratatt, men avtar etter glukose readdition, antakelig som et resultat av V-ATPase aktivering via reassembly 3,4. En svak økning i vacuolar pH er observert ved tilsetning av 50 mM KCl, tre minutter etter glukose tilsetningen. I en større undersøkelse, vi vanligvis kjøre minst tre uavhengige eksperimenter (biologisk replikater) og viser den gjennomsnittlige pH-verdi ± SE for hver betingelse 3-5.
Kinetikken av cytosolisk pH-endringen med glukose tillegg er vist i figur 2.. For dette forsøk ble villtype gjær-celler dyrket i syntetisk fullstendig medium som mangler uracil (SC-uracil), bufret til pH 5 med 50 mM MES. Dette mediet er passende for opprettholdelse av plasmidet inneholder gjær phluorin under kontroll av den phosphoglycerate kinase (PGK) promoter,som vi har brukt nylig 3,5, andre plasmider kan kreve ulike utvalgte forhold. Kalibreringskurven (figur 2A) viser at den støtter proporsjonal respons av pHluorin til pH er lineær over et vidt område av pH, vanligvis dekker en hvilken som helst fysiologisk relevant cytosolisk pH. Responsen av vill type celler som vises her er veldig karakteristisk, og det er en umiddelbar nedgang i pH etterfulgt av en økning til pH 7,2-7,4.
Vi konstruerer kalibreringskurver for hver stamme og i hvert eksperiment. Vi bruker en in situ kalibrering blanding beskrevet av Brett et al. 9 for både BCECF og pHluorin målinger. Denne blandingen inneholder celle-permeant ammonium acetat i stand til å kollapse pH-gradienter på tvers av flere membraner, til natriumazid og deoxyglucose stanse ATP produksjon og hemmer H +-pumper, og monensin og nigericin, ionophores innblandet i sammenbruddet av pH-gradienter i gjær sekretoriske / vacuolar transport trasé 12 og mitokondrielle indre membranen 13, hhv. Det er verdt å merke seg at vi ikke trekker en bakgrunn verdi for umerkede celler for de vacuolar eller cytosolic pH-målinger. Selv om cellene har noen egenverdi autofluorescence, har vi direkte sammenlignet pH-målinger med og uten bakgrunn korreksjon på kalibrering og eksperimentelle prøver og har ikke sett noen forskjell i de endelige verdiene. Bakgrunn subtraksjon vil resultere i brattere kalibreringskurver, og kan være ønskelig under forhold hvor fluorescens-signalene er lave og signal-støy-forholdet blir et problem. For eksempel ved måling fra en Golgi / endosome-lokaliserte pHluorin 5, som gir en lavere samlet signal, gjorde vi trekker bakgrunnen signal fra alle målingene.
Figur 1. Måleement av vacuolar pH-responser i villtype-celler dyrket i YEPD, 5 pH. Vill-type (SF838-5Aα)-celler ble dyrket til middels logaritmisk fase og deretter inkubert med BCECF-AM, som beskrevet ovenfor. A. kalibreringskurve som viser målt Forholdet mellom fluorescensintensiteten av eksitasjon ved 490 nm (I490) til intensitet fra eksitasjon ved 450 nm (I450) (begge målt ved en emisjonsbølgelengde på 535 nm) ved pH variert. En lineær trendlinjen er vist. B. vacuolar pH etter en kort glukose deprivasjon ble målt i en del av den samme, merket cellesuspensjon (uten glukose). Glukose ble deretter tilsatt til en final konsentrasjon på 50 mM og fluorescens-forhold ble målt etter 5 minutter (5 '+ glukose). 50 mM KCl, ble deretter tilsatt og fluorescens-forholdet ble målt etter 3 min og omdannet til pH (3 '+ KCl).
Figur 2. Kinetics av cytosolic pH respons overfor glukose i tillegg villtype-celler. villtype celler ble transformert med gjær pHluorin under kontroll av den phosphoglycerate kinase (PGK) promoter og transformanter dyrket som beskrevet ovenfor. A. Kalibrering kurve som viser forholdet mellom målte fluorescensintensiteten ved 405 nm (I405) til intensitet ved 485 nm (I485) vs pH. B. cytosolisk pH ble avledet fra fluorescensintensiteten målinger hver 6 sek. over 6 min. Glukose (50 mM sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til cellene i kyvetten ved den angitte tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har benyttet disse protokollene å ta opp en rekke aspekter ved pH homeostase. For eksempel har vi sammenlignet cytosolic og pH svar av vill type og V-ATPase-mangelfull muterte celler 4,5. Vi har også undersøkt effekten av endrede vekstvilkår, særlig ekstracellulær pH, på vacuolar pH respons på glukose tre. Viktigere, responsen man observerer er begge i overensstemmelse med andre metoder for kvantitativ måling av pH og med biokjemiske data som beskriver endrede aktiviteter av protonpumper.
De to viktigste trekk ved den type av in vivo pH-målingene beskrevet her, er lokaliseringen av fluoroforen og nivået av signalet, problemer med noen av disse krever modifikasjon av metoden for den spesifikke applikasjonen eller mutant. Den vacuolar lokalisering av BCECF er noe tilfeldig 6, men er bevart i en rekke forskjellige mutanter, herunderVMA mutanter 4, som har reduserte nivåer av vacuolar hydrolaser. Gjær vacuoles er lett visualiseres ved mikroskopi i henhold Nomarski optikk, og bekreft vi vacuolar lokalisering av fargestoff for hver stamme. pHluorin er mer allsidig som en pH-sensor, spesielt gitt sin respons over det meste av den fysiologiske pH-område (figur 2A). Gjæren pHluorin at vi har brukt ser ut til å være utelukkende cytosolic, antagelig fordi den mangler andre målretting informasjon. Imidlertid har pHluorin vært rettet til Golgi-apparatet ved merking med sekvenser fra Golgi-klorid transportør Gef1, sammen med en ekstra innsetting av membran segmenter fra halorhodopsin å gi riktig topologi (pH-Gef1, 14). Orij et al. Har blitt rettet pHluorin til mitokondriematrix og målt mitokondrielle pH-endringer med stoffskiftet 15. Disse resultatene tyder på at riktig utformet fusjonsproteiner kan gjøre det possible å overvåke pH svar på mange organeller. Signalet til støynivå på vacuolar BCECF er ganske høy i de fleste av de gjærstammer som vi har undersøkt. Signal fra uttrykt pHluorin proteiner kan manipuleres via arrangøren kjører pHluorin uttrykk. I den opprinnelige cytosolisk pHluorin konstruktet 9, ble ekspresjon drevet av en varmesjokk-element-inneholdende promoter og var ikke veldig høy. Men senere ekspresjonskonstruksjoner fra PGK promoter, TEF1 promoter, og aktin promoter synes å gi høyere nivåer av uttrykk 3,15,16. Golgi-spesifikke pHluorin pH-Gef1 er uttrykt fra en induserbar promoter 14. Forbigående induksjon av uttrykk kan være spesielt nyttig for mindre avdelinger av de sekretoriske og endocytic trasé, hvor vedvarende høyt nivå uttrykk kan føre til pHluorin mislocalization eller til og med forstyrrelser i kammer pH, manifestere seg gjennom langsom vekst eller mislocalization av andre proteiner.
<p klasse = "jove_content"> I tillegg til egenskapene til de fluoroforer, er det viktig å erkjenne at in vivo pH målingene er følsomme for vekst og metabolske tilstander i gjærcellene selv. Denne følsomheten er fysiologisk relevant og potensielt interessant, men kan også være en kilde til variabilitet mellom målinger. Vi tar vare å sammenligne målinger fra gjærceller i samme vekstfase, vanligvis tidlig til midten logaritmisk fase. Fordi vacuolar pH-responser kan være følsomme overfor ekstracellulær pH 3, vi overvåker pH i vekstmediet, spesielt for celler dyrket i bufret medium. Mens det er klart at mange forskjellige vekstmedia er kompatible med proporsjonal måling av pH, kan forskjeller i medium sammensetning definitivt påvirke pH 17.. I tillegg, etter at cellene er høstet og klargjort for måling, har vi funnet at langvarig glukose deprivasjon (timer) ikke bare reduserer den innledende cytosolic pH og øker den førstegangs vacuolar pH, men også i betydelig grad bremser respons på glukose. Derfor har vi generelt initiere eksperimenter innen 30 min. eller mindre av begynner glukose deprivasjon.Akkumulering av fluorescerende lysosomotropic aminer, for eksempel quinacrine og akridinoransje, har vært brukt mye for å vurdere kupé forsuring i levende gjærceller. Disse metodene er hurtig og enkel, men er å betrakte som mye mer enn kvalitativ Ratiometrisk målinger av pH. Generelt er metodene som quinacrine opptak avhengige av membranpermeabilitet av den grunnleggende form av fluorofor, som fanges når den er protonert i et surt kammer og kan visualiseres under et fluorescens-mikroskop 18.. Akkumulering av fargestoffet er avhengig partisjonering i henhold til pH-gradienten over membranen, slik at opptak i sure organeller kan svekkes ved enten alkalisering av organeller eller acidificatipå av cytosol. Disse metodene vil forbli nyttig, men bør nok tolkes som gir en relativ grad av forsuring.
Programmene av Ratiometrisk fluorescerende pH-målinger i gjær fortsette å ekspandere. Brett et al. Nylig målt vacuolar pH i samling av over 4500 ikke-essensielle gjær delesjonsmutanter og avdekket en rekke nye mekanismer for pH regulering 17. BCECF og pHluorin 19,20 er også tilpasset en fluorescens-aktivert celle sortering format for å forenkle screening for nye V-ATPase-hemmere. Dechant et al. 11 brukte MicroFluidics i kombinasjon med fluorescens mikroskopi å overvåke V-ATPase montering og cytosolic pH samtidig gjennom flere sykluser med glukose deprivasjon og readdition. Disse resultatene antyder at Ratiometrisk målinger av pH-verdien i gjær er tilstrekkelig robuste og allsidig som skal anvendes i mange typer eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM50322 til PM Kane. Forfatterne takker Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University for å gi gjær pHluorin plasmider og for råd om Ratiometrisk pH-målinger, og Dr. Gloria A. Martinez Munoz for å arbeide ut disse protokollene for vårt laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
