Summary
Vakuolär och cytosolisk pH kan mätas i aktiv jäst (
Abstract
Vakuolär och cytosolisk pH är starkt reglerad i jästceller och intar en central roll i den övergripande pH homeostas. Vi beskriver protokoll för ratiometrisk mätning av pH in vivo med hjälp av pH-känsliga fluoroforer lokaliserade till vakuolen eller cytosolen. Vakuolär pH mäts med BCECF, som lokaliserar till vakuolen i jäst när de införs i celler i sin acetoximetylester formulär. Cytosoliskt pH mäts med en pH-känslig GFP uttryckt under kontroll av en jästpromotor, jäst pHluorin. Metoder för mätning av fluorescens förhållanden i suspensioner jästcell i en fluorimeter beskrivs. Genom dessa protokoll har enstaka tidpunkt mätningar av pH under olika förhållanden eller i olika jästmutanter jämförts och förändringar i pH över tiden har övervakats. Dessa metoder har också anpassats till en fluorescens plattläsaren format för hög genomströmning experiment. Fördelar med ratiometrisk pH-mätningar över andra apinfallsvinklar för närvarande är i bruk, eventuella experimentella problem och lösningar, samt utsikterna för framtida användning av dessa tekniker beskrivs också.
Introduction
pH homeostas är en dynamisk och starkt reglerad process i alla organismer 1,2. Biokemiska processer är tätt regleras av pH, och intracellulära miljöer är inställda snäva pH-områden för att möjliggöra optimal aktivitet för de inhemska enzymer. Däremot kan intracellulära pH homeostas att utmanas av snabba förändringar i miljön pH, metabola förändringar, och vissa signalvägar. Dessutom kan intracellulära pH sig utgöra en viktig signal. Slutligen, många organeller upprätthålla lumenal pH-värden som skiljer sig från den omgivande cytosolen och avgörande för organell-specifika funktioner.
Jästsvampen Saccharomyces cerevisiae delar ett antal mekanismer pH homeostas med högre eukaryoter 2. I de sura organeller i endocytiska / lysosomala vägen är pH främst styrs av starkt konserverade vakuolär proton-translokerande ATPas (V-ATPas), agerar tillsammans med många valutakursgers beroende av pH-gradienten. Alla eukaryota celler har också mekanismer proton export. I svampar och växter, en sekund, distinkt protonpumpshämmare vid plasmamembranet, Pma1, export metaboliska protoner och tros vara den avgörande faktorn för cytosolic pH och plasmamembran potential. Den genetiska flexibilitet S. cerevisiae och dess kommersiella betydelse, har gjort det en mycket intressant och viktig modell för att studera pH homeostas 2.
Förutom att vara de primära drivkrafterna för organell försurning, är V-ATPases regleras mycket enzymer och vårt labb är intresserad av att förstå mekanismerna hos V-ATPas förordning. Mot detta mål, har vi använt in vivo pH-mätningar av vakuolär och cytosolisk pH: 1) att övervaka svar på förändrade extracellulära förhållanden, såsom glukos deprivation och readdition, 2) att undersöka effekterna av mutationer som kompromiss V-ATPas-aktivitet, och 3) att utforska samordning av organell och plasmamembran protonpumpar 3-5. Dessa experiment blev möjlig endast genom utveckling av robusta ratiometrisk pH-indikatorer som lämpar sig för användning i jästceller. . Växt et al först visade att BCECF (2'7'-bis-(2-karboxietyl) -5 - (och 6)-karboxifluorescein), som har använts i stor utsträckning för att mäta cytosoliskt pH i däggdjursceller, ackumuleras i jästen vakuolen i stället för den cytosolen 6. Denna skillnad i BCECF lokalisering har tillskrivits många hydrolytiska enzymer i vakuolen, som sannolikt ansvariga för klyvning av acetoxy metylestern från BCECF-AM (acetoximetylester av BCECF) och vakuolär behålla 6. Ali et al. 7 vidareutvecklat vakuolär pH-mätning med hjälp BCECF och anpassat dessa mätningar till en fluorescens plattläsaren format. Brett et al. Introducerade jäst pHluorin som ett sätt att mäta cytosoliskt pH i jäst genom att uttrycka en plasmidburen ratiometric pH-känsligt GFP 8 under kontroll av en jäst-promotor 9.
Den excitationsspektra av både BCECF och jäst pHluorin är känsliga för pH, så de används som ratiometrisk pH-indikatorer i vilka förhållandet av fluorescens vid två exciteringsvåglängder, mätt vid en enda emissionsvåglängd, ger ett mått på pH 8,10. Dessa jäst vakuolära och cytosolisk pH-sensorer har använts för både encelliga och befolkning-baserade mätningar. Encelliga mätningar 6,11 utförs av fluorescens mikroskopi och bildanalys. Vakuolär eller cytosolisk fluorescens vid de två våglängderna mäts för varje cell. De populationsbaserade Mätningarna utförs i antingen en mikroplattläsare med lämpliga fluorescens kapacitet eller i en fluorimeter. Vi har generellt sett gjort våra mätningar i en fluorimeter, eftersom det ger enkel åtkomst för tillsättning av komponenter såsom glukos under kondiga kinetiska mätningar. Våra nuvarande lab protokoll för mätning av vakuolär och cytosolic pH är listade nedan, båda är också lätt anpassas till mikroplatt analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Mätning av vakuolär pH In Vivo Använda BCECF-AM
- Odla en 50 ml flytande kultur av jäststammen som skall mätas i det önskade mediet över natten. Målet är att ha celler i mitten av log-fas (OD600 (optisk densitet vid 600 nm) mätning av cirka 0,8 för upphängning).
- Pellets jästcellerna genom centrifugering. Återsuspendera pelleten i 0,6 ml av tillväxtmediet och överför till ett mikrocentrifugrör som har vägts tidigare. Pellets cellerna igen i en mikrocentrifug vid 2000 x g under 60 sek. Avlägsna supernatanten så fullständigt som möjligt och sedan väga cellpelleten. Resuspendera pelleten till en slutlig densitet av 0,5 g / ml (vikt / vol), en kultur av denna volym kommer att ge en cellpellet om cirka 200 mg, och 200 | il buffert skulle tillsättas för att ge en slutlig volym av 400 | il.
- Lägg BCECF-AM till cellsuspensionen till en slutlig koncentration av 50 mM från en 12 mM lager framställd i DMSO. Blanda väl och sedan ökasUbaté cellerna vid 30 ° C under 30 min. på en gungande plattform eller valstrumma.
- Medan cellerna inkubation, förbereda kalibrering buffertar. Kalibreringen bufferten innehåller 50 mM MES (2 - (N-morfolino) etansulfonsyra), 50 mM HEPES (4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M ammoniumacetat, 10 mM natriumazid och 10 mM 2-deoxiglukos, och justeras till pH som är lämplig för mätområde med NaOH eller HCl. (Varning: Natriumazid är mycket giftigt och bör hanteras med försiktighet.) För mätning av pH i vildtypceller, skulle vi förbereda flera kalibrering blandningar vid pH 5,5 till 6,5, men för mutanter förväntas ha en mer basisk vakuolär pH ( vma mutanter), skulle vi förbereda ytterligare, högre pH-buffertar.
- Alikvot 2 ml kalibrering buffert för varje pH i 15 ml koniska rör och tillsätt monensin (15 mM stamlösning) och nigericin (2 mM stamlösning) för att ge slutliga koncentrationer av 110 pM monensin och 15 | iM nigericin, respectively. Blanda väl på en vortexblandare. (Varning: Både monensin och nigericin är giftiga och bör hanteras med försiktighet.)
- När BCECF-AM inkubationstid är klar, pellet cellsuspensionen genom centrifugering under 30 sekunder vid 2000 x g i en mikrocentrifug. Resuspendera cellerna är 1 ml tillväxtmedium som saknar glukos och centrifugera som ovan. Upprepa detta tvättsteg en gång, och sedan återsuspendera pelleten i 200 | il tillväxtmedium utan glukos. Placera på is.
- Tillsätt 20 pl av cellsuspensionen till varje pH kalibreringsrör framställts ovan. Inkubera vid 30 ° C under 30-60 min. på en rulle trumma.
- Ställ fluorimetern för alternerande mätning vid excitationsvåglängder 450 nm och 490 nm, båda med en emissionsvåglängd av 535 nm. Ställ in temperaturen provkammaren till 30 ° C. Utför alla mätningar med kontinuerlig omröring av blandningen i kyvetten.
- Lägg 1,96 ml av 1 mM MES (justerad till pH 5 eller 7 beroende på pH av cellernas odlingsmedium ennd experimentell design). Tillsätt 20 pl av cellsuspensionen i kyvetten. Initiera fluorescensmätningar. Vi samlar både kontinuerlig kinetiska och tid-punkt data i olika experiment. För kontinuerliga kinetiska data, vi kunna mäta varje 6 sek under 5 minuter, tillsätt sedan glukos till en slutlig glukoskoncentration av 50 mM, och fortsätta mätningen under 5-10 min. För enstaka gång-punktmätningar, tar vi generellt mått på 1 och 5 min. efter tillsats av celler till kyvetten, tillsätt glukos som i de kinetiska mätningar, och sedan ta en ny mätning 5 min. efter glukostillsats. Dessa tillägg kan varieras, och ytterligare komponenter (inhibitorer, etc.) kan också tillsättas.
- Efter de experimentella mätningarna är klara, ta bort kalibrering rören från 30 ° C inkubation och överföra hela 2 ml volym för varje till fluorimetern kyvetten. Mät fluorescens vid samma inställningar (se 1.8) var 5 sekund under totalt 30 sekunder för varje prov.
- Exportera fluorescens data till Microsoft Excel. (För vår fluorimeter, kräver denna export av data som text i tabbavgränsat formuläret och import till Excel.) Skaffa en kalibreringskurva genom att beräkna kvoten av fluorescens vid 490 nm till 450 nm för varje kalibrering blandning. Den fluorescensförhållande plottas sedan som funktion av pH för att få en kalibreringskurva.
- Konvertera de experimentella data till fluorescensförhållande och beräkna pH med användning av standardkurvan. Vakuolär pH kan sedan plottas mot tiden (kinetik pH-förändringar) eller jämförs under olika förhållanden (figur 1) eller i olika muterade stammar.
2. Mätning av cytosoliska pH In Vivo Använda Jäst pHluorin
- Förvandla önskad jäststam med jästen pHluorin plasmiden genom standardprotokoll, och välj för transformanter på kompletterat minimalt medium utan uracil (SC-uracil).
- Odla en 50 ml flytande kultur av transformerade celler i SC-uracil till mitten av log-fasen (OD
- Förbered kalibreringsstandarder som beskrivits för vakuolär pH, men buffert till ett pH-område lämpligt för cytosoliska pH-mätningar, vanligen pH 6-8. Alikvot 2 ml kalibrering buffert justerad till önskat pH i flera 15 ml koniska rör. Lägg monensin och nigericin såsom beskrivits ovan (1.4) och blanda väl.
- Skörda cellerna genom centrifugering såsom beskrivits ovan, och återsuspendera pelleten i 600 | il av tillväxtmedium. Överföring till en uppvägd mikrocentrifugrör, och pellets celler genom centrifugering vid 5000 rpm under 30 sek. Återsuspendera pelleten i 1 ml tillväxtmedium utan glukos (SC-uracil,-glukos), pellets celler igen och upprepa. Efter den sista centrifugeringen, avlägsna supernatanten så grundligt som möjligt och väga cellpelleten. Resuspendera celler till en slutlig densitet av 0,5 g / ml i SC-uracil med ingen glukos.
- Tillsätt 20 pl av cellsuspensionen till varje rör av kalibrering buffert och blanda väl på en vortexblandare. Inkubera vid 30 ° C på en roterande trumma rotor för 60 min.
- Konfigurera fluorimetern för excitation vid våglängderna 405 och 485 nm och en emissionsvåglängd av 508 nm. Fortsätt med enda tidpunkt eller kinetiska mätningar och tillsats av glukos såsom beskrivits ovan för BCECF mätning.
- Mät fluorescens kalibreringsprover, och konstruera en kalibreringskurva som för BCECF (se 1,10-1,11). En plot av fluorescensförhållande vs pH är linjär över intervallet flesta cytosoliska pH-mätningar (pH 6,0-8,0) 9, är så experimentella fluorescensförhållande mätningar lätt omvandlas till pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar vakuolära pH data erhållna från vildtyp jästceller odlas i rikt medium (jästextrakt-pepton-dextran, YEPD) buffrad till pH 5 med 50 mM MES. Vi växer ofta av cellerna i buffrat medium eftersom mediets pH kan förändras ganska dramatiskt under tillväxt över natten, särskilt för minimalt medium, och vi har funnit att pH för tillväxtmediet kan påverka vakuolära pH svar 3. Men det är också acceptabelt för många försök att odla cellerna i obuffrat mediet. Figur 1A visar en kalibreringskurva för celler inkuberas med BCECF-AM av protokollet ovan. Även om sambandet mellan BCECF fluorescensförhållande och vakuolär pH är icke-linjär över ett bredare pH-område 7, är det nästan linjär i det relevanta intervallet för dessa experimentella mätningar, och en linjär trendlinje visas och används för att beräkna pH-värden för experimentet. Vakuolär pH-förändringar till följd av GLucose tillägg till glukos-berövade celler visas i figur 1B. Vakuolär pH ökar under BCECF-AM märkning eftersom cellerna är glukos berövade, men minskar efter glukos readdition, förmodligen som en följd av V-ATPas aktivering genom återmontering 3,4. En viss ökning av vakuolär pH observeras vid tillsats av 50 mM KCl, tre minuter efter glukostillsats. I en större studie, kör vi typiskt åtminstone tre oberoende experiment (biologiska replikat) och visar den genomsnittliga pH ± SE för varje tillstånd 3-5.
Kinetiken för cytosoliskt pH-förändring med glukostillsats visas i figur 2. För detta experiment, var vildtyp jästceller odlades i syntetiskt fullständigt medium saknande uracil (SC-uracil), buffrad till pH 5 med 50 mM MES. Detta medium är lämpligt för underhåll av plasmid innehållande jäst phluorin under styrning av fosfoglyceratkinas (PGK)-promotorn,som vi har använt nyligen 3,5; andra plasmider kan kräva olika utvalda förhållanden. Kalibreringskurvan (figur 2A) visar att den kvotmetriska svaret hos pHluorin till pH är linjärt över ett brett pH-intervall, i allmänhet omfattar varje fysiologiskt relevant cytosoliska pH. Svaret från vildtypsceller visas här är mycket karakteristisk, det finns en omedelbar sänkning av pH, följt av en ökning till pH 7,2-7,4.
Vi konstruerar kalibreringskurvor för varje stam och i varje experiment. Vi använder en in situ kalibrering blandning beskrivs av Brett et al. 9 för både BCECF och pHluorin mätningar. Denna blandning innehåller cell-genomträngande ammoniumacetat kan kollapsa pH-gradienter över flera membran, till natriumazid och deoxiglukos stoppa ATP produktion och hämmar H +-pumpar, och monensin och nigericin, jonoforer inblandad i kollapsen av pH-gradienter i jästsekretoriska / vacuolar transportvägar 12 och mitokondriell inre membranet 13, respektive. Det är värt att notera att vi inte subtrahera en bakgrund värde för omärkta celler för vakuolära eller cytosola pH-mätningar. Även om cellerna har några inneboende autofluorescens, har vi jämfört direkt pH-mätningar med och utan korrektion för bakgrunden kalibreringen och experimentella prover och har sett någon skillnad i de slutliga värdena. Bakgrund subtraktion kommer att resultera i brantare kalibreringskurvor, och kan vara önskvärt under förhållanden där fluorescenssignaler är låga och signal-brusförhållandet blir ett problem. Till exempel, vid mätning från en Golgi / endosome-lokaliserad pHluorin 5, vilket ger en lägre total signal, gjorde vi subtrahera bakgrunden signalen från alla mätningar.
Figur 1. Mätningement av vakuolära pH svar i celler av vild typ odlade i YEPD, pH 5. Vildtyp (SF838-5aa)-celler odlades till mitten av log-fas och inkuberades sedan med BCECF-AM som beskrivits ovan. A. Kalibreringskurva visar mätt förhållande av fluorescensintensitet från excitation vid 490 nm (I490) till intensitet från excitation vid 450 nm (I450) (båda mätta vid en emissionsvåglängd av 535 nm) vid varierande pH. En linjär trendlinje visas. B. vakuolär pH efter en kort glukos deprivation mättes i en del av samma märkta, cellsuspension (ingen glukos). Glukos tillsattes sedan till en slutlig koncentration av 50 mM och fluorescensförhållande mättes efter 5 min (5 '+ glukos). 50 mM KCl tillsattes sedan och fluorescensförhållande mättes efter 3 min och omvandlas till pH (3 '+ KCl).
Figur 2. Kinetik för cytosolic pH svar på glukostillsats i celler av vild typ. Vildtyp celler transformerades med jäst pHluorin under styrning av fosfoglyceratkinas (PGK)-promotorn och transformanter som odlats såsom beskrivits ovan. visar uppmätta förhållandet av fluorescensintensiteten vid 405 A. Kalibreringskurva nm (I405) till intensiteten vid 485 nm (I485) som funktion av pH. B. cytosolisk pH härrör från fluorescensintensiteten mätningar var 6 sek. över 6 min. Glukos (50 mM slutlig) sattes till cellerna i kyvetten vid den angivna tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utnyttjat dessa protokoll för att hantera ett antal aspekter av pH-homeostas. Till exempel har vi jämförde cytosoliska och pH-svaren av vildtyp och V-ATPas-deficient mutantceller 4,5. Vi har även undersökt effekterna av förändrade tillväxtförutsättningar, särskilt extracellulära pH, på vakuolär pH svar på glukos 3. Viktigt svaren vi observerar är både förenligt med andra metoder för kvantitativ pH-mätning och med biokemiska data som beskriver förändrade verksamhet protonpumparna.
De två viktigaste inslagen i den typ av in vivo pH-mätningar som beskrivs här är lokalisering av fluoroforen och nivån på signalen, problem med någon av dessa kräver modifiering av metoden för den specifika tillämpningen eller mutant. Den vakuolära lokalisering av BCECF är något slumpartad 6, men är bevarat i ett antal olika mutanter, inklusivevma mutanter 4, som har sänkta nivåer av vakuolära hydrolaser. Jäst vakuolerna är lätt visualiseras genom mikroskopi enligt Nomarski optik, och vi bekräftar vakuolär lokalisering av färgen för varje stam. pHluorin är mer mångsidig som en pH-sensor, i synnerhet med tanke på dess känslighet över större delen av det fysiologiska pH-området (Figur 2A). Jästen pHluorin som vi har använt verkar vara uteslutande cytosolisk, förmodligen därför att den saknar annan inriktning information. Emellertid har pHluorin varit riktade till Golgi-apparaten genom att märka med sekvenser från Golgi klorid transportören Gef1, tillsammans med ytterligare insättning av membran segment från halorhodopsin att ge ordentlig topologi (pH-Gef1, 14). Orij et al. Har framgångsrikt riktat pHluorin till den mitokondriella matrisen och mätte mitokondriella pH-förändringar med ämnesomsättningen 15. Dessa resultat tyder på att rätt utformade fusionsproteiner kan göra det possible för att övervaka pH-svar i många organeller. Signalen för bullernivå av vakuolär BCECF är ganska hög i de flesta av de jäststammar som vi har undersökt. Signal från uttryckta pHluorin proteiner kan manipuleras via promotor som driver pHluorin uttryck. I den ursprungliga cytosolic pHluorin konstruktionen 9, var uttryck som drivs av en värmechock elementhaltiga promotor och var inte särskilt hög. Men senare expressionskonstruktioner från PGK-promotorn, TEF1 promotorn och aktinpromotor verkar ge högre expressionsnivåer 3,15,16. Golgi-specifika pHluorin pH-Gef1 uttrycks från en inducerbar promotor 14. Transient induktion av uttryck kan vara särskilt användbart för mindre fack av sekretoriska och endocytic vägar, där fortsatt hög nivå uttryck kan leda till pHluorin mislocalization eller ens störningar i facket pH, manifesteras genom långsam tillväxt eller mislocalization av andra proteiner.
<p class = "jove_content"> Förutom egenskaperna hos de fluoroforer är det viktigt att inse att in vivo pH-mätningar är känsliga för tillväxt och metaboliska betingelser av jästcellerna själva. Denna känslighet är fysiologiskt relevant och potentiellt intressant, men kan också vara en källa till variabilitet mellan mätningarna. Vi tar hand att jämföra mätningar från jästceller i samma tillväxtfasen, vanligen början till mitten av logaritmisk fas. Eftersom vakuolära pH svaren kan vara känslig för extracellulär pH 3, övervakar vi pH tillväxt medium, särskilt för celler odlade i obuffrat medium. Även om det är uppenbart att många olika tillväxtmedia är kompatibla med ratiometrisk pH-mätning kan skillnader i mediumsammansättning påverka definitivt pH 17. Dessutom, efter celler skördas och förberedda för mätning, har vi funnit att långvarig glukos deprivation (timmar) minskar inte endast den initiala cytosolic pH och ökar den initiala vakuolär pH, men också betydligt långsammare svar till glukos. Därför initierar vi generellt experiment inom 30 min. eller mindre av börjar glukos deprivation.Ansamling av fluorescerande lysosomotropic aminer, såsom kinakrin och akridinorange, har använts i stor utsträckning för att bedöma utrymmet försurning i levande jästceller. Dessa metoder är snabba och enkla, men bör betraktas som mycket mer kvalitativ än ratiometriska mätningar av pH. I allmänhet metoder såsom kinakrin upptag åberopa membranpermeabiliteten av den grundläggande formen av fluoroforen, som blir infångad när den är protonerad i en sur fack och kan visualiseras under ett fluorescensmikroskop 18. Ackumulering av färgämnet förlitar om separation enligt pH-gradienten över membranet, så upptagning i sura organeller kan försvagas genom att antingen alkaliseringen av organell eller acidificatipå av cytosolen. Dessa metoder kommer att förbli användbara, men bör nog tolkas som att tillhandahålla en relativ grad av surgöring.
Tillämpningarna av ratiometrisk fluorescerande pH-mätningar i jäst fortsätter att expandera. Brett et al. Senast uppmätta vakuolär pH i samling av över 4500 icke-väsentliga mutanter jäst radering och avslöjade ett antal nya mekanismer för pH-reglering 17. BCECF och pHluorin 19,20 har också anpassats till en fluorescens-aktiverad cell sortering format för att underlätta screening för nya V-ATPas-inhibitorer. Dechant et al. 11 begagnade microfluidics i kombination med fluorescens mikroskopi för att följa V-ATPas montering och cytosolisk pH samtidigt genom flera cykler av glukos deprivation och readdition. Dessa resultat tyder på att ratiometriska mätningar av pH i jäst är tillräckligt robust och mångsidig som skall tillämpas på många typer av experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM50322 till PM Kane. Författarna tackar Dr Rajini Rao, Johns Hopkins University för att ge jästen pHluorin plasmider och för råd om ratiometrisk pH-mätningar, och Dr Gloria A. Martinez Munoz för att arbeta ut dessa protokoll för vårt labb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
