Summary
我们开发和验证一个小巧的微型恒化器阵列的构建低成本的现成的零件。生理和实验演化的结果是类似体积较大恒化。 ministat阵列提供了一个紧凑，价格低廉，使用的平台，为传统的恒化实验，功能基因组学和化学品筛选的应用。
Abstract
恒化器是连续培养系统，在该系统中，细胞生长在一个严格控制的，化学恒定的环境，培养密度被限制通过限制特定的营养素。1,2数据库中的恒化器高度的测量重现性好，可用于定量的表型，因为它们提供了恒定的增长率在稳定状态和环境。由于这些原因，恒已经成为有用的工具，通过分析基因表达的3-6和文化在稳定状态下的平衡等特点，判罚尺度的生理特性。7长期实验中恒化器可以突出显示特定的微生物种群的轨迹，采用在受控环境中的适应性进化过程中。事实上，恒已用于实验演化，因为他们的发明。一个共同的结果在进化实验的每一种生物的复制获得一个独特的剧目突变9-13多样性发现，有多少东西需要更大的吞吐量进化实验发现。
我们在座的设计和操作相对简单，成本低，阵列，微型的恒化或ministats，并验证其测定的生理和进化实验用酵母。这种方法需要几十恒化运行一个单一的复用蠕动泵的增长。将培养物保持在20毫升的工作体积，这是实用的各种应用。这是我们的希望，增加吞吐量，降低费用，并提供详细的建设和操作说明，也可能促使这种设计的一个通用的平台，为大量株，品种和生长参数，功能特征，以及遗传研究及工业应用药品库。
Introduction
动态的微生物的生长和演变的微生物学，生态学，遗传学和生物技术的基础。培养微生物的最常用的方法是在批处理，在细胞接种密度低成富含营养肉汤和生长至饱和。虽然直接执行使用标准的实验室设备，一批文化经历了波动的化学环境，并相应地改变细胞的生理。这种异构的生长环境可能导致在二次生长应力的影响，可以掩盖细微的生理差异。串行批量传输实验的进化，可以选择为增长阶段特定亚群的复杂混合物，尝试连接特定的选择性的条件下的适应化修改，复杂化。测量定量的表型可以是困难的，因为不精确的采样定时和噪音的功能，如延迟时间的变化。连续培养提供了另一种增长政权的细胞可以重复地在一个均匀的环境中培养在定义的增长率，达到生理稳定状态。由于这些优点，细胞状态的的实验演化和特性的研究常常利用这样的受控环境中连续培养恒化器。
1,2恒化器系统欣赏这些优势导致的复苏中恒化培养的兴趣。15自1950年推出以来，已发展到功能上的各种范围从升，微升各种应用。 -19这些不同的设计，其范围从商业化生产的生物反应器，glassblown船只定制的微流体平台，共享通用的设计原则。搅拌和充气培养室（通常是通过鼓入空气通过它）和其中所含的微生物保持均匀的LY在任何时候都分散在文化室。定义的组合物的新鲜培养基中不断加入的加入速率控制生长速率和影响的化学环境中所经历的文化。一个溢出设置在生长管的培养物体积，和对通过本溢出培养新鲜培养基进入以相同的速率将被采样。在这样的文化迅速达到生理稳定状态，许多生物参数保持不变。尽管恒化器和各种平台的报告文献中的优势，广泛采用已经被限制在这些系统的建设和运营，困难，成本高，与商业选择。此外，描述如何制造和使用这些设备可以是不透明的。
我们提出使用一个小巧的微型的恒化建从现成的零部件以较低的成本阵列的设计和说明。我们OBS大批量商业化生物反应器中培养的酵母报告的数据进行比较时，我们的设备，erve高度一致的实验参数和可重复性的结果。这包括可重复性的细胞生理学，通过在10-15代，并获得相似的文化平衡密度达到稳态均衡。此外，基因表达模式之间ministats和商业的大容量平台是一致的。我们的平台稳定性的稀释率，光密度和可重复性的基因表达之间的三次重复文化展示的鲁棒性。我们还表明，相同的自适应的突变发生过类似的实验演化的时间尺度为体积较大的恒化。
Protocol
使用适当的无菌技术，整个协议。
1。装配零件和准备Ministat阵列
- 订购的所有部件。
- 清洁玻璃试管。量在20毫升的标记管。
- 车型与空气的软木组件，媒体，和出水端口，并且将它们放置在清洁的玻璃培养管的顶部。
- 准备加湿室，并安排所有免蒸的部分。
- 空气，污水，媒体管使用足够的管道长度和兼容的耦合。
- 各类型的管道连接（空气，媒体和出水），软木组件和金属箔过滤器和媒体的快速连接，以备他们的反应釜。
- 准备一个用于在无菌的恒化器介质的瓶子。
- 准备通过合适的接头插入两孔的橡胶塞的文化取样瓶。箔每个过滤器，以备他们的反应釜。
- 网络连接吨组装阵列整齐地成一个或多个高压釜托盘和高压灭菌器的所有部分。
- 品牌和高压灭菌的细口大瓶筛选恒化媒体。
2。设置实验
- 填写每个水化瓶700毫升DDH 2 O
- 将加热块组的的蒸压ministats到放置在所需的温度。
- 航空公司放置到4端口的歧管，空气泵的开启。
- 连接出水线100毫升收集瓶。
- 去掉箔从媒体管和媒体的瓶子年底，连接两个快速连接。 Thread的每泵管长度并点击它们通过蠕动泵芯到位。打开介质上的泵。
- 让分庭填充。关闭的介质泵。
- 喷雾用70％乙醇和软木组件接种用注射器文化。作为冷冻甘油库存中保存样品的接种如果需要的话。让文化成长为30小时。
- 调整的高度的流出物针，直到培养音量被设定为与空气流关闭20毫升。超过一个小时的过程中，这可能需要多次调整。当完成时，将空气回流。
- 打开媒体的泵。
- 清空污水取样瓶，其中包含媒体时收集的工作文化的音量设置，并记录时间。
- 要采取零的时间测量地点的污水收集管进入无菌为15分钟，2小时（取决于你想品尝的量进行DNA分析）。也使一个的甘油冷冻股票为每一种文化在这个时候，如果需要的话。
3。每日测量
- 与零时间的测量，样品在冰上15分钟-2小时（视需要为您的实验）在冰上，并记录为DNA和冷冻股票样品取样的时间。
- 对于RNA样品收集的小卷UME使用注射器和22G 10“针从培养物或，开口每个ministat收获整个培养。样品必须迅速采取，通过过滤收集，并立即冷冻在液氮中。
- 测量污水收集自上次采样为每个ministat量化稀释率。如果需要，通过调整泵的设置或调整稀释率单泵线路调整的精细调整。
- 更换空的收集瓶的污水线。
- 量化个细胞/ ml，以及感兴趣的其他端点和使甘油冷冻库存。
4。实验后清理
- 在不同的托盘中，将所有的管道冲洗过度DDH 2 O干管，用一个水族馆泵。
- 清洁软木塞的DDH 2 O组件和使用针插入到清洁的针，水依次抽吸和分配。擦拭的外侧的针和软木，以消除任何剩余的媒体。
- 清洁用水和乙醇的玻璃管，和删除物理污染物与3焊球Kimwipes和镊子。
- 冲洗并擦干所有部件在使用前再次。
Representative Results
ministat阵列以上所述的和（ 图1A，B）中使用了文化单倍体MATa的实验室菌株出芽酵母（S288C）下干燥限制性条件如前所述10我们测试了常见的恒化器应用的功效，包括生理学测定和实验演化。为了验证ministats，我们重复修改先前在工业发酵罐进行的几个实验的恒化器使用。运行在一个300毫升的工作体积，超过10倍体积的ministats 10,20,21的 ATR Sixfors发酵罐中，并具有相当不同的模式文化曝气和搅拌。我们试图复制设备的稳定性，稳态的生理，实验演化的结果，以及获得这些发酵罐的基因表达模式。
由于贫化率和曝气均匀性的恒化设计的重要方面，我稀释率在32个ministats消化率的实际增长15代后，发现，与一个目标为0.17体积/小时（4-5滴/ min）稀释率，我们实现了平均稀释率0.0075，标准偏差为0.17208，在32个复制。在我们的典型公差为+ / -0.01卷/小时的区别，从目标设定，超越已经观察到大规模的基因表达变化。22-23这个范围跨越4个ministats的空气流量被确定为307.5毫升/分钟，9.57毫升/分钟的标准偏差。这表明，空气流入腔室的鲁棒性和均匀地划分的4个腔室之间，并是一个值，该值在工业发酵罐中进行曝气所述类似。20
我们以前观察到的高亲和力的硫离子转运SUL1经常扩增8/8硫酸盐在酵母中的有限的进化实验10由于下结果的一致性氏的病情，我们选择了硫酸的限制，以测试我们的系统的能力。恒化文化的一个必要元素，是需要维持一个稳定的化学环境。一个限制的营养物或其它环境中的变化中的丰度波动通常导致在一个给定的培养中的细胞数的变化。我们测得的光密度作为一个代理的细胞数（ 图2A）和测量的重现性在16个重复的文化，找到一个平均A600为1.12，标准偏差为0.057单位（〜10 9个细胞）后〜15代的增长，或5.1 ％。为了进行比较，来自4复制在工业发酵罐中生长的培养采取的测量表明，标准偏差为2.5％。细胞充分混合，在生长室中：OD和从流出物中的轨道上采取的细胞计数的测量分别相当于从培养管（数据未示出）直接抽取的样本。这些结果表明，我们的平台的鲁棒性研发能力，以保持恒定的化学环境内的工业发酵类似的耐受性。
更敏感的生理读出，我们比较了全基因组的稳定状态下基因表达的文化下生长的硫酸限制的ministats和在工业发酵。在ministats表现出高度的相似性的基因表达在三个生物复制（ 图2B）。我们前面所提到的，对于RNA来自两个复制Sixfors恒化器和共同的微阵列杂交，基因表达的99％下降内的1.5倍的范围内，允许使用作为一个经验意义截止1.5X 21基因表达相比成对，三个的复制ministats，表明下跌1.5-1.7倍范围内，99％的基因与从工业发酵罐的结果。杂交的单个阵列和成对的比率计算之后的三个样品，所以这些的VA梅毒包括阵列间噪声除了生物的噪音，有可能高估相比，到发布的，共同杂交的结果之间的变化复制。 > 1.5倍，在所有三个ministat重复从在工业发酵罐中生长的一个匹配的培养收集的试样相比，138个基因差异表达。大量丰富的铁代谢基因表达的ministats下降。此签名可能反映了不同的金属组成，每个设备配置：在Sixfors仪器包括一个金属叶轮和曝气装置，沉浸在文化，和以前使用的媒体大瓶也需要金属硬件。 ministat利用不锈钢针，但没有其他的金属部件。基因表达增加，主要与细胞膜，虽然该协会的生物学意义目前还不清楚。
最后，我们测试的实验演化undeR这些条件。经过250代硫酸盐增长有限，测试来自4个独立的不断发展种群中的4/4克隆表明扩增SUL1检测阵列比较基因组杂交（CGH， 图2C）。这样的结果是一致的量较大恒化的结果在同样的时间间隔。
图1。A.设计和安排的ministat阵列。B.培养室设计。
图2。A. ExperimeNTAL的数据显示，文化内达到平衡增长十代组（n = 16）。B.表达数据的三个生物复制S1-3硫酸限制在稳定状态下采样生长在一个匹配的的硫酸盐有限Sixfors恒化相比，一个共同的参考C. SUL1扩增在ministats回收的硫酸有限的环境中经过250代的增长。从每个演进的克隆的基因组DNA进行了比较祖先DNA CGH如所述21平均拷贝数计算每个扩增区域和旁边显示的每个扩增子。所有芯片的数据存放在GEO数据库下加入GSE36691。 点击此处查看大图。
Discussion
在的ministats，恒化培养与任何恒化，需要注意的细节和故障排除。由于污染是在连续培养实验的极大关注，我们通常希望通过显微镜在接种细菌和真菌污染，在长期的进化实验，每50代。到目前为止，我们还没有观察到在96进化实验的污染大于300代（数据未显示）。为了测试之间的交叉污染ministats和潜在的微生物殖民文化室的污水线，我们跑了16 ministats，每一个的其他ministat接种酵母以上，其余未接种任何一种文化，。进行采样培养成一个公共的废弃物容器中，被掏空的每一天。因此，如果这是可能的污染物进入通过出水线，我们可能会观察到，在这个experimENT。在三个星期，并大于100代的增长在此接种和未接种的培养，我们没有观察到生长在非接种ministat培养管中的西洋棋盘图案，这表明从外部酵母或其它微生物的污染是不太可能发生在实验期间同样的时间框架。
虽然ministats被设计成类似于商业恒化中的一种时尚，模块化的性质，这样的安排可以进行优化，以适应用户的需求和预算。此协议中使用的蠕动泵，可以实现0.0186体积/小时到3.6体积/小时（数据未示出）之间的流率。增加的贫化率的控制，可以实现替代型号的泵。需要注意的是在较低的稀释率的操作，可能需要更高的针头的取代液滴传递来达到同样的频率。人口规模是适当的进化实验设计的重要考虑因素。这里使用的标准品稀释率和养分含量提供了一个比较大的人口规模（〜10个细胞）公布的演化研究的幅度相同的顺序。可维持11更大或更小的人群，通过改变工作容积或限制养分含量。突变供应的增加也可以通过以下方式获得使用菌株突变率升高。
的ministats也可以改善我们目前的设计。例如可以收集冷凝培养管壁，并且可以大大减少通过使用深水浴，培养箱，或恒温室。虽然结块壁生长，在硫酸盐有限文化似乎是比较少见的，出现进化实验四十八分之五的300代（数据未示出），各种表面活性剂是可用的，可有助于减少或延迟此特征。在事件，结块的干扰提供足够的文化可以通过以下来实现减少的数量的方式被划分，每一个空气泵或通过增加一个搅拌装置混合，增加搅拌。溶解气体的浓度，pH值，或其他参数的其他探针也可以包括在内，如在一些其他的设计17
尽管有潜在的修改，使用所描述的ministats，在该协议中，我们观察到高度一致的实验参数和可重复的结果进行比较时，我们的设备报告的数据量较大的商业恒化。这包括达到稳态均衡在10-15代（ 图2A），并取得相似的文化平衡密度，细胞生理学的重现性。基因表达模式是一致的三个生物复制ministats之间ministats和大批量的商业平台（ 图2B），与铁代谢相关基因的异常。这些地契ression的差异可能是由两个设备或媒体成分的质量改善金属含量的变化。我们的数据表明，ministats生理学或竞争实验，需要一个稳定的环境将是有益的。
我们观察到测试，如果ministat设计是足够的实验演化的应用，我们发展文化硫酸限制下为250代，用CGH的特点放大在SUL1轨迹的-这些体积较大的恒化的条件下长期进化的一个标志。扩增SUL1从4/4独立进化实验在硫酸盐有限介质（ 图2C）的克隆。作为一个整体这些数据表明ministats的是一个强大的平台，各种传统的恒化应用可能是有用的。虽然我们展示了他们在培养芽殖酵母的使用，ministats应该也可以兼容其他生物和类似的设计实际上已被用于培养细菌和酵母菌种。16,17,25此外，较小的培养体积和对媒体的相关需求减少可能使ministats实验需要一个有吸引力的替代昂贵的异国情调的试剂可以是在化学或遗传的屏幕的情况下。
Disclosures
作者宣称，他们有没有利益冲突。
Acknowledgments
创建的视频支持国家研究资源中心（5P41RR011823-17）和美国国立卫生研究院的国家普通医学科学研究所（P41 GM103533-17）的资助。这项工作还得到了美国国家科学基金会授予1120425。 MJD是一个丽塔艾伦基金会的学者。 AWM是支持的，部分由美国国立卫生研究院T32 HG00035。 ，我们感谢安娜阳光为帮助提高协议。此外，我们确认萨拉DiRienzi，西莉亚PAYEN，艾米SIRR的早期用户的ministats。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3/32" x 7/32" silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50' coil pack) |
| 1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50' coil pack) |
| 1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50' coil pack) |
| Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
| Female luer, 1/8" barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
| Male luer lock, 1/8" barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
| Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
| Barbed Y connector, 1/8" ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
| Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
| Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
| Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
| Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
| Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
| PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
| 1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
| #8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
| 4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
| 55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
| Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
| Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Foam Silicone stopper size "2", pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
| 8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
| 10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
| Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
| Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
| Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
| Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
| 5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
| Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
| 205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
| 16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
| Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
| 6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
| Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
| Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| 47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
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