Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصميم واستخدام المصفوفات ناظم كيميائي تعدد في الإرسال

Published: February 23, 2013 doi: 10.3791/50262
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Genome Sciences, University of Washington

Summary

قمنا بتطوير والتحقق من صحة مجموعة صغيرة من البصمة الكيموستات مصغرة مبنية من قطع جاهزة للتكلفة منخفضة. وكانت نتائج تطور الفسيولوجية والتجريبية مماثلة لالكيموستات حجم أكبر. مجموعة ministat توفر منصة مدمجة، وغير مكلفة، ويمكن الوصول إليها عن تجارب ناظم كيميائي التقليدية، وعلم الجينوم وظيفية، والتطبيقات الكيميائية الفرز.

Abstract

الكيموستات هي أنظمة المستمر في الثقافة التي تزرع الخلايا في بيئة تسيطر عليها بإحكام ثابتة كيميائيا حيث يتم تقييد كثافة الثقافة عن طريق الحد من العناصر المغذية المحددة. 1،2 البيانات من الكيموستات هي استنساخه للغاية لقياس الظواهر الكمية لأنها توفر معدل نمو ثابت والبيئة في حالة مستقرة. يمكن لهذه الأسباب، الكيموستات أصبحت أدوات مفيدة لغرامة على نطاق وتوصيف علم وظائف الأعضاء من خلال تحليل التعبير الجيني 3-6 و غيرها من خصائص الثقافات في حالة استقرار التوازن .. 7 تجارب طويلة الأمد في تسليط الضوء على مسارات محددة الكيموستات أن السكان الميكروبية اعتماد خلال التطور على التكيف في بيئة تسيطر عليها. في الواقع، وقد استخدمت الكيموستات لتطور التجريبية منذ اختراعهم. 8 A نتيجة مشتركة في تجارب التطور البيولوجي لكل تكرار للحصول على ذخيرة فريدة من الطفرات9-13 هذا التنوع يشير إلى أن لا يزال هناك الكثير ليتم اكتشافها من قبل إجراء التجارب مع تطور الإنتاجية أكبر بكثير.

نعرض هنا تصميم وتشغيل بسيط نسبيا، مجموعة انخفاض تكلفة الكيموستات أو مصغرة ministats والتحقق من صحة استخدامها في تحديد وعلم وظائف الأعضاء في التجارب مع تطور الخميرة. هذا النهج ينطوي على نمو عشرات الكيموستات تشغيلها من واحدة المضاعفة مضخة تمعجية. يتم الاحتفاظ الثقافات في وحدة تخزين العامل 20 مل، والذي هو عملية لمجموعة متنوعة من التطبيقات. ويحدونا الأمل في أن زيادة الإنتاجية، وخفض النفقات، وتوفير بناء على تعليمات مفصلة العملية قد تؤدي أيضا إلى تحريك البحث والصناعية تطبيق هذا التصميم كمنصة عامة لوصف وظيفيا أعداد كبيرة من السلالات والأنواع، وعوامل النمو، وكذلك الوراثية المكتبات أو المخدرات.

Introduction

ديناميات تطور نمو الجراثيم والأحياء الدقيقة من الأمور الأساسية ل، والبيئة، وعلم الوراثة، والتكنولوجيا الحيوية. الأسلوب الأكثر شيوعا لزراعة الميكروبات في دفعة، حيث يتم تلقيح خلايا في منخفض الكثافة في المواد الغذائية الغنية مرق ونمت لالتشبع. على الرغم مباشرة لأداء باستخدام معيار المعدات المختبرية والثقافات دفعة تواجه بيئة الكيميائية تقلب وتغير تبعا لعلم وظائف الأعضاء الخلوية. وهذا يمكن أن البيئة غير متجانسة النمو يؤدي إلى آثار النمو والتوتر التي يمكن أن تحجب الثانوية الاختلافات الفسيولوجية خفية. يمكن تطور التجريبية عن طريق التحويل دفعة مسلسل الاختيار لمخاليط معقدة من النمو التدريجي مجموعات سكانية فرعية محددة، يعقد محاولات للاتصال التكيف مع الظروف انتقائية محددة. يمكن قياس الظواهر الكمية يكون من الصعب بسبب الضوضاء من عينة غير دقيقة وتوقيت الاختلاف في بعض السمات، مثل الوقت الضائع. الثقافات المستمر توفير بديلالنظام النمو حيث يمكن الخلايا المزروعة في بيئة بتكاثر متجانسة كيميائيا بمعدل نمو محدد للوصول إلى حالة فسيولوجية ثابتة. وبسبب هذه المزايا، والدراسات التجريبية والتطور توصيف الدولة الخلوية غالبا ما تستخدم في بيئة تسيطر عليها الثقافات مستمرة مثل ناظم كيميائي 14

التقدير من هذه المزايا أدت إلى عودة الاهتمام في الثقافات ناظم كيميائي. 15 قتيلا منذ بدء العمل بها في عام 1950، تم وضع نظم ناظم كيميائي 1،2 لتعمل على مجموعة متنوعة من المقاييس التي تتراوح بين لتر إلى لmicroliters ومجموعة متنوعة من التطبيقات 16 -19 هذه التصاميم المختلفة، والتي تتراوح من المفاعلات الحيوية المنتجة تجاريا للسفن glassblown إلى منصات مخصصة على microfluidics، حصة مبادئ التصميم العام. يحرك A غرفة الثقافة والهوائية (عادة فقاعات الهواء من خلال ذلك)، وبقي ما الميكروبات الواردة فيه متجانسةفرقت لي غرفة في جميع أنحاء الثقافة في جميع الأوقات. يضاف المتوسطة جديدة من تكوين مستمر ويعرف معدل بالإضافة إلى ذلك يتحكم معدل النمو ويؤثر على البيئة الكيميائية التي يمر بها الثقافة. تجاوز حجم يضع الثقافة في أنبوب النمو، ومن خلال هذا الفائض سيتم أخذ عينات ثقافة في نفس المعدل الذي يدخل الطازجة المتوسطة. وبهذه الطريقة الوصول بسرعة الثقافات دولة الفسيولوجية التي ثابتا عند العديد من العوامل البيولوجية تظل ثابتة. على الرغم من مزايا الكيموستات والتقارير المقدمة من هذه المنصات المختلفة في الأدب، وقد تم اعتماد واسع النطاق من قبل تقتصر الصعوبات في بناء وتشغيل هذه النظم، وارتفاع التكاليف المرتبطة الخيارات التجارية. وعلاوة على ذلك يمكن وصف كيفية صنع واستخدام هذه الأجهزة تكون مبهمة.

نقدم تصاميم وتعليمات لاستخدام مجموعة صغيرة من البصمة الكيموستات مصغرة مبنية من قطع متوفرة بتكلفة منخفضة. نحن OBServe المعلمات التجريبية متسقة للغاية والنتائج استنساخه عند مقارنة جهدنا لجهاز البيانات المبلغة عن الخميرة مثقف في حجم أكبر المفاعلات الحيوية التجارية. وهذا يشمل استنساخ لفيزيولوجيا الخلوية كما يتضح من خلال الوصول إلى حالة استقرار التوازن خلال 10-15 الأجيال والحصول على كثافة مماثلة في الثقافة التوازن. بالإضافة إلى ذلك، وأنماط التعبير الجيني بين تتفق ministats والتجارية منصة أكبر الحجم. استقرار معدل التخفيف، والكثافة البصرية استنساخ التعبير الجيني بين ثلاث ثقافات تكرار إظهار متانة برنامجنا. نعرض أيضا أن الطفرات تنشأ على نفس التكيف مماثلة الجداول الزمنية تطور التجريبية كما هو الحال مع الكيموستات حجم أكبر.

Protocol

استخدام تقنية معقمة مناسبة في جميع أنحاء البروتوكول.

1. تجميع قطع غيار للوإعداد مصفوفة Ministat

  1. من أجل جميع أجزاء.
  2. تنظيف أنابيب زجاجية. بمناسبة أنابيب في حجم 20 مل.
  3. جعل الجمعيات الفلين مع الهواء، ووسائل الإعلام، ومنافذ الصرف ووضعها في الجزء العلوي من أنابيب زجاجية الثقافة تنظيفها.
  4. إعداد غرف الرطوبة وترتيب جميع الأجزاء غير تعقيمها.
  5. جعل الهواء، النفايات السائلة، وأنابيب سائل الإعلام واستخدام أطوال أنابيب كافية وصلات متوافقة.
  6. ربط كل نوع من الأنابيب (الهواء، ووسائل الإعلام، والنفايات السائلة) إلى جمعيات الفلين والمرشحات واحباط وسائل الإعلام. السريع الاتصال إعدادهم للالأوتوكلاف
  7. إعداد الدامجانة زجاجة كبيرة للاستخدام في صنع العقيمة المتوسطة ناظم كيميائي.
  8. إعداد زجاجات أخذ العينات عن طريق إدراج ثقافة سدادة مطاطية لمدة حفرة مع التجهيزات المناسبة. احباط كل مرشح لإعدادهم للالأوتوكلاف.
  9. فاير تجميعها بدقة إلى مجموعة صواني الأوتوكلاف واحد أو أكثر والأوتوكلاف جميع أجزاء.
  10. وجعل وسائل الاعلام تصفية ناظم كيميائي في قوارير تعقيمها.

2. إعداد تجربة

  1. قارورة الماء ملء كل مع 700 مل O. 2 DDH
  2. وضع ministats تعقيمها في التدفئة مجموعة كتلة في درجة الحرارة المطلوبة.
  3. وضع شركات الطيران في مشعب 4-الميناء وتشغيل مضخة الهواء.
  4. توصيل خطوط مياه الصرف إلى جمع زجاجات 100 مل.
  5. إزالة احباط من نهاية الأنبوب وسائل الإعلام وسائل الإعلام والاتصال الدامجانة زجاجة كبيرة وسريعة تربط 2. الخيط طول كل أنبوب مضخة من خلال خرطوشة مضخة تمعجية وفوق عليها في مكانها. تشغيل المضخة وسائل الإعلام.
  6. السماح للغرف ملء. إيقاف تشغيل مضخة سائل الإعلام.
  7. رش الجمعيات الفلين مع الايثانول 70٪ وتطعيم الثقافات باستخدام حقنة. حفظ عينة من اللقاح باعتباره الأسهم المجمدة الجلسريناذا شئت. اسمحوا الثقافات تنمو لمدة 30 ساعة.
  8. ضبط ارتفاع الإبرة النفايات السائلة حتى يتم تعيين وحدة التخزين إلى 20 مل ثقافة مع تدفق الهواء إيقاف. قد يستغرق ذلك عدة تعديلات على مدار الساعة. عندما أنهى تحويل تدفق الهواء مرة أخرى.
  9. تحويل وسائل الإعلام على مضخة.
  10. إفراغ زجاجات أخذ العينات السائلة والتي تحتوي على وسائل الإعلام التي تم جمعها أثناء إعداد حجم ثقافة العمل، وتسجيل الوقت.
  11. الى شغل مقعد قياس الوقت من الصفر خطوط أنابيب مياه الصرف في جمع معقمة لمدة 15 دقيقة-2 ساعة (اعتمادا على حجم ما كنت ترغب في عينة لتحليل DNA). أيضا جعل الأسهم المجمدة الجلسرين لكل ثقافة في هذا الوقت اذا شئت.

3. القياسات اليومية

  1. كما هو الحال مع قياس الوقت صفرية الخاص بك، عينة على الجليد للموارد البشرية مين 2 15 (حسب الاقتضاء لتجربتك) على الجليد وتسجيل الوقت لأخذ عينات DNA والعينات المجمدة الأسهم.
  2. لعينات الحمض النووي الريبي جمع إما المجلد الصغيرةUME باستخدام حقنة وإبرة 22G 5 "من ثقافة أو نزع السدادة كل ministat لحصاد ثقافة بأكملها. يجب أن تؤخذ العينات بسرعة، جمعت من قبل الترشيح، وعلى الفور تجميد في النيتروجين السائل.
  3. قياس النفايات السائلة التي تم جمعها منذ آخر أخذ العينات لكل لقياس معدل ministat التخفيف. ضبط معدلات التخفيف إذا لزم الأمر من خلال تصحيح وضع مضخة أو ضبط غرامة على خطوط ضبط مضخة الفردية.
  4. استبدال خطوط الصرف في زجاجات فارغة جمع.
  5. تحديد خلية / مل وكذلك نقاط النهاية الأخرى ذات الاهتمام وجعل الأسهم الجلسرين المجمدة.

4. بعد تجربة تنظيف

  1. إخضاع جميع أنابيب في صواني منفصلة وشطف بشكل مفرط مع DDH 2 O. الجافة باستخدام أنابيب مضخة ماء.
  2. تنظيف الفلين مع جمعيات DDH 2 O واستخدام إدراج إبرة لتنظيف الإبر، والشفط والاستغناء المياه بدورها. مسح السطح الخارجي للالإبر والفلين لإزالة أيالمتبقية وسائل الإعلام.
  3. تكور تنظيف أنابيب الزجاج مع الماء والإيثانول، وإزالة الملوثات المادية مع 3 حتى Kimwipes وملقط.
  4. شطف وتجفيف جميع أنحاء مرة أخرى قبل الاستخدام.

Representative Results

وصف مجموعة ministat أعلاه وفي (الشكل 1A، B) تم استخدامه لثقافة فرداني سلالة المختبر ماتا من الخميرة في مهدها (S288c) تحت ظروف منظم للكبريتات كما هو موضح سابقا. اختبار فعالية 10 نحن لتطبيقات ناظم كيميائي المشتركة بما في ذلك تحديد وظائف الأعضاء التجريبية التطور. للتحقق من صحة ministats، كررنا عدة تجارب أجريت سابقا في fermentors الصناعية المحورة المراد استخدامها ناظم كيميائي. تم تشغيلها 10،20،21 ATR Sixfors fermentors في حجم 300 مل العمل، أكثر من عشر مرات حجم من ministats، ولها أوضاع مختلفة إلى حد كبير من تهوية الثقافة والانفعالات. حاولنا لتكرار الاستقرار المعدات وعلم وظائف الأعضاء ثابت الدولة، النتائج التجريبية التطور، وأنماط التعبير الجيني تم الحصول عليها مع هذه fermentors.

منذ توحيد معدل التخفيف والتهوية هي جوانب هامة من تصميم ناظم كيميائي، ونحن ليasured معدل التخفيف الفعلي عبر 32 ministats بعد 15 أجيال من النمو ووجد أن هدفا مع معدل التخفيف بنسبة 0.17 المجلد / ساعة (4-5 قطرات / دقيقة) ونحن تحقيقها معدل التخفيف متوسط ​​0.17208 مع انحراف معياري من 0،0075 عبر 32 مكررات. كان ضمن هذا النطاق تسامحنا نموذجية من الفرق + المجلد / ساعة / -0.01 من تحديد الأهداف، والتي تتجاوز وقد لوحظت تغييرات واسعة في التعبير الجيني. 22-23 عبر 4 ministats تم تحديد معدل التدفق الجوي ليكون 307.5 مل / دقيقة مع انحراف معياري 9.57 مل / دقيقة. هذا يشير إلى أن تدفق الهواء في غرف قوية ومقسمة بالتساوي بين الغرف 4 و هو قيمة مماثلة لتلك التي وصفها لتهوية صناعية في fermentors 20

لاحظنا سابقا التضخيم المتكررة للSUL1 عالية تقارب نقل الكبريت في أيون 8/8 تجارب تطور سلفات محدودة في الخميرة 10 ونظرا لاتساق النتائج في إطار ثيS حالة اخترنا كبريتات-على سبيل الحصر، اختبار قدرة نظامنا على. ومن العناصر اللازمة للثقافة ناظم كيميائي هو الحاجة للحفاظ على البيئة الكيميائية ثابتة. تقلبات في وفرة من التغييرات الحد المغذيات أو غيرها في البيئة يؤدي عادة إلى تغيير في عدد الخلايا في ثقافة معينة. قمنا بقياس الكثافة الضوئية كبديل لعدد الخلايا (الشكل 2A) واستنساخ المقاسة في 16 تكرار الثقافات، وإيجاد A600 متوسط ​​1.12 (~ 10 9 خلايا) بعد أجيال من النمو 15 ~ مع انحراف معياري من 0،057 وحدة، أو 5.1 ٪. على سبيل المقارنة، أظهرت القياسات المأخوذة من 4 الثقافات تكرار تزرع في fermentors الصناعية انحراف معياري قدره 2.5٪. كانت الخلايا الجيدة الخلط في غرفة النمو: قياسات OD وعدد خلايا مأخوذة من المسار النفايات السائلة كانت تعادل العينات المأخوذة مباشرة من الأنبوب الثقافة (المعطيات غير معروضة). هذه النتائج تثبت متانة برنامجنا علىد القدرة على الحفاظ على بيئة ثابتة الكيميائية داخل التسامح مماثلة لfermentor الصناعية.

ونتيجة لقراءات أكثر حساسية من علم وظائف الأعضاء، قارنا الجينوم على نطاق الجينات التعبير حالة مستقرة من ثقافات نمت تحت قيود كبريتات في ministats وفي fermentor الصناعية. وأظهرت التعبير الجيني في ministats درجة عالية من التشابه في ثلاث مكررات البيولوجية (2B الشكل). وانخفض تعبير عن 99٪ من الجينات لاحظنا سابقا أن لRNA المستمدة من اثنين الكيموستات Sixfors تكرار وشارك في تهجين إلى ميكروأري، ضمن نطاق 1.5 أضعاف، والسماح للاستخدام 1.5X باعتبارها قطع أهمية التجريبية 21 من التعبير الجيني اظهرت ثلاثة ministats تكرار، مقارنة البشرى، 99٪ من الجينات تقع ضمن نطاق 1،5-1،7 أضعاف، مقارنة مع نفس الفترة من fermentors الصناعية. تم تهجين العينات ثلاثة إلى صفائف الفرد ونسب البشرى تحسب بعد ذلك، وبالتالي فإن هذه VAوتشمل زهري بين مجموعة الضوضاء بالإضافة إلى الضوضاء البيولوجية، المبالغة في تقدير احتمال الاختلاف بين مكررات بالمقارنة مع النتائج المنشورة المشترك المهجنة. وأعرب عن الجينات تفاضلي 138 مكررات بالمقارنة> 1.5 أضعاف في جميع ministat ثلاثة إلى جمع عينة من ثقافة المتطابقة تزرع في fermentor الصناعية. وقد أثرى بشكل كبير الجينات انخفضت في التعبير في ministats لاستقلاب الحديد. قد تعكس هذا التوقيع تشكيل المعادن المختلفة لكل تكوين الجهاز: جهاز Sixfors يتضمن المكره المعادن والتجمع تهوية مغمورة في الثقافة، وقوارير وسائل الإعلام تستخدم في السابق مطلوب أيضا معدات معدنية. وتستخدم الإبر ministat الفولاذ المقاوم للصدأ، ولكن لا المكونات المعدنية الأخرى. وارتبطت الى حد كبير مع الجينات التعبير المتزايد مع أغشية الخلايا، على الرغم من الأهمية البيولوجية لهذا الارتباط غير واضح.

وأخيرا، نحن اختبار تجريبي unde التطورR هذه الشروط. بعد مرور 250 أجيال من كبريتات محدودة النمو، أظهرت 4/4 استنساخ اختبار من السكان المستقلة 4 تطور التضخيم من SUL1 والكشف عنها بواسطة التهجين الجينومي المقارن مجموعة (CGH، الشكل 2C). هذه النتيجة تتفق مع النتائج في الكيموستات حجم أكبر على فترات زمنية مماثلة 10

الشكل 1
تصميم الشكل B. 1. A. تصميم وترتيب مجموعة ministat. للغرفة الثقافة.

الشكل 2
الشكل 2. A. Experimental البيانات تظهر أن الثقافات وصول إلى التوازن في غضون عشرة أجيال من النمو (ن = 16). البيانات التعبير B. لمدة ثلاثة مكررات البيولوجية S1-3 عينات أثناء حالة مستقرة تحت قيود سلفات مقارنة مرجعية مشتركة نمت في ناظم كيميائي المتطابقة Sixfors سلفات محدودة جيم التكبير SUL1 تعافى في ministats بعد 250 أجيال من النمو في بيئة سلفات محدودة. تمت مقارنة الحمض النووي الجيني من كل استنساخ DNA تطورت لأجدادهم من قبل CGH كما هو موضح 21 متوسط ​​عدد النسخ تم حساب لكل منطقة تضخيمها ويظهر بجانب كل AMPLICON. تودع جميع البيانات في قاعدة البيانات ميكروأري GEO تحت GSE36691 الانضمام. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

Discussion

زراعة ناظم كيميائي في ministats، كما هو الحال مع أي ناظم كيميائي، يتطلب الاهتمام بالتفاصيل والاضطراب اطلاق النار. منذ التلوث هو مصدر قلق كبير في تجارب زراعة مستمرة، ونحن نتطلع في المعتاد من خلال المجهر للتلوث الجرثومي والفطري عند التلقيح وكل الأجيال خلال 50 تجارب التطور الطويل الأمد. حتى الآن نحن لم يلاحظ التلوث عبر التجارب تطور 96 من أكبر من 300 الأجيال (المعطيات غير معروضة). لاختبار التلوث المتبادل بين ministats واحتمال لاستعمار الميكروبات للغرفة الثقافة عن طريق خط الصرف ركضنا 16 ministats بحيث تم تلقيح كل ministat أخرى مع الخميرة وكما سبق لم تلقيح ما تبقى مع أي ثقافة. وأخذت عينات من الثقافات في وعاء النفايات البلدية، الذي أفرغ كل يوم. وبالتالي إذا كان من الممكن للملوثات للدخول من خلال خط الصرف كنا المرجح لاحظ أنه في هذه experimالأنف والحنجرة. خلال ثلاثة أسابيع، وأكبر من 100 أجيال من النمو في هذا النمط من الثقافات تلقيح الشطرنج وغير الملقحة، ونحن لم نلاحظ النمو في غير تلقيح أنابيب الثقافة ministat، مما يشير إلى أن التلوث من الخميرة أو الميكروبات الأخرى خارج من غير المرجح أن يحدث في تجارب اطر زمنية مماثلة.

على الرغم من تصميم ministats للعمل بطريقة مشابهة لالكيموستات التجارية، وطبيعة وحدات من هذا الترتيب يسمح لتعظيم الاستفادة لتناسب احتياجات المستخدمين والميزانية. يمكن للمضخة تحوي المستخدمة في هذا البروتوكول تحقيق معدلات التدفق بين 0،0186 المجلد / ساعة إلى 3.6 المجلد / ساعة (لا تظهر البيانات). ويمكن تحقيق زيادة الرقابة على أسعار التخفيف مع نماذج مضخة بديلة. لاحظ أن العملية في انخفاض معدلات التخفيف قد تتطلب استبدال إبرة قياس أعلى لتحقيق نفس التردد من تسليم الحبرية. حجم السكان هو أحد الاعتبارات الهامة لتصميم التجارب السليم للتطور.معدل تخفيف تركيز المغذيات القياسية والمستخدمة هنا يوفر الحجم السكاني الكبير نسبيا (~ 10 9 خلايا) من نفس النظام من حيث حجمها الدراسات المنشورة التطور. يمكن الإبقاء السكان 11 أكبر أو أصغر من خلال تغيير حجم العمل أو الحد من تركيز المغذيات. ويمكن أيضا زيادة إمدادات طفرة يمكن الحصول عليها من خلال العمل مع سلالات ذات معدلات مرتفعة الطفرة.

يمكن أيضا أن تتحسن أكثر من ministats دينا تصميم الحالي. ليمكن التكثيف المثال جمع على جدران أنبوب الثقافة وتقلص إلى حد كبير ويمكن باستخدام بالحمام المائي العميق، حاضنة، أو ثابت درجة حرارة الغرفة. على الرغم من تراكمها والنمو في الثقافات الجدار محدودة كبريتات يبدو أن نادر نسبيا، والتي تظهر تطور في التجارب 5/48 بنسبة 300 الأجيال (البيانات لا تظهر)، ومجموعة متنوعة من السطحي المتاحة التي قد تساعد في خفض أو تأخير هذه الصفة. في حالة التثاقل يتداخل مع الثقافة الكافيةويمكن تحقيق الاختلاط والاضطراب عن طريق الحد من زيادة عدد من الطرق وينقسم كل مضخة الهواء، أو عن طريق إضافة أجهزة التحريك. ويمكن أيضا تحقيقات إضافية لتركيز الغاز المذاب، ودرجة الحموضة، أو غيرها من المعالم إدراج، كما هو الحال في بعض التصاميم الأخرى 17

على الرغم من التعديلات المحتملة، وذلك باستخدام ministats كما هو موضح في هذا البروتوكول، لاحظنا المعلمات التجريبية متسقة للغاية والنتائج استنساخه عند مقارنة جهدنا لجهاز البيانات المبلغة عن الكيموستات حجم أكبر التجارية. هذا وشملت استنساخ لفيزيولوجيا الخلوية كما يتضح من خلال الوصول إلى حالة استقرار التوازن خلال 10-15 الأجيال (الشكل 2A) والحصول على كثافة مماثلة في الثقافة التوازن. كانت أنماط التعبير الجيني متسقة عبر ثلاث مكررات البيولوجية في ministats وبين ministats والتجارية الكبيرة الحجم منصات (الشكل 2B)، مع استثناء من الجينات استقلاب الحديد. هذه إكسبهي سبب الخلافات المرجح ression من التغييرات في محتوى المعادن من الجهازين أو تحسينات في نوعية المكونات وسائل الإعلام. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن ministats ستكون مفيدة للتجارب علم وظائف الأعضاء أو المنافسة التي تتطلب بيئة متناسقة.

لاختبار إذا كان تصميم ministat كافية للتطبيقات التجريبية تطور الثقافات تطورت ونحن تحت قيود سلفات ل 250 الأجيال وتستخدم لوصف CGH التضخيم في مكان الجريمة SUL1 - وهو السمة المميزة لتطور طويل الأمد في ظل هذه الظروف في الكيموستات أكبر حجم من 10 لاحظنا التضخيم من SUL1 في استنساخ من 4/4 تجارب تطور مستقل في وسائل الإعلام سلفات محدودة (الشكل 2C). ككل هذه البيانات تشير إلى أن ministats هي منصة القوية التي قد تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات التقليدية ناظم كيميائي. على الرغم من أننا أظهرت استخدامها في زراعة الخميرة في مهدها، ينبغي للministatsكما تكون متوافقة مع غيرها من الكائنات والتصاميم مماثلة في الواقع لقد استخدمت لزراعة البكتيريا والخميرة الأنواع الأخرى. 16،17،25 وعلاوة على ذلك حجم أصغر الثقافة وترتبط الحاجة انخفضت لوسائل الإعلام أن تقدم بديلا جذابا ministats للتجارب التي تتطلب باهظة الثمن أو غريبة الكواشف يمكن أن يكون كما هو الحال في شاشات كيميائية أو وراثية.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد إنشاء الفيديو من المنح المقدمة من المركز الوطني لبحوث الموارد (5P41RR011823-17) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (8 P41 GM103533-17) من المعاهد الوطنية للصحة. كما أيد هذا العمل من قبل NSF منحة 1120425. MJD هو ألين ريتا مؤسسة الباحث. ويدعم AWM في جزء من المعاهد الوطنية للصحة HG00035 T32. نشكر آنا صن شاين للمساعدة في تحسين البروتوكولات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نعترف سارة DiRienzi، باين سيليا، وSirr ايمي كمستخدمين في وقت مبكر من ministats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  2. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
  3. Daran-Lapujade, P., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
  4. ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
  5. Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  6. Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
  7. Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
  8. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  9. Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
  10. Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
  11. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  12. Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).
  13. Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. Genetics. 116, 349-358 (1987).
  14. Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
  15. Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture - making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
  16. Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
  17. Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. , (2012).
  18. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  19. Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  20. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
  21. Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
  22. Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107 (2006).
  23. Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4 (2007).
  24. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  25. Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).

Tags

علم الوراثة، العدد 72، البيولوجيا الجزيئية، علم الأحياء الدقيقة، الكيمياء الحيوية، علم الأحياء الخلوي، البروتوكولات الأساسية، وعلم الجينوم، Eukaryota والبكتيريا والظواهر البيولوجية، ظاهرة التمثيل الغذائي، الظواهر الوراثية والظواهر الميكروبيولوجية، وعلوم الحياة، ناظم كيميائي، وتطور، وتطور التجريبية، Ministat، الخميرة،
تصميم واستخدام المصفوفات ناظم كيميائي تعدد في الإرسال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E.… More

Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter