Summary
Vakuolar ve sitozolik pH canlı maya ölçülebilir (
Abstract
Vakuolar ve pH sitozolik yüksek maya hücreleri düzenlenmiştir ve genel pH dengesini merkezi bir rol işgal edilir. Biz vakuol veya sitoplazmada lokalize pH duyarlı fluorophores kullanarak in vivo pH oranlı metrik ölçümü için protokolleri tarif. Vakuolar pH onun asetoksimetil ester halinde hücreler içine dahil edildikleri zaman, maya vakuol lokalize BCECF ile ölçülmektedir. Sitosolik pH değeri, bir maya promotör, maya pHluorin kontrolü altında ifade edilen, pH'ye duyarlı, GFP ile ölçülür. Bir fluorimetre maya hücre süspansiyonlarında floresan oranları ölçümü için yöntemler tarif edilmiştir. Bu protokollerin sayesinde, farklı koşullar altında ya da farklı maya mutant pH tek bir zaman noktasında ölçümleri karşılaştırılmıştır ve zaman içinde pH değişiklikleri takip edilmiştir. Bu yöntemler aynı zamanda yüksek hacimli deneyler için flöresanlı bir plaka okuyucu biçimine uyarlanmıştır. Diğer ap üzerinde rasyometrik pH ölçümleri Avantajlarışu anda kullanılan, olası deneysel sorunlar ve çözümleri ve bu tekniklerin ileride kullanmak için umutları izlenen yolun da açıklanmıştır.
Introduction
pH dengesini bütün organizmalar 1,2 dinamik ve oldukça düzenli bir süreçtir. Biyokimyasal süreçlerin sıkı pH tarafından düzenlenir ve hücre içi ortamlarda ikamet enzimlerin en iyi etkinlik sağlamak için dar pH aralıkları için ayarlanmıştır. Ancak, hücre içi pH dengesini çevre pH, metabolik değişimler ve bazı sinyal yolları hızlı değişiklikler itiraz edilebilir. Buna ek olarak, hücre içi pH önemli bir sinyal olarak kendini hizmet edebilir. Son olarak, birçok organeller organel-özel işlevler için çevredeki sitoplazmada farklı ve gerekli olan lumenal pH değerlerini korumak.
Yüksek ökaryotlar 2 ile pH dengesini mekanizmaların maya Saccharomyces cerevisiae hisse bir dizi. Lizozomal / endositik yolunun asidik organeller olarak, pH öncelikle birçok exchan ile birlikte hareket eden, son derece korunmuş vakuolar proton-translocating ATPaz (V-ATPaz) tarafından kontrol edilirpH degrade bağlıdır Gers. Tüm ökaryotik hücreler aynı zamanda proton verme mekanizması vardır. Olarak mantar ve bitkiler, plazma zarı ikinci bir, ayrı proton pompa, Pma1, ihracat metabolik proton ve sitozolik pH ve plazma membran potansiyeli en önemli belirleyici olduğuna inanılıyor. S. genetik esnekliği cerevisiae ve ticari önemi, bu pH dengesini 2 eğitim için çok ilginç ve önemli bir model yaptık.
Organel asitlenme birincil sürücüleri olmasının yanı sıra, V-ATPaz yüksek enzimler düzenlenir ve laboratuvar V-ATPaz düzenleme mekanizmaları anlamak ilgileniyor. Bu hedefe doğru, biz vakuolar ve sitozolik pH in vivo pH ölçümlerinde kullanıyorum: 1) mutasyonların etkilerini bu uzlaşma V-ATPaz aktivitesini incelemek için glikoz yoksunluk ve readdition, 2 olarak değişen hücre dışı koşullar,) yanıtları izlemek için, ve 3) koordine keşfetmek içinorganel ve plazma membran proton pompa 3-5 koordi-nasyonunu sağlıyor. Bu deneyler sadece maya hücreleri kullanmak için uygun sağlam rasyometrik pH göstergelerin geliştirilmesi yoluyla mümkün oldu. . Memeli hücrelerinde sitosolik pH'ını ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır,, maya vakuol birikir - Bitki ve ark olanlar BCECF ((ve 6)-karboksifloresan 2'7'-Bis-(2-karboksietil) -5) gösterdi yerine sitoplazmada 6. BCECF lokalizasyon bu fark BCECF-AM (BCECF arasında asetoksimetil ester) ve vaküler tutma 6 asetoksi metil esterin parçalanması için olası sorumludur vakuol birçok hidrolitik enzimler, atfedilmiştir. Ali ve diğ. 7 daha BCECF kullanılarak vakuolar pH ölçümü geliştirilen ve bir floresan plaka okuyucu biçimi için bu ölçümler uyarlanmıştır. Brett ve ark. Bir plazmid kaynaklı R ifade ederek maya sitosolik pH ölçümü için bir araç olarak maya pHluorin tanıtılanBir mantar-spesifik promotör 9 arasında kontrol altında atiometric pH duyarlı GFP 8.
BCECF ve maya pHluorin iki uyarma spektrumları pH'a duyarlıdır, bu nedenle tek bir emisyon dalga boyunda ölçülen iki uyarma dalga boyu, önceki floresans oranı pH 8,10 arasında bir ölçü sağlar ki rasyometrik pH göstergesi olarak kullanılır. Bu maya vakuolar ve sitozolik pH sensörleri hem tek hücreli ve toplum temelli ölçümler için kullanılmaktadır. Tek hücreli ölçümleri 6,11 floresan mikroskopi ve görüntü analizi ile gerçekleştirilir. Iki dalga boyunda Vakuolar veya hücre floresan her bir hücre için ölçülür. Popülasyon tabanlı ölçümleri uygun floresan özelliklerine sahip bir mikroplaka okuyucu ya da ya da bir fluorimetre gerçekleştirilir. Bu con sırasında glikoz gibi bileşenlerin yanı sıra kolay erişim sağlar çünkü genellikle, bir florimetresi bizim ölçümleri yapmışmanın hikayesi kinetik ölçümleri. Vakuolar ve sitosolik pH değerinin ölçümü için mevcut laboratuar protokoller aşağıda belirtilmiştir; hem de kolayca mikroplaka deneyleri için uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BCECF-AM kullanarak in vivo Vakuolar pH Ölçümü
- Gece boyunca istenen ortam ölçülecek olan maya suşu, 50 ml sıvı kültür büyütün. Amaç, (OD600 (600 nm'de optik yoğunluk) süspansiyon yaklaşık 0.8 ölçümü) orta log fazında hücrelerin sahip olmaktır.
- Pelet santrifüj maya hücreleri. Büyüme ortamı ve önceden tartılan edilmiş bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.6 ml pelletini. 60 saniye boyunca 2000 x g'de bir mikrosantrifüj içinde yeniden Pelet hücreleri. Olarak tamamen mümkün süpernatant kaldırmak ve daha sonra hücre pelet tartmak. 0.5 g / ml (k / h) bir son yoğunluk elde etmek için pelletini, bu birimin bir kültür, yaklaşık olarak 200 mg arasında hücre topağı, ve tamponun 200 ul verecek 400 ul'lik nihai bir hacim verecek şekilde eklenebilir.
- DMSO içinde hazırlanan 12 mM stoktan 50 mM'lik bir son konsantrasyonda hücre süspansiyonu BCECF-AM ekleyin. Iyi ve daha sonra inc Mix30 dakika boyunca 30 ° C'de hücre Ubate. bir sallanan bir platform veya rulo davul.
- Hücreler inkübe edilirken, kalibrasyon tamponlar hazırlamak. , 50 mM HEPES (4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit), 50 mM KCI, 50 mM NaCI, 0.2 M amonyum asetat, - kalibrasyon tamponu 50 mM MES ((N-morfolino) etansülfonik asit, 2) içerir 10 mM sodyum azit ve 10 mM 2-deoksiglukoz, ve pH değeri ayarlanır NaOH veya HCI ile kalibrasyon aralığı için uygun değer verir. (Dikkat: Sodyum azid yüksek derecede toksiktir ve dikkatle ele alınmalıdır.) Yabani tip hücrelerde pH ölçümü için, (6.5, ama bir daha alkali vakuolar pH olması bekleniyor mutantlar için pH 5.5 'de birkaç kalibrasyon karışımları hazırlayacak vma mutantlar), ek, daha yüksek pH tamponları hazırlayacak.
- Kısım 2 15 ml konik tüpler her bir pH için kalibrasyon tampon ml, ve son 110 mcM monensin konsantrasyonu ve 15 mcM nigericin, r vermek için monensin (15 mM stok) ve nigericin (2 mM stok) ekleyinespectively. Bir vorteks karıştırıcıda iyice karıştırın. (Dikkat: monensin ve nigericin Hem toksik ve dikkatle ele alınmalıdır.)
- bir mikrosantrifüj içinde 2,000 x g'de 30 saniye boyunca santrifüj ile BCECF-AM inkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, pelet hücre süspansiyonu. Hücrelerin tekrar yukarıdaki gibi santrifüj eksik glukoz ve büyüme ortamı 1 ml'dir. Bir kez bu yıkama adımı yineleyin ve sonra glikoz olmadan büyüme orta 200 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Buz üzerinde yer.
- Yukarıda hazırlanan her bir pH kalibrasyon tüp hücre süspansiyonu, 20 ul ekle. 30-60 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin. bir rulo davul.
- Dönüşümlü olarak uyarım dalga boyu 450 nm ve 490 nm, 535 nm ve emisyon dalga boyu ile hem de ölçmek için florimetresi ayarlayın. 30 ° C için örnek odası sıcaklığı ayarlayın Küvet içinde, karışımın sürekli karıştırma ile tüm ölçümler gerçekleştirme.
- 1 mM MES ve 1.96 ml (hücrelerin büyüme ortamı arasında bir pH değerine bağlı olarak pH değeri 5 ya da 7'ye ayarlandı eklemend deneysel tasarım). Küvet içine hücre süspansiyonu, 20 ul ekle. Floresan ölçümleri başlatın. Biz sürekli kinetik ve farklı deneylerde zaman noktası veri hem toplamak. Sürekli kinetik veriler için, 5 dakika için 6 saniye ölçüm almak, sonra 50 mM'lik bir son glükoz konsantrasyonu için glikoz ekleyin ve 5-10 dakika için ölçü devam etmektedir. Tek zaman noktası ölçümleri için, biz genel olarak 1 ölçümleri almak ve 5 dk. küvete hücrelerin eklenmesinden sonra, kinetik ölçümler olarak glikoz eklenmektedir ve daha sonra başka bir ölçüm 5 dakika sürer. glukoz ilave edildikten sonra. Bu eklemeler değişik olabilir ve ek bileşenler (inhibitörleri, vs) de ilave edilebilir.
- Deneysel ölçümler tamamlandıktan sonra, 30 ° C'de kuluçka, kalibrasyon tüpleri kaldırmak ve florimetresi küvete her biri için tüm 2 ml hacme aktarın. Her 5 sn her bir örnek için 30 sn olmak üzere toplam üzerinden (1.8 bakınız) aynı ayarlarda floresan ölçün.
- Microsoft Excel'e floresan İhracat verileri. (Bizim florimetresi için, bu Excel'e sekme ile sınırlandırılmış formu ve ithalat metin olarak veri ihracat gerektirir.) Her kalibrasyon karışım için 450 nm 490 nm floresan oranı hesaplayarak bir kalibrasyon eğrisi elde. Floresans oranı, daha sonra, bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için pH değeri genel çizilir.
- Floresan oranı deneysel verileri dönüştürmek ve standart eğrisi kullanılarak pH hesaplar. Vakuolar sonra pH süresi (pH değişimi kinetiği) karşı çizilen veya çeşitli koşulları (Şekil 1) altına ya da farklı mutant suşları karşılaştırıldığında olabilir.
2. Maya pHluorin kullanarak in vivo Sitosolik pH Ölçümü
- Standart protokoller plazmid maya pHluorin ile istenilen maya suşu dönüştürmek ve takviye az orta eksik urasil (SC-urasil) üzerinde transformantlar için seçin.
- Orta log fazı (OD SC-urasil dönüştürülmüş hücre, 50 ml sıvı kültür büyütün
- Vakuolar pH, ancak sitosolik pH ölçümleri, genellikle pH 6-8 için uygun bir pH tampon için tarif edilen kalibrasyon standardı hazırlayın. Kalibrasyon tampon kısım 2 mi birkaç 15 ml konik tüp içine istenen pH değerine ayarlandı. (1.4) yukarıda tarif edildiği gibi Monensin ve nigericin ekleyin ve iyice karıştırın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj ile hücreler hasat ve büyüme ortamı 600 ul pelletini. 30 saniye için 5000 rpm'de santrifüjleme ile tartılmış bir mikrosantrifüj tüpü ve topak hücrelere transfer. Yine glikoz (SC-urasil-glikoz), topak hücrelere olmadan büyüme ortamı içinde 1 ml pelletini ve tekrarlayın. Santrifüj işleminden sonra son olarak tamamen mümkün süpernatantı ve hücre pelletini tartın. Resim glukoz ile SC-urasil, 0.5 g / ml 'lik bir nihai yoğunluğa süspansiyon hücreleri.
- Kalibrasyon tampon her tüpe hücre süspansiyonu, 20 ul ekleyin ve bir vorteks karıştırıcıda iyice karıştırın. 3 inkübe0 ° 60 dakika için dönen bir davul rotor üzerinde C.
- Dalga boyları 405 ve 485 nm eksitasyon ve 508 nm emisyon dalga boyu için florimetresi ayarlayın. BCECF ölçümü için yukarıda tarif edildiği gibi tek bir zaman noktasında veya kinetik ölçümleri ve glikoz ilave devam edin.
- Kalibrasyon numuneleri arasında floresan ölçmek ve BCECF (1.10-1.11 bakınız) gibi bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak. Floresans oranı genel pH Bir arsa en sitosolik pH ölçümleri (pH 6.0-8.0) 9 aralığında doğrusaldır, bu nedenle deneysel floresans oranı ölçümleri pH'ını kolayca dönüştürülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
50 mM MES pH 5'e tamponlu: Şekil 1 zengin bir ortamda yetiştirilen yabani tip maya hücreleri (YEPD maya ekstresi, pepton-dekstran) üzerinde elde vakuolar pH veriler sunulmuştur. Ortamın pH özellikle minimal ortam için gece büyüme sırasında oldukça önemli ölçüde değişebilir, çünkü genellikle tamponlu ortam içinde hücrelerin büyümesi, ve büyüme ortamının pH'ı, pH vakuolar yanıtları 3 etkileyebilir bulduk. Çok sayıda deney tamponsuz ortamda hücrelerin büyümesi için Ancak, aynı zamanda kabul edilebilir. Şekil 1A, yukarıdaki protokole göre BCECF-AM ile kuluçkaya yatırılmış hücreler için bir kalibrasyon eğrisini göstermektedir. BCECF floresans oranı ve vaküler pH arasındaki ilişki, daha geniş bir pH aralığı boyunca 7 doğrusal olmayan olmasına rağmen, bu deneysel ölçümleri için ilgili aralığında neredeyse doğrusal ve doğrusal çizgisi gösterilen ve deney için pH değeri hesaplamak için kullanılır. Gl kaynaklanan Vakuolar pH değişiklikleriglukoz yoksun hücrelerin ucose ek Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Sırasında vakuolar pH artar hücreleri glikoz yoksun olduğu için BCECF-AM etiketleme, ama yeniden montaj 3,4 ile V-ATPaz aktivasyonu sonucunda muhtemelen, glukoz readdition sonra azalır. Vakuolar pH hafif bir artış, 50 mM KCI, glukoz eklemeden sonra üç dakika içinde ilave edilmesi üzerine gözlenmiştir. Daha büyük bir çalışmada, genellikle en az üç bağımsız deneyler (biyolojik çoğaltır) çalıştırın ve her durum 3-5 için ortalama pH ± SE göstermektedir.
Glukoz ilave edilerek pH sitosolik değişim kinetiği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu deney için, yabani tip maya hücreleri, 50 mM MES pH 5'e tamponlu, urasil (SC-urasil) eksik sentetik tam ortam içinde büyütülmüştür. Bu ortam, fosfogliserat kinaz (PGK) promoteri kontrolü altında plazmid içeren maya phluorin bakımı için uygundurki biz son 3,5 kullanmış, diğer plazmid farklı seçin koşulları gerektirebilir. Kalibrasyon eğrisi (Şekil 2A) pH pHluorin bir rasyometrik yanıtı geniş bir pH aralığı boyunca doğrusal olduğunu gösterir, genel olarak herhangi bir fizyolojik olarak ilgili pH sitosolik kapsamaktadır. Burada gösterilen, vahşi tip hücre yanıtı çok karakteristiktir, pH 7.2-7.4 kadar bir artış ve ardından pH değeri hemen bir azalma yoktur.
Biz her bir suş için ve her deneyde kalibrasyon eğrileri inşa. Biz Brett ve arkadaşları tarafından tarif in situ kalibrasyon karışımı içinde kullanın. 9 BCECF ve pHluorin ölçümler hem de. Bu karışım çok membranlar arasında pH geçişlerini çöken kapasitesine sahip hücre-permeant amonyum asetat içeren, sodyum azid ve deoksiglukoz ATP üretimi durdurmak ve +-pompalar ve monensin ve nigericin, iyonoforlar maya salgı / vakum pH geçişlerini çökmesi rol H inhibeuolar ulaşım sırasıyla 12 ve mitokondri iç zarının 13, yollarının. Bu bizim vakuoler veya sitozolik pH ölçümleri için etiketsiz hücreleri için bir arka plan değeri çıkarma yok dikkati çekiyor. Hücrelerin bazı içsel otofloresansı var olsa da, doğrudan ve kalibrasyon ve deney örnekleri arka plan düzeltme olmadan pH ölçümleri karşılaştırdık ve son değerleri fark gördük. Arka plan çıkarma dik kalibrasyon eğrileri neden olur ve flöresan sinyalleri, gürültü oranı düşük ve sinyal koşullar altında bir sorun haline gelir istenebilecektir. Örneğin, genel olarak daha az sinyal veren bir Golgi / endosome-lokalize pHluorin 5, gelen ölçüm, biz tüm ölçümlerden arka sinyal çıkarma yaptı.
Şekil 1. KuvYEPD, pH 5'te. hücreleri (SF838-5Aα) Yabani-tip yetiştirilen vahşi tür hücrelerinde vakuolar pH tepkilerin ement ölçülen arası yukarıda tarif edildiği gibi BCECF-AM. A. kalibrasyon eğrisi ile inkübe daha sonra orta log fazına yetiştirilen edildi ve çeşitli pH değerlerinde 450 nm (I450) (her ikisi de 535 nm'lik bir emisyon dalga boyunda ölçülen) 'de bir eksitasyon ikinci yoğunluğu 490 nm'de (I490)' de bir eksitasyon floresans yoğunluğu oranına sahiptir. Doğrusal bir eğilim çizgisi gösterilmiştir. Kısa bir glikoz yoksunluğu, aynı etiketli hücre süspansiyonu (Resim glikoz) bir bölümü içinde ölçülmüştür B. Vakuolar pH sonra. Glukoz, daha sonra 50 mM nihai konsantrasyona kadar ilave edildi ve floresans oranı 5 dakika (5 '+ glikoz) sonra ölçülmüştür. 50 mM KCI ilave edildi ve floresans oranı yaklaşık 3 dakika sonra ölçüldü ve pH değeri (3 '+ KCI) dönüştürüldü.
Şekil 2. Cyt kinetiğiyabani tip hücrelerin yanı sıra glukoz. yabani tip hücrelere osolic pH tepki fosfogliserat kinaz (PGK) promoteri ve yukarıda tarif edildiği gibi büyütüldü transformantların kontrolü altında maya pHluorin ile transforme edildi. C. Kalibrasyon eğrisi 405 floresans yoğunluğu ölçülen oranı arası 485 nm (I485) vs pH yoğunluğu. B. Sitosolik pH nm (I405) Her 6 sn alınan floresan ölçümler elde edildi. 6 dakika boyunca. Glikoz (50 mM nihai) Belirtilen zamanda küvet içinde, hücrelere ilave edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz pH dengesinin yönlerini bir dizi adrese bu protokolleri kullanmış olurlar. Örneğin, 4,5-yabani tip ve V-ATPaz eksikliği mutant hücreler sitozolik pH ve yanıtlar bakımından karşılaştırdık. Ayrıca glikoz 3 vakuolar pH yanıt değişmiş büyüme koşulları, özellikle hücre dışı pH, etkilerini inceledik. Önemlisi, biz gözlemlemek tepkiler hem nicel pH ölçümü diğer yöntemlerle ve proton pompa değişmiş faaliyetleri anlatan biyokimyasal verilerle uyumludur.
In vivo pH ölçümleri arasında tip iki en önemli özellikleri burada açıklanan fluorofor lokalizasyonu ve sinyali seviyesinin vardır, bunlar arasında her iki sorun belirli bir uygulama ya da mutant için yöntemin değişiklik gerektirir. BCECF bir vaküoler lokalizasyonu 6 tesadüfi bir şekilde, ama farklı mutant bir dizi korunur, dahil olmak üzerevakuolar hidrolazların seviyesini düşürmüştür VMA mutantlar 4. Maya vakuoller Nomarski optik altında mikroskobu ile kolayca görsel, ve biz her bir suş için boya vakuolar lokalizasyonu onaylayın. pHluorin özellikle fizyolojik pH aralığı (Şekil 2A) en üzerindeki verilen yanıt, bir pH sensörü gibi daha çok yönlüdür. Diğer hedef bilgileri olmadığı için biz kullanmış olduğunuz maya pHluorin muhtemelen, sadece sitozolik gibi görünüyor. Bununla birlikte, uygun bir pHluorin topolojisi vermek halorhodopsin zar bölümlerine ek bir ekleme (, 14 pH Gef1) ile birlikte, Golgi klorür taşıyıcı Gef1 sekansları ile etiketleme ile Golgi aygıtı için hedeflenmiştir. Orij ve arkadaşları. Başarıyla metabolizması 15 ile mitokondriyal pH değişiklikleri mitokondrial matriks için pHluorin hedef ve ölçülen var. Bu sonuçlar uygun şekilde tasarlanmış füzyon proteinleri bu possib yapabilir öneririzle birçok organeller pH yanıtları izlemek için. Vakuolar BCECF gürültü seviyesine sinyal biz inceledik ki maya suşları çoğunda oldukça yüksektir. Ifade pHluorin proteinlerden Sinyal pHluorin ifade sürüş organizatörü ile manipüle edilebilir. Orijinal sitozolik pHluorin yapı 9, ifade bir ısı şok elemanı içeren organizatörü tarafından tahrik ve çok yüksek değildi. Bununla birlikte, PGK promotör, TEF1 promotörü ve aktin promotörü, daha sonra ekspresyon yapıları ifade 3,15,16 daha yüksek seviyelerini vermek üzere görünür. Golgi spesifik pHluorin pH Gef1 indüklenebilir bir promotör 14 ifade edilir. Ifade Geçici indüksiyon sürekli yüksek düzeyde ifade bölmesi pH mislocalization hatta tedirginlikler, diğer proteinlerin yavaş büyüme veya mislocalization ile tezahür pHluorin yol açabilir salgı ve endositik yolları, küçük bölmeleri için özellikle yararlı olabilir.
<p = sınıf "jove_content"> florofor özelliklerine ek olarak, in vivo pH ölçümleri, maya hücrelerinin kendileri büyümesi ve metabolik koşullar duyarlı olduğunu kabul etmek önemlidir. Bu duyarlılık fizyolojik ilgili ve potansiyel olarak ilginç, aynı zamanda ölçümler arasında değişkenlik kaynağı olabilir. Biz orta logaritmik faz için erken genellikle, aynı büyüme aşamasında maya hücrelerinden ölçümlerinin karşılaştırılması dikkat edin. Vakuolar pH yanıtları ekstrasellüler pH 3 olana kadar hassas olabilir, çünkü, böylece özellikle tamponlanmamış bir ortamda yetiştirilen hücreler, büyüme ortamı pH izler. Birçok farklı büyüme ortamı rasyometrik pH ölçümü ile uyumlu olduğu açıktır iken, orta kompozisyon farklılıkları kesinlikle pH 17 etkileyebilir. Hücreler hasat edilmiş ve ölçüm için hazırlandıktan sonra ek olarak, böylece uzun süreli glikoz yoksunluğu (saat) başlangıç cyt azalır sadece buldukosolic pH ve başlangıç vakuolar pH değerini arttırır, fakat aynı zamanda önemli ölçüde glikoz tepkileri yavaşlatır. Bu nedenle, genel olarak 30 dakika içinde deney başlatabilir. glikoz yoksunluğu başında veya daha azdır.Bu kinakrin ve akridin turuncu gibi floresan lysosomotropic aminler, birikimi maya hücreleri canlı bölmesi asitlenme değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler hızlı ve basit, ama pH oranlı metrik ölçümleri çok daha fazla nitel olarak kabul edilmelidir. Genel olarak, bu tür kinakrin alımı gibi yöntemler, bir asidik bölmeye protonlanır ve bir floresan mikroskobu altında görüntülendi 18 edilebilir zaman sıkışmış hale fluorofor temel biçiminin zar geçirgenlik dayanmaktadır. Boya birikimi zarından pH degrade göre bölümleme dayanır, bu yüzden asidik organeller içine alımını organel veya acidificati her iki alkalinizasyon zayıflamış olabilirsitoplazmada on. Bu yöntemler yararlı kalır, ama muhtemelen asitleşme göreceli bir düzeyde sağlamak olarak yorumlanmalıdır.
Maya rasyometrik floresan pH ölçüm uygulamaları genişletmeye devam ediyoruz. Brett ve diğerleri. Son 4500 üzerinde gerekli olmayan maya silme mutantlar koleksiyonunda vakuolar pH ölçülür ve pH düzenleme 17 yeni mekanizmalar bir dizi ortaya çıkardı. BCECF ve pHluorin 19,20 aynı zamanda yeni V-ATPaz inhibitörleri için tarama kolaylaştırmak için biçimi sıralama bir floresan ile aktive olan hücre uyarlanmıştır. Dechant ve arkadaşları. Floresan mikroskobu ile birlikte 11 kullanılan Mikroakiskan glikoz yoksunluk ve readdition birden fazla devir yoluyla aynı anda V-ATPaz montaj ve sitozolik pH izlemek için. Bu sonuçlar, maya pH rasyometrik ölçümleri yeterince güçlü ve deneyler çok çeşitli uygulanacak yönlü olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışma PM Kane için NIH R01 GM50322 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bizim laboratuar için bu protokollerin çalışma dışarı Dr Rajini Rao, maya pHluorin plazmid sağlamak için ve rasyometrik pH ölçümleri tavsiye için Johns Hopkins Üniversitesi ve Dr Gloria A. Martinez Munoz teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
